CN106916903B - 结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒 - Google Patents

结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN106916903B
CN106916903B CN201710322953.3A CN201710322953A CN106916903B CN 106916903 B CN106916903 B CN 106916903B CN 201710322953 A CN201710322953 A CN 201710322953A CN 106916903 B CN106916903 B CN 106916903B
Authority
CN
China
Prior art keywords
detection
probe
group
primer
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710322953.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106916903A (zh
Inventor
彭春梅
林志豪
张晓玮
邓可基
乐小炎
张嘉
李家导
陈观芝
林敏深
林若琳
石壮壮
罗园香
莫静嫣
李海茵
张新
王星
王法
吴彩虹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Supbio Bio Technology And Science Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Supbio Bio Technology And Science Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Supbio Bio Technology And Science Co ltd filed Critical Guangzhou Supbio Bio Technology And Science Co ltd
Priority to CN201710322953.3A priority Critical patent/CN106916903B/zh
Publication of CN106916903A publication Critical patent/CN106916903A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106916903B publication Critical patent/CN106916903B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及结核分枝杆菌的检测领域，更具体涉及一种结核分枝杆菌85B mRNA实时荧光RT‑PCR的检测引物组、探针组、试剂盒及检测方法。本发明提供的检测引物组包括SEQ ID NO：1‑4所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：7‑10所示的核苷酸序列；检测探针组包括SEQ ID NO：5‑6所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：11‑12所示的核苷酸序列。本发明由于引入了特异性扩增引物和荧光探针及与之相匹配的高效PCR热循环反应系统，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强。同时，本发明引入了更适合RNA扩增的Tris‑MOPS‑柠檬酸钠缓冲液以及Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶的双聚合酶的扩增方法，提高检测特异性的同时，可耐受更多的模版，提高了检测灵敏度及检测结果的稳定性。

Description

结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒。
背景技术
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的传染性疾病。2015年，世界范围内估计有1040万新发病例，约有150万人死于结核病，我国2014年的新发肺结核人数为93万，位居全球第三。结核病已成为全球因传染而死亡的主要疾病之一。然而，现时关于TB疫苗的研究暂无突破性的进展，因此，结核病的早期诊断、早期治疗、阻断结核分枝杆菌的传染就显得尤为重要。
结核病要想取得有效防控，这就要求我们必须要有一个有效的诊断方法和有效的治愈评估标准。痰涂片检查、分枝杆菌培养以及结核菌素试验等方法是目前常用的结核杆菌检测方法，但这些传统检测方法不利于快速准确地诊断肺结核以及疗效的评价，达不到早期诊断效果：痰涂片容易受到痰液标本质量影响，造成漏检；培养法虽然是金标准，但其报告周期长达8周，难以满足及时监测的要求；结核菌素试验则会受到患者免疫状态和接种卡介苗的影响，无法区分潜伏感染。因此，急需开发快速准确的检测方法。
随着现代科学技术的发展，相关的分子生物学技术也逐渐应用于结核病的快速诊断。1989年，Hance等最先将PCR技术应用于TB的检测，其突出特点是灵敏度高，与传统方法相比，其敏感性得到了显著的提高。此外，PCR检测的报告周期短，最快可在一天内完成，这在TB的早期诊断中有着独到的优势。
2000年，日本学者Notomi开发了一项可取代PCR的新DNA扩增检测技术——环介导等温扩增技术(LAMP技术)。中国专利申请201110246388公开了一种利用LAMP技术快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法。该方法根据结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌16SRNA的特异性设计了4条特异性引物，采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63～65℃对样品DNA模板进行扩增，通过加入SYBR Green I观察颜色变化来判断扩增与否。但该方法检测的仍然是结核分枝杆菌的特异性DNA序列。
这些基于DNA的体外扩增检测方法存在同样的问题：DNA是稳定的核酸分子，其半衰期长，基于DNA的体外扩增，其模板既可以来自于活菌也可来自死菌。因此不能作为结核分枝杆菌活菌的诊断。
在细菌死亡降解的过程中，RNA会伴随细菌死亡而降解消失，在死菌中不易被检测到。一般原核生物的信使RNA(mRNA)半衰期很短，仅存在于有代谢活性的菌中，它可以作为活动性结核的重要判断标志。有文章指出，TB DNA的灵敏度为96％，而TB RNA的灵敏度可达100％。实时荧光PCR(RT-PCR)比普通PCR进行定量分析时灵敏度更高，定量更精确，目前已经广泛应用于临床医学检测。
中国专利申请201410036985公开了一种用于检测结核分枝杆菌的引物和探针及其应用，提供了用于检测结核分枝杆菌mRNA的组合物，所述组合物由一个引物对和一个探针组成。实时荧光定量PCR相较于普通PCR具有更高的灵敏度，然而其特异性相对一般，且容易因样本中抑制物的抑制作用，影响检测结果的稳定性。另外，因mRNA不易提取，如采用Trizol加玻璃珠的提取方法，利用该专利申请公布的方法，仅可检测到每毫升15000细菌数的结核分枝杆菌标本，其检出限较高，难以适应临床需要。
因此，亟待开发一种兼具灵敏度、特异性、稳定性，检出限更低的快速、高效检测活性结核分枝杆菌的方法。85B蛋白是结核杆菌的主要分泌性蛋白抗原，其编码的mRNA分子在活性结核分枝杆菌中含量较大。开发一种以结核分枝杆菌特异的85B mRNA为检测靶标，检出率高、灵敏度高、特异性高、稳定性好、检出限更低、可分辨活菌和死菌的结核分枝杆菌RNA检测试剂盒具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于结核分枝杆菌检测的试剂盒及方法，使其可识别活菌和死菌，且灵敏度、特异性、稳定性更高、检出限更低。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是提供一种结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒，实现对结核分枝杆菌85B mRNA的快速检测，应用极为方便。
一个方面，本发明提供了一种检测结核分枝杆菌85B mRNA的检测引物组和检测探针组；
所述的检测引物组和检测探针组是：检测引物组1和检测探针组1；或检测引物组2和检测探针组2。
所述的检测引物组1包括以下4条结核分枝杆菌85B mRNA特异性引物序列：
引物TB 85B mRNA-F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：5’-TTC ACA GCG GCACAA CAA TAT GTC-3’；
引物TB 85B mRNA-R1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：5’-GAC TGT GCG TTCCTG ATC GAG-3’；
引物TB 85B mRNA-F2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：5’-CGG TTT ATT TCGACA GCG AAG AC-3’；
引物TB 85B mRNA-R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：5’-AAC TGG TTT CGCACC GTG TC-3’；
所述的检测探针组1选自探针TB 85B mRNA-P1和探针TB 85B mRNA-P2中的至少一种；
所述的探针TB 85B mRNA-P1的序列为SEQ ID NO：5所示：5’-AAC CAT GCA ATGATG CTC GT-3’；所述的探针TB 85B mRNA-P2的核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示：5’-CAATGA TGC TCG TGC AAC ACC T-3’；所述的探针TB 85B mRNA-P1和探针TB 85B mRNA-P2的核苷酸序列的5’端连接荧光基团FAM，3’端连接猝灭基团BHQ1。
所述的检测引物组2包括以下4条结核分枝杆菌85B mRNA特异性引物序列：
引物TB 85B mRNA-F1’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示：5’-CAC AGC GGC ACAACA ATA TGT CG-3’；
引物TB 85B mRNA-R1’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示：5’-ACT GTG CGT TCCTGA TCGAGC-3’；
引物TB 85B mRNA-F2’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示：5’-TTT ACA GCC AAGCGG TCG AG-3’；
引物TB 85B mRNA-R2’，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示：5’-CGC CGG GAA TTTCGA CAC GA-3’；
所述的检测探针组2选自探针TB 85B mRNA-P1’和探针TB 85B mRNA-P2’中的至少一种；
所述的探针TB 85B mRNA-P1’的序列为SEQ ID NO：11所示：5’-ATG ATG CTC GTGCAA CAC CTG C-3’；所述的探针TB 85B mRNA–P2’的核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示：5’-ACG AAA CCA TGC AAT GAT GCT CGT GC-3’；所述的探针TB 85B mRNA-P1’和探针TB 85BmRNA-P2’核苷酸序列的5’端连接荧光基团FAM，3’端连接猝灭基团BHQ1。
另一个方面，本发明提供了一种检测结核分枝杆菌85B mRNA的试剂盒。
所述的试剂盒包括本发明所述的检测引物组和检测探针组。
所述的试剂盒还包括酶系、PCR反应试剂、阳性质控品和阴性质控品。
所述的酶系包括Tfl DNA聚合酶、MMLV逆转录酶和Stoffel片段；
所述的PCR反应试剂包括：pH 8.3～8.5的Tris-H2SO4，pH7.9的3-(N-吗啉基)丙磺酸，柠檬酸钠，(NH4)2SO4，MgSO4，聚氧乙烯月桂醚，乙酰化牛血清白蛋白和dNTP；
所述的阳性质控品为：以结核分枝杆菌TB的基因组DNA为PCR模板，利用检测引物组1或检测引物组2扩增出的结核分枝杆菌TB的85B mRNA基因组核酸片段，根据常规基因工程方法合成的MS2假病毒；
所述的阴性质控品为焦碳酸二乙酯(DEPC)处理H2O。
再一个方面，本发明提供了一种检测结核分枝杆菌的方法，所述的方法指利用本发明所述的结核分枝杆菌85B mRNA的检测引物组和检测探针组，使用实时荧光RT-PCR技术，检测结核分枝杆菌85B mRNA；
所述的检测方法包括以下步骤：
1、样本采集：采集痰液样品，取约1～2mL，置于50mL洁净离心管中；
2、从痰液样品中提取RNA：
A、痰液样品处理：在步骤1采集的痰液样品中加入2～3倍体积4％的NaOH溶液，涡旋振荡至痰液呈液体状(无明显固状物)；加入PBS至50mL，4000rpm离心20min；弃上清，加入2mL PBS洗涤沉淀，吸取1mL为待测样品；
B、提取RNA：提取步骤2-A得到的待测样品中的总RNA；
3、实时荧光RT-PCR反应：
以步骤(2)提取的待测痰液样品的总RNA为模板，利用本发明所述的一种检测结核分枝杆菌85B mRNA的检测引物组和检测探针组或检测试剂盒，配置实时荧光RT-PCR反应体系，设置实时荧光RT-PCR热循环程序，进行实时荧光RT-PCR扩增；
4、结果分析和判定：
阳性：检测样本Ct值小于等于38.0，且曲线有明显的指数增长期；可疑：检测样本Ct值大于38.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值小于40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40。
所述的检测方法中，所述的实时荧光RT-PCR反应体系包括：
Figure BDA0001290364540000071
进一步地，所述的实时荧光RT-PCR反应体系的PCR反应液包括：pH 8.3～8.5的Tris-H2SO4 40～65mM、pH7.9的3-(N-吗啉基)丙磺酸10～30mM、柠檬酸钠2.2～3.8mM、(NH4)2SO4 10～22mM、MgSO4 4～9mM、质量百分比为0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.01％～0.1％的乙酰化牛血清白蛋白、dNTP 0.23～0.52mM、检测引物组550～650nM和检测探针组100～250nM；
进一步地，所述的实时荧光RT-PCR反应体系的酶混合物包括：Tfl DNA聚合酶、MMLV DNA聚合酶和Stoffel片段；其中，Tfl DNA聚合酶和MMLV DNA聚合酶的体积比为4：1～1：1，Tfl DNA聚合酶和Stoffel片段等体积加入。
所述的检测方法中，所述的实时荧光RT-PCR反应热循环程序为：
第一步：45℃10～20分钟，94～96℃8～12分钟；第二步：94～95℃15～30秒，62～68℃15～75秒，68～72℃32～40秒，3～9个循环；第三步：93～95℃15～20秒，62℃15～30秒，68～72℃20秒，12个循环；第四步：93～95℃15秒，58～62℃30～60秒，40个循环。
在一个优选的实施方案中，所述的实时荧光RT-PCR反应体系的PCR反应液包括：pH8.3的Tris-H2SO4 40mM、pH7.9的3-(N-吗啉基)丙磺酸10mM、柠檬酸钠2.2mM、(NH4)2SO410mM、MgSO4 4mM、质量百分比为0.10％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.01％的乙酰化牛血清白蛋白、dNTP 0.23mM、检测引物组550nM和检测探针组100nM；
在另一个优选的实施方案中，所述的实时荧光RT-PCR反应体系的PCR反应液包括：pH 8.5的Tris-H2SO4 65mM、pH7.9的3-(N-吗啉基)丙磺酸30mM、柠檬酸钠3.8mM、(NH4)2SO422mM、MgSO4 9mM、质量百分比为0.5％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.1％的乙酰化牛血清白蛋白、dNTP 0.52mM、检测引物组650nM和检测探针组250nM；
在另一个优选的实施方案中，所述的实时荧光RT-PCR反应体系的PCR反应液包括：pH8.5的Tris-H2SO4 48mM、pH7.9的3-(N-吗啉基)丙磺酸18mM、柠檬酸钠3mM、(NH4)2SO420mM、MgSO4 7mM、Brij-35质量百分比为0.10％、乙酰化牛血清白蛋白质量体积百分比为0.01％、dNTP 0.35mM、检测引物组600nM、检测探针组200nM；
在一个优选的实施方案中，所述的实时荧光RT-PCR反应体系的酶混合物包括：0.4μl的Tfl DNA聚合酶、0.1μl的MMLV DNA聚合酶和0.4μl的Stoffel片段；
在另一个优选的实施方案中，所述的实时荧光RT-PCR反应体系的酶混合物包括：1μl的Tfl DNA聚合酶、0.5μl的MMLV DNA聚合酶和1μl的Stoffel片段；
在一个优选的实施方案中，所述的实时荧光RT-PCR反应热循环程序为：第一步：45℃10分钟，94℃8分钟；第二步：94℃15秒，62℃15秒，68℃32秒，3个循环；第三步：93℃15秒，62℃15秒，68℃20秒，12个循环；第四步：93℃15秒，58℃30秒，40个循环；
在另一个优选的实施方案中，所述的实时荧光RT-PCR反应热循环程序为：第一步：45℃20分钟，96℃12分钟；第二步：95℃30秒，68℃75秒，72℃40秒，9个循环；第三步：95℃20秒，62℃30秒，72℃20秒，12个循环；第四步：95℃15秒，62℃60秒，40个循环；
在另一个优选的实施方案中，所述的实时荧光RT-PCR反应热循环程序为：第一步：42℃15分钟，95℃10分钟；第二步：95℃15秒，64℃15秒，72℃32秒，循环5次；第三步：95℃15秒，62℃15秒，72℃20秒，循环12次；第四步：95℃15秒，60℃45秒，循环40次。
本发明提供了一种结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒，能够实现对结核分枝杆菌中的85B mRNA的快速检测，特异性强，灵敏度高，稳定性好，应用极为方便。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明提供了高灵敏和高特异的RT PCR检测引物组和检测探针，用以特异性地扩增结核分枝杆菌中的85B mRNA，而不会将结核分枝杆菌的其他转录本扩增出来。与常规RT-PCR相比，本发明在RT-PCR扩增时，使用了2对PCR特异引物，可同时完成巢氏扩增和RT-PCR，克服了常规RT-PCR特异性不足的缺点，四条引物之间的扩增竞争性小，扩增平衡性比目前常用的引物高。
2、本发明基于上述高灵敏和高特异的检测引物组和检测探针，建立了一套相匹配的高效PCR热循环反应系统，实现了逆转录PCR、巢氏扩增和实时荧光定PCR在一管中同时进行。操作更加简便，避免了多步进行时易造成污染的缺点，很大程度地提高结核分枝杆菌85B mRNA的检出率。
3、本发明引入了更适合RNA扩增的Tris-3-(N-吗啉基)丙磺酸-柠檬酸钠缓冲液替代常规的Tris-HCl缓冲液，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，避免了普通RT-PCR方法特异性不高，以及无法对低浓度模版进行定量的缺点。
4、本发明还引入了Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶的双聚合酶的扩增方法，提高了检测的特异性，同时抗样本抑制物的抑制作用的能力增强，使得本试剂盒可耐受更多的模版，提高了检测灵敏度及检测结果的稳定性。其中Stoffel片段为去除5’-3’外切酶活性结构域的Taq DNA聚合酶，去除5’-3’外切酶活性的同时，恢复了少量3’-5’外切酶的校正活性，弥补了Tfl DNA聚合酶特异性不足的缺陷。而Tfl DNA聚合酶则提供切除Taqman探针的5’-3’外切酶活性。另一方面，Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶耐抑制剂能力都较强，使得根据本发明构建的荧光RT-PCR试剂盒中可以加入更多的模版，提升灵敏度。
5、本发明可检测到1×103个菌/mL标准品中的结核分枝杆菌85B mRNA，灵敏度高，检出限更低，适用于临床。
综上所述，本发明提供了一种兼具灵敏度、特异性、稳定性，且检出限更低的结核分枝杆菌85B mRNA实时荧光PCR检测方法及试剂盒，能够实现对结核分枝杆菌85B mRNA的快速检测，应用极为方便。由于引入了特异性扩增引物和荧光探针及与之相匹配的高效PCR热循环反应系统，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，避免了其他检测方法特异性不高的缺点。另外，由于引入了更适合RNA扩增的Tris-3-(N-吗啉基)丙磺酸-柠檬酸钠缓冲液，从而避免了普通RT-PCR方法特异性不高、无法对低浓度模版进行定量的缺点。另外，本发明还引入了Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶的双聚合酶的扩增方法，提高检测特异性的同时，抗样本抑制物的抑制作用的能力增强，可耐受更多的模版，提高了检测灵敏度及检测结果的稳定性。
基于上述优点，本发明的试剂盒适合在各级疾控单位和医院进行推广，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为对比例1的实时荧光RT-PCR扩增结果图。扩增曲线1～5分别代表第1～5组实时荧光RT-PCR的扩增结果。
图2为实验例1的实时荧光RT-PCR扩增结果图。从左到右依次为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103个菌/mL的痰液样品的检测结果。
具体实施方式
实施例1用于检测结核分枝杆菌85B mRNA的试剂盒
该试剂盒包括：结核分枝杆菌85B mRNA的检测引物组和检测探针；
其中，检测引物组包括：引物TB 85B mRNA-F1：5’-TTC ACA GCG GCA CAA CAA TATGTC-3’；引物TB 85B mRNA-R1：5’-GAC TGT GCG TTC CTG ATC GAG-3’；引物TB 85B mRNA-F2：5’-CGG TTT ATT TCG ACA GCG AAG AC-3’；引物TB 85B mRNA-R2：5’-AAC TGG TTT CGCACC GTG TC-3’。
检测探针组包括：探针TB 85B mRNA-P1：5’-AAC CAT GCA ATG ATG CTC GT-3’；探针TB 85B mRNA-P2：5’-CAA TGA TGC TCG TGC AAC ACC T-3’；探针TB 85B mRNA-P1和探针TB 85B mRNA-P2的核苷酸序列的5’端连接荧光基团FAM，3’端连接猝灭基团BHQ1。
实施例2用于检测结核分枝杆菌85B mRNA的试剂盒
该试剂盒包括：结核分枝杆菌85B mRNA的检测引物组和检测探针；
其中，检测引物组包括：引物TB 85B mRNA-F1’：5’-CAC AGC GGC ACA ACA ATATGT CG-3’；引物TB 85B mRNA-R1’：5’-ACT GTG CGT TCC TGA TCG AGC-3’；引物TB 85BmRNA-F2’：5’-TTT ACA GCC AAG CGG TCG AG-3’；引物TB 85B mRNA-R2’：5’-CGC CGG GAATTT CGA CAC GA -3’。
检测探针组包括：探针TB 85B mRNA-P1’：5’ATG ATG CTC GTG CAA CAC CTG C-3’；探针TB 85B mRNA-P2’：5’-ACG AAA CCA TGC AAT GAT GCT CGT GC-3’；探针TB 85BmRNA-P1’和探针TB 85B mRNA-P2’核苷酸序列的5’端连接荧光基团FAM，3’端连接猝灭基团BHQ1。
实施例3用于检测结核分枝杆菌85B mRNA的试剂盒
该试剂盒包括：
(1)实施例1中的检测引物组和检测探针；
(2)酶系：Tfl DNA聚合酶、MMLV DNA聚合酶和Stoffel片段；
(3)PCR反应试剂：pH8.5的Tris-H2SO4，pH7.9的3-(N-吗啉基)丙磺酸，柠檬酸钠，(NH4)2SO4，MgSO4，Brij-35，乙酰化牛血清白蛋白和dNTP；
(4)阳性质控品：以结核分枝杆菌TB的基因组DNA为PCR模板，利用检测引物组1或检测引物组2扩增出的结核分枝杆菌TB的85B mRNA基因组核酸片段，根据常规基因工程方法合成的MS2假病毒；
(5)阴性质控品：DEPC处理H2O。
实施例4
结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测方法
1、样本采集：采集痰液样品，取约1～2mL，置于50mL洁净离心管中；
2、从痰液样品中提取RNA：
A、痰液样品处理：在步骤1采集的痰液样品中加入2～3倍体积4％的NaOH溶液，涡旋振荡至痰液呈液体状(无明显固状物)；加入PBS至50mL，4000rpm离心20min；弃上清，加入2mL PBS洗涤沉淀，吸取1mL为待测样品；
B、提取RNA：采用RNA提取试剂盒(购自天根生化公司的培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒，货号DP430)提取步骤2A得到的待测样品中的总RNA；
3、检测试剂盒：采用实施例3提供的试剂盒。
4、检测方法：
A、配制实时荧光RT-PCR反应体系的PCR反应液；
PCR反应液包括：pH8.5的Tris-H2SO4 48mM、pH7.9的3-(N-吗啉基)丙磺酸18mM、柠檬酸钠3mM、(NH4)2SO4 20mM、MgSO4 7mM、Brij-35质量百分比为0.10％、乙酰化牛血清白蛋白质量体积百分比为0.01％、dNTP 0.35mM、引物TB 85B mRNA-F1 200nM、引物TB 85BmRNA-R1 200nM、引物TB 85B mRNA-F2 100nM、引物TB 85B mRNA-R2 100nM、探针TB 85BmRNA-P1 100nM和探针TB 85B mRNA-P2 100nM。
B、配制实时荧光RT-PCR反应体系：
实时荧光RT-PCR反应体系为：
Figure BDA0001290364540000151
其中实时荧光RT-PCR反应体系的酶混合物包括：1μl的Tfl DNA聚合酶(美国ABI公司，2U/μl)、0.5μl的MMLV DNA聚合酶(深圳菲鹏生物，200U/μl)和1μl的Stoffel片段(Cetus公司，5U/μl)；
实时荧光RT-PCR反应体系的模板为：步骤2-B提取的总RNA。
C、实时荧光RT-PCR反应：
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类(设置85B mRNA的报告基团为FAM，淬灭基团选择none)，设定循环条件：
ABI 7500荧光PCR仪循环条件为：第一步：42℃15分钟，95℃10分钟；第二步：95℃15秒，64℃15秒，72℃32秒，循环5次；第三步：95℃15秒，62℃15秒，72℃20秒，循环12次；第四步：95℃15秒，60℃45秒，循环40次；60℃时收集荧光。
D、结果分析和判定：
结果分析条件设定：
设置基线：使用ABI 7500荧光PCR仪软件默认设置，可根据具体情况对基线适当调整；设置阈值：以阈值线刚超过阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点。
结果判断：
阳性：检测样本Ct值小于等于38.0，且曲线有明显的指数增长期；可疑：检测样本Ct值大于38.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值小于40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40。
本实施例扩增曲线良好，扩增Ct值为16.0，检测灵敏度高，特异性强。
对比例1
结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测方法
样本采集、从痰液样品中提取RNA及检测试剂盒同实施例4。
检测方法：
1、分别配制实时荧光RT-PCR反应体系的PCR反应液的实验组和对照组：
实时荧光RT-PCR反应体系的PCR反应液的实验组包括：pH8.5的Tris-H2SO4 48mM、pH7.9的3-(N-吗啉基)丙磺酸18mM、柠檬酸钠3mM、(NH4)2SO4 20mM、MgSO4 7mM、Brij-35质量百分比为0.10％、乙酰化牛血清白蛋白质量体积百分比为0.01％、dNTP 0.35mM、引物TB85B mRNA-F1 200nM、引物TB 85B mRNA-R1 200nM、引物TB 85B mRNA-F2 100nM、引物TB85B mRNA-R2 100nM、探针TB 85B mRNA-P1 100nM和探针TB 85B mRNA-P2 100nM；
实时荧光RT-PCR反应体系的PCR反应液的对照组包括：pH8.5的Tris-HCl 66mM、(NH4)2SO4 20mM、MgSO4 5mM、Brij-35质量百分比为0.10％、乙酰化牛血清白蛋白质量体积百分比为0.01％、dNTP 0.35mM、引物TB 85B mRNA-F1 200nM、引物TB 85B mRNA-R1 200nM、引物TB 85B mRNA-F2 100nM、引物TB 85B mRNA-R2 100nM、探针TB 85B mRNA-P1 100nM和探针TB 85B mRNA-P2 100nM；
2、分别配制配制实时荧光RT-PCR反应体系的酶混合物的实验组和对照组：
实时荧光RT-PCR反应体系的酶混合物的实验组包括：1μl的Tfl DNA聚合酶(美国ABI公司，2U/μl)、0.5μl的MMLV DNA聚合酶(深圳菲鹏生物，200U/μl)和1μl的Stoffel片段(Cetus公司，5U/μl)；
实时荧光RT-PCR反应体系的酶混合物的对照组包括：2μl的Taq DNA聚合酶(NEB公司，5U/μl)和0.5μl的MMLV DNA聚合酶(深圳菲鹏生物，200U/μl)。
3、配制实时荧光RT-PCR反应体系：
利用步骤1配制的实时荧光RT-PCR反应体系的PCR反应液的实验组和对照组、步骤2配制的实时荧光RT-PCR反应体系的酶混合物的实验组和对照组，配制5组实时荧光RT-PCR反应体系，分别为：
Figure BDA0001290364540000181
Figure BDA0001290364540000191
所述的模板同实施例4。
4、实时荧光RT-PCR反应及结果分析和判定同实施例4，5组实时荧光RT-PCR反应结果记录如下：
组号 扩增结果(Ct值)
1 16.40
2 无扩增
3 19.35
4 无扩增
5 20.23
扩增曲线如图1所示，扩增曲线1～5分别代表第1～5组实时荧光PCR反应结果。由上表及图1分析可知，当样本量5μl时，使用Taq DNA聚合酶和MMLV DNA聚合酶即可以正常扩增(第5组)；由第2组和第4组结果可知，当样本量增加到27.5μl时，仅使用Taq DNA聚合酶和MMLV DNA聚合酶无法扩增；而由第1组和第3组结果可知，当样本量增加到27.5μl时，使用Stoffel片段、Tfl DNA聚合酶以及MMLV DNA聚合酶，可以正常扩增。
另外，由第1组和第3组结果可知，相比传统的Tris-HCl作为缓冲液的实时荧光RT-PCR反应液，使用Tris-H2SO4、3-(N-吗啉基)丙磺酸、柠檬酸钠组成的缓冲液，灵敏度更高。说明利用本发明所述的结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测试剂盒进行检测，检测特异性更高，可耐受的模板量更多，灵敏度更高，检测结果更稳定。
实验例1用于检测结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光PCR试剂盒和检测方法的敏感性分析
采集自广州市胸科医院的痰液样品，取痰液培养后，稀释至107、106、105、104、103个菌/mL(使用麦氏比浊法测定)。对测定好浓度的样本，按照实施例4所述的方法提取RNA，及进行实时荧光RT-PCR反应。
扩增曲线见图2，从左到右依次为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103个菌/mL的痰液样品的扩增结果。结果分析可知，本发明所述检测结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光PCR试剂盒和检测方法可检测到低至1×103个菌/mL的痰液样品中的结核分枝杆菌85BmRNA，检出限更低，灵敏度高，适用于临床。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州海力特生物科技有限公司
<120> 结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒
<130> 20170413
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttcacagcgg cacaacaata tgtc 24
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gactgtgcgt tcctgatcga g 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggtttattt cgacagcgaa gac 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aactggtttc gcaccgtgtc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaccatgcaa tgatgctcgt 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caatgatgct cgtgcaacac ct 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cacagcggca caacaatatg tcg 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
actgtgcgtt cctgatcgag c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tttacagcca agcggtcgag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgccgggaat ttcgacacga 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atgatgctcg tgcaacacct gc 22
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acgaaaccat gcaatgatgc tcgtgc 26

Claims (5)

1.一种用于检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括检测结核分枝杆菌的检测引物组和检测探针组；
所述的检测引物组和检测探针组是：检测引物组1和检测探针组1；或检测引物组2和检测探针组2；
所述的检测引物组1包括以下4条特异性引物序列：
引物F1，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；引物R1，其序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；引物F2：其序列如SEQ ID NO：3 所示的核苷酸序列；引物R2：其序列为SEQID NO：4所示的核苷酸序列；
所述的检测探针组1选自探针P1和探针P2中的至少一种；
所述的探针P1的序列为SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列或其互补序列；所述的探针P2的序列为SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列或其互补序列；所述的探针P1和探针P2的核苷酸序列的5’端连接荧光基团FAM，3’端连接猝灭基团BHQ1；
所述的检测引物组2包括以下4条特异性引物序列：引物F1’：其序列为 SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；引物R1’：其序列为SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；引物F2’：其核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；引物R2’：其序列为SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；
所述的检测探针组2选自探针P1’和探针P2’中的至少一种；
所述的探针P1’的序列为SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列或其互补序列；所述的探针P2’的核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列或其互补序列；所述的探针P1’和探针P2’核苷酸序列的5’端连接荧光基团FAM，3’端连接猝灭基团BHQ1；
所述的试剂盒还包括：酶系和PCR反应试剂；
所述的酶系包括Tfl DNA聚合酶、MMLV逆转录酶和Stoffel片段；
所述的PCR反应试剂包括：pH 8.3～8.5的Tris-H2SO4 40～65mM、pH7.9 的3-(N-吗啉基)丙磺酸10～30mM、柠檬酸钠2.2～3.8mM、(NH4)2SO4 10～22mM、MgSO4 4～9mM、质量百分比为0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.01％～0.1％的乙酰化牛血清白蛋白、dNTP 0.23～0.52mM。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括：阳性质控品和阴性质控品。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的阳性质控品为：以结核分枝杆菌TB的基因组DNA为PCR模板，利用检测引物组扩增出的结核分枝杆菌TB的基因组核酸片段，根据常规基因工程方法合成的MS2假病毒；所述的阴性质控品为DEPC处理H2O。
4.一种不以疾病诊断为目的的结核分枝杆菌实时荧光RT-PCR检测方法，所述的实时荧光RT-PCR检测方法包括以下步骤：
(1)样本采集：采集痰液样品；
(2)从痰液样品中提取RNA：
A、痰样本处理：在步骤(1)采集的痰液样品中加入2～3倍体积4％的NaOH溶液，涡旋振荡至痰液呈液体状；加入PBS至50mL，4000rpm离心20min；弃上清，加入2mL PBS洗涤沉淀，吸取1mL为待测样品；
B、提取RNA：提取步骤(2)-A得到的待测样品中的总RNA；
(3)实时荧光定量PCR：
以步骤(2)-B提取的待测样品的总RNA为模板，利用权利要求1所述的检测引物组、检测探针组、酶系和PCR反应试剂，配置RT-PCR反应体系，设置RT-PCR热循环程序，进行RT-PCR扩增；
所述的RT-PCR反应体系包括：
Figure 340328DEST_PATH_IMAGE001
其中，RT-PCR反应体系的PCR反应液包括：pH 8.3～8.5的Tris-H2SO4 40～65mM、pH7.9的3-(N-吗啉基)丙磺酸10～30mM、柠檬酸钠2.2～3.8mM、(NH4)2SO4 10～22mM、MgSO4 4～9mM、质量百分比为0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.01％～0.1％的乙酰化牛血清白蛋白、dNTP 0.23～0.52mM、检测引物组550～650nM和检测探针组100～250nM；
RT-PCR反应体系的酶混合物包括：Tfl DNA聚合酶、MMLV逆转录酶和Stoffel片段；
所述的RT-PCR热循环程序为：
第一步：45℃ 10～20分钟，94～96℃ 8～12分钟；第二步：94～95℃ 15～30秒，62～68℃ 15～75秒，68～72℃ 32～40秒，3～9个循环；第三步：93～95℃ 15～20秒，62℃ 15～30秒，68 ～72℃ 20秒，12个循环；第四步：93～95℃ 15秒，58～62℃ 30～60秒，40个循环；
(4)结果分析和判定：
阳性：检测样本Ct值小于等于38.0，且曲线有明显的指数增长期；可疑：检测样本Ct值大于38.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值小于40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40.0。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述的RT-PCR反应体系的PCR反应液包括：pH 8.3～8.5的Tris-H2SO4 40～65mM、pH7.9的3-(N-吗啉基)丙磺酸10～30mM、柠檬酸钠2.2～3.8mM、(NH4)2SO4 10～22mM、MgSO4 4～9mM、质量百分比为0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.01％～0.1％的乙酰化牛血清白蛋白、dNTP 0.23～0.52mM、检测引物组550～650nM和检测探针组100～250nM。
CN201710322953.3A 2017-05-09 2017-05-09 结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒 Active CN106916903B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710322953.3A CN106916903B (zh) 2017-05-09 2017-05-09 结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710322953.3A CN106916903B (zh) 2017-05-09 2017-05-09 结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106916903A CN106916903A (zh) 2017-07-04
CN106916903B true CN106916903B (zh) 2020-09-29

Family

ID=59567961

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710322953.3A Active CN106916903B (zh) 2017-05-09 2017-05-09 结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106916903B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110184362A (zh) * 2018-02-23 2019-08-30 山东诺信检测有限公司 一种采用Taqman探针定量检测结核分枝杆菌复合体的试剂盒
CN110951871B (zh) * 2019-11-21 2024-01-05 瑞博奥(广州)生物科技股份有限公司 Pca3和psa rna检测试剂盒和扩增体系
CN116555456B (zh) * 2023-04-11 2024-02-23 中国医学科学院病原生物学研究所 一种结核分枝杆菌Ag85B mRNA的检测方法及应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1342771A (zh) * 2001-09-17 2002-04-03 复旦大学 结核分枝杆菌Ag85B抗原的表达纯化和作为疫苗组份的应用
CN101676405A (zh) * 2008-09-19 2010-03-24 扬子江药业集团北京海燕药业有限公司 结核分枝杆菌荧光定量pcr检测方法及其试剂盒
CN102559905A (zh) * 2012-02-02 2012-07-11 广州海力特生物科技有限公司 一组用于结核分枝杆菌实时荧光pcr检测的引物探针及其使用方法
CN103773872A (zh) * 2014-01-24 2014-05-07 深圳国际旅行卫生保健中心 用于检测结核分枝杆菌mRNA的引物和探针及其应用
CN104004837A (zh) * 2014-05-20 2014-08-27 广州海力特生物科技有限公司 检测结核分枝杆菌的pcr引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法
CN105483214A (zh) * 2015-11-24 2016-04-13 北京博瑞立安生物技术有限公司 一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1342771A (zh) * 2001-09-17 2002-04-03 复旦大学 结核分枝杆菌Ag85B抗原的表达纯化和作为疫苗组份的应用
CN101676405A (zh) * 2008-09-19 2010-03-24 扬子江药业集团北京海燕药业有限公司 结核分枝杆菌荧光定量pcr检测方法及其试剂盒
CN102559905A (zh) * 2012-02-02 2012-07-11 广州海力特生物科技有限公司 一组用于结核分枝杆菌实时荧光pcr检测的引物探针及其使用方法
CN103773872A (zh) * 2014-01-24 2014-05-07 深圳国际旅行卫生保健中心 用于检测结核分枝杆菌mRNA的引物和探针及其应用
CN104004837A (zh) * 2014-05-20 2014-08-27 广州海力特生物科技有限公司 检测结核分枝杆菌的pcr引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法
CN105483214A (zh) * 2015-11-24 2016-04-13 北京博瑞立安生物技术有限公司 一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
基于Ag85B mRNA的荧光定量逆转录PCR快速检测活结核分枝杆菌方法的建立和评价;高文凤等;《中国卫生检验杂志》;20131231;第23卷(第18期);第3477-3491页 *
结核分枝杆菌Ag85B mRNA定量检测作为化疗监测指标的初步研究;陆宇等;《中国防痨杂志》;20051031;第27卷(第5期);第281-284页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106916903A (zh) 2017-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110982942B (zh) 检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途
JP6430826B2 (ja) 無細胞病原体特異的核酸を検出する方法およびキット
CN112266986B (zh) 病毒核酸提取或保存试剂、引物探针组合、病毒扩增试剂、试剂盒及其应用
CN111172327A (zh) 一种免提取新型冠状病毒核酸检测的方法与试剂盒
CN110592244A (zh) 用于检测细菌污染的方法和组合物
CN110714090B (zh) 一种检测血浆中血流感染病原体游离核酸的试剂盒
CN106916903B (zh) 结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒
CN113512597B (zh) 结核分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
CN105907890B (zh) 一种快速区分HP-PRRS疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法
CN111808988A (zh) 一种covid-19核酸释放剂及核酸检测试剂盒
JP2021511076A (ja) 細胞混入アッセイ
CN110093432B (zh) 一种用于区分结核杆菌和BCG疫苗的sRNA标志物及其用途
WO2023279042A2 (en) Compositions and methods for detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 variants
CN114410836A (zh) 一种集样本处理、核酸提取及多重恒温扩增一体化的检测人细小病毒b19的试剂盒和方法
CN113046452B (zh) 一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物及其应用
CN112041441A (zh) 耳念珠菌检测用引物组、耳念珠菌检测试剂盒和耳念珠菌的检测方法
CN106868171B (zh) 一种rna恒温扩增熔解曲线法检测临床常见致病细菌的试剂盒及其应用
CN105803064B (zh) 检测肠杆菌科食源性致病菌的lamp方法、核酸及引物对
CN114134218B (zh) 一种基于CRISPR-Cas12a的荧光检测方法
CN106995842B (zh) 一种tma熔解曲线法联合焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的试剂盒及其应用
CN106929601B (zh) 一种高灵敏人乳头瘤病毒6,11型核酸检测试剂盒
CN110894532A (zh) 细菌性败血症（fbs）的raa恒温荧光检测方法及试剂
JP2006061134A (ja) 結核菌検出のためのプライマーおよび検出同定法
CN113755642A (zh) 一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒及检测方法
CN113502341A (zh) 梅毒螺旋体16s RNA的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant