CN113755642A - 一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒及检测方法，检测方法以下步骤：(1)使用一步法逆转录及PCR扩增直接对待测样品进行逆转录及PCR扩增，所用引物为一对巢式PCR引物，其正向引物P‑F1的核苷酸序列如SEQ NO:1所示，反向引物P‑R1的核苷酸序列如SEQ NO:2所示；(2)将一步法逆转录及PCR扩增所得到的产物作为模板，进行荧光定量PCR反应检测HBV pgRNA的含量，所用引物为另一对巢式PCR引物，其正向引物P‑F2的核苷酸序列如SEQ NO:3所示，反向引物P‑R2的核苷酸序列如SEQ NO:4所示。

Description

一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明涉及一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒及检测方法，属于病原微生物分子检测技术领域。
背景技术
慢性乙型肝炎是由乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)持续慢性感染，而引起的一种重大传染性疾病。目前，临床上对慢性乙型肝炎患者的治疗主要采用干扰素和核苷类似物，但长期进行这种治疗存在耐药性以及副反应大等问题，且不能达到彻底清除病毒cccDNA这一理想的治疗目标，一旦停药，患者又有再次发病的风险。
有研究表明，血液中HBV pgRNA的水平与慢性乙型肝炎的治疗和预后密切相关。高区分度检测血液中有无HBV pgRNA可间接反映肝细胞内HBV cccDNA的转录活跃水平，从而可指导临床上对慢性乙型肝炎的有效治疗和安全停药。
由于受到检测技术条件的限制，单次PCR对微量样品中的目的检测分子存在着检出下限，因而无法对微量样品中HBV pgRNA的有无与否作出较高区分度的检测判定，一些HBV pgRNA含量极低的样品，常因达不到检出极限而被误认为是阴性样品。因此，开发微量样品中有无HBV pgRNA的高区分度检测方法，将有助于临床上对慢性乙型肝炎的有效治疗和安全停药。
发明内容
本发明针对现有检测技术中存在的对HBV pgRNA检出灵敏度不足，微量样品达不到检出极限的问题，提供一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒及检测方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒，包括两对巢式PCR引物，其中一对巢式PCR引物的正向引物P-F1的核苷酸序列如SEQ NO:1所示，反向引物P-R1的核苷酸序列如SEQ NO:2所示，另一对巢式PCR引物的正向引物P-F2的核苷酸序列如SEQ NO:3所示，反向引物P-R2的核苷酸序列如SEQ NO:4所示。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，还包括反转录及PCR扩增体系所用试剂，所述反转录及PCR扩增体系所用试剂包括2×Reaction Mix、RT/Taq enzyme和Nuclease-free ddH2O。
进一步，还包括荧光定量PCR反应体系所用试剂，所述荧光定量PCR反应体系所用试剂包括2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix和ddH2O。
本发明解决上述技术问题的另一个技术方案如下：一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测方法，包括以下步骤：(1)使用一步法逆转录及PCR扩增直接对待测样品进行逆转录及PCR扩增，所用引物为一对巢式PCR引物，其正向引物P-F1的核苷酸序列如SEQ NO:1所示，反向引物P-R1的核苷酸序列如SEQ NO:2所示；(2)将一步法逆转录及PCR扩增所得到的产物作为模板，进行荧光定量PCR反应检测HBV pgRNA的含量，所用引物为另一对巢式PCR引物，其正向引物P-F2的核苷酸序列如SEQ NO:3所示，反向引物P-R2的核苷酸序列如SEQNO:4所示。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述逆转录及PCR扩增的反应体系为2×Reaction Mix、正向引物P-F1、反向引物P-R1、RT/Taq enzyme、待测样品和Nuclease-free ddH2O。
进一步，所述一步法逆转录及PCR扩增的具体步骤为：将所述逆转录及PCR扩增的反应体系立即置于-70℃冰箱2分钟，再加入1μL矿物油，3000rpm离心2分钟，立即进行如下PCR反应，50℃逆转录60min，循环1次，95℃预变性3min，循环1次，95℃变性15sec后60℃退火、延伸2min，循环20次，最后保持4℃。
进一步，在一步法逆转录及PCR扩增结束后，将一步法逆转录及PCR扩增所得到的产物用ddH2O进行300-500倍稀释，立即进行后续荧光定量PCR反应。
进一步，所述荧光定量PCR反应体系为2×ChamQ Universal SYBR qPCR MasterMix、正向引物P-F2、反向引物P-R2、稀释后的产物和ddH2O。
进一步，所述荧光定量PCR反应的具体步骤为：95℃预变性30sec，循环1次，95℃变性10sec后60℃退火、延伸30sec，循环40次。
本发明的有益效果是：本发明通过一步法逆转录及PCR扩增，不需要提取RNA，可直接对微量样品中HBV的pgRNA进行逆转录及初次PCR扩增，放大微量样品中HBV pgRNA的检测信号，再使用荧光定量PCR进行检测，进一步放大微量样品中HBV pgRNA的检测信号，从而极大提高被检测微量样品中有无HBV pgRNA的可信度与区分度，实现对微量样品中HBV pgRNA的超灵敏度检测。
本发明首次通过一步法逆转录及PCR扩增，以及再使用荧光定量PCR对微量样品中HBV pgRNA信号进行检测，通过两次信号放大，实现了对微量样品中HBV pgRNA的超灵敏度检测。
相比于其它方法，本发明的优点可体现在如下几个方面：
1.较优的，本发明可以不用对样品进行核酸提取，操作简便，且可避免核酸提取过程中的核酸损失；
2.较优的，本发明可以对大量样品、少量样品或微量样品(如1微升血浆样、血清样、体液样或单细胞样品等)中的HBV pgRNA进行有效检出，可克服当前技术无法检测微量样品中的HBV pgRNA的技术缺陷；
3.较优的，本发明通过两次PCR扩增技术，极大提高样品中HBV pgRNA的检出信号，可以对待测样品中有无HBV pgRNA进行高灵敏度高区分度检测(阴性样品和阳性样品的荧光定量PCR扩增Ct值相差10个循环以上，即差异倍数可达2的10次方)，从而可克服单次PCR对微量样品中目的分子的检测存在着检出下限的问题。
附图说明
图1为两对巢式PCR引物扩增片段长度示意图；
图2为定量PCR检测肝癌细胞Huh7细胞培养上清以及转有HBV 1.3倍复制子质粒的Huh7细胞培养上清中HBV pgRNA的扩增曲线；
图3为将第二次PCR产物构建到TA质粒上的测序鉴定结果；
图4为使用本发明的检测方法检测慢性乙型肝炎病人1微升血清中HBV pgRNA扩增曲线；
图5为使用传统检测方法检测慢性乙型肝炎病人100微升血清中HBV pgRNA扩增曲线。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.仪器、试剂、引物、细胞、临床样品
仪器：普通PCR仪和荧光定量PCR仪。
试剂：所用试剂均为常规生化试剂公司购买得到。
引物：设计两对巢式PCR引物，增加PCR扩增目的片段的特异性，巢式PCR引物序列如表1所示。
表1引物编号及序列
引物序列编号 引物名称 引物序列
SEQ NO:1 P-F1 GAGTGTGGATTCGCACTCC
SEQ NO:2 P-R1 GAGGCGAGGGAGTTCTTCT
SEQ NO:3 P-F2 CCACCAAATGCCCCTATCCT
SEQ NO:4 P-R2 GTTCTTCTTCTAGGGGACCT
两对巢式PCR引物扩增片段长度如图1所示。
细胞：Huh7细胞来源于湖南大学液氮冻存保种的细胞，使用DMEM细胞培养基进行培养。
临床样品：HBV患者血清以及正常人血清均来自湘雅二医院。
2.检测方法
一步法逆转录及PCR扩增：
利用南京诺唯赞公司的单细胞扩增试剂盒(货号P621)进行一步法反转录及PCR扩增，具体操作如下：
在PCR管中配置如下反应体系：
2×Reaction Mix 2.5μl
P-F1和P-R1混合物 0.5μl
RT/Taq enzyme 0.1μl
待测样品 1μl
Nuclease-free ddH<sub>2</sub>O Up to 5.0μl
在P-F1和P-R1混合物中，P-F1和P-R1的浓度分别为0.1μM。
将以上体系立即置于-70℃冰箱2分钟，再加入1μL矿物油，3000rpm离心2分钟，立即进行如下PCR反应：
Figure BDA0003256197700000051
Figure BDA0003256197700000061
反应结束后，用ddH2O对反应产物进行300-500倍稀释，立即进行后续荧光定量PCR反应：
荧光定量PCR反应体系(南京诺唯赞公司的荧光定量PCR试剂，货号Q711-02/03)：
2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0μl
P-F2 0.4μl
P-R2 0.4μl
上述稀释后的PCR产物 2μl
ddH<sub>2</sub>O Up to 20.0μl
P-F2和P-R2的浓度分别为10μM。
荧光定量PCR反应条件：
Figure BDA0003256197700000062
3.细胞样品检测
利用本发明的检出方法，对肝癌细胞系Huh7细胞培养上清以及转入HBV 1.3倍复制子质粒的Huh7细胞培养上清进行HBV pgRNA检测，结果显示在在1微升细胞培养上清样品中，肝癌细胞系Huh7细胞培养上清以及转入HBV1.3倍复制子质粒的Huh7细胞培养上清中的HBV pgRNA具有非常高的区分度，两者的Ct值相差10以上(如表2和图2所示)，即差异区分倍数能达到2的10次方以上。对该PCR产物进行TA质粒克隆后，经过测序鉴定，结果显示上述PCR引物可以有效扩增出HBV pgRNA中的遗传片段(如图3所示)。
表2一微升细胞培养上清中HBV pgRNA水平
Figure BDA0003256197700000071
4.临床样本检测
利用本发明的检出方法，对5例正常人血清和4例慢性乙型肝炎患者1微升血清进行HBV pgRNA检测，结果显示在在1微升血清样品中，健康人和慢性乙型肝炎患者的HBVpgRNA具有非常高的区分度，两者的Ct值相差10以上(如表3和图4所示)，即差异区分倍数能达到2的10次方以上。
而使用传统检测方法，即对上述血清样品各取100微升，进行RNA提取，反转录以及荧光定量PCR检测，结果显示只有部分慢性乙型肝炎患者被检出，且其结果接近于检出下限；另一部分慢性乙型肝炎患者血清中的HBV pgRNA含量则无法与健康人样品相区分开，二者都没有达到检出下限(如图5所示)。
由此可见，传统检测方法需要提取RNA，对实验操作的专业程度要求较高，由于RNA不稳定，容易被RNA酶降解，因此在RNA提取过程中容易导致实验结果不确定性增加；此外，传统检测方法因受到检出下限的制约，部分慢性乙型肝炎患者经过核苷类似物治疗后体内HBV pgRNA载量较低或极低，使用传统检测方法获得的检测结果难以与阴性对照相区分，不利于医生对病情的正确判断以及指导患者安全停药。使用本发明的检测方法，可有效克服上述传统检测方法所存在的不足，可提高阳性患者和阴性患者检测结果之间的可区分度，同时本发明操作相对比较简单，还适合对慢性乙型肝炎患者进行核苷类似物治疗疗效的动态检测，这将更有利于临床医生对患者病情的正确判断以及指导患者安全停药。
表3一微升慢性乙型肝炎患者血清中HBV pgRNA水平
Figure BDA0003256197700000072
Figure BDA0003256197700000081
本领域技术人员可以根据其普通知识和在本领域的经验，通过对HBV pgRNA进行核酸提取或富集、再利用逆转录以及二次PCR扩增，放大HBV pgRNA检出信号，不仅可对少量样品进行检测，也可对大量样品进行检测；基于该二次PCR扩增技术，也可对HBV DNA进行超灵敏度检测等，都应包括在本发明的范围内。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒及检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagtgtggat tcgcactcc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggcgaggg agttcttct 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccaccaaatg cccctatcct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttcttcttc taggggacct 20

Claims (9)

1.一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒，其特征在于，包括两对巢式PCR引物，其中一对巢式PCR引物的正向引物P-F1的核苷酸序列如SEQ NO:1所示，反向引物P-R1的核苷酸序列如SEQ NO:2所示，另一对巢式PCR引物的正向引物P-F2的核苷酸序列如SEQNO:3所示，反向引物P-R2的核苷酸序列如SEQ NO:4所示。
2.根据权利要求1所述一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒，其特征在于，还包括反转录及PCR扩增体系所用试剂，所述反转录及PCR扩增体系所用试剂包括2×Reaction Mix、RT/Taq enzyme和Nuclease-free ddH2O。
3.根据权利要求1所述一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒，其特征在于，还包括荧光定量PCR反应体系所用试剂，所述荧光定量PCR反应体系所用试剂包括2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix和ddH2O。
4.一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用一步法逆转录及PCR扩增直接对待测样品进行逆转录及PCR扩增，所用引物为一对巢式PCR引物，其正向引物P-F1的核苷酸序列如SEQ NO:1所示，反向引物P-R1的核苷酸序列如SEQ NO:2所示；(2)将一步法逆转录及PCR扩增所得到的产物作为模板，进行荧光定量PCR反应检测HBV pgRNA的含量，所用引物为另一对巢式PCR引物，其正向引物P-F2的核苷酸序列如SEQ NO:3所示，反向引物P-R2的核苷酸序列如SEQ NO:4所示。
5.根据权利要求4所述一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测方法，其特征在于，所述逆转录及PCR扩增的反应体系为2×Reaction Mix、正向引物P-F1、反向引物P-R1、RT/Taq enzyme、待测样品和Nuclease-free ddH2O。
6.根据权利要求5所述一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测方法，其特征在于，所述一步法逆转录及PCR扩增的具体步骤为：将所述逆转录及PCR扩增的反应体系立即置于-70℃冰箱2分钟，再加入1μL矿物油，3000rpm离心2分钟，立即进行如下PCR反应，50℃逆转录60min，循环1次，95℃预变性3min，循环1次，95℃变性15sec后60℃退火、延伸2min，循环20次，最后保持4℃。
7.根据权利要求4所述一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测方法，其特征在于，在一步法逆转录及PCR扩增结束后，将一步法逆转录及PCR扩增所得到的产物用ddH2O进行300-500倍稀释，立即进行后续荧光定量PCR反应。
8.根据权利要求7所述一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系为2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、正向引物P-F2、反向引物P-R2、稀释后的产物和ddH2O。
9.根据权利要求8所述一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的具体步骤为：95℃预变性30sec，循环1次，95℃变性10sec后60℃退火、延伸30sec，循环40次。
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