CN112301116A - 非诊断目的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非诊断目的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法，其包括：茎环DNA链的设计、klenow酶扩增、Cas12a的特异性切割，其中茎环DNA链的设计包含在已知miRNA序列的基础上设计长度及结构不同的DNA链和长度及结合力不同的引物序列，以更显著的检测到目标miRNA，klenow酶扩增和Cas12a的特异性切割实验从而提升了检测miRNA的速度和灵敏度。本发明能快速灵敏的检测miRNA的含量，在生物医学研究和临床诊断中具有很大应用价值。

Description

非诊断目的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法

技术领域

本发明属于miRNA检测领域，具体涉及一种非诊断目的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法。

背景技术

微小RNA(miRNA)是广泛存在于真核生物当中的一类长度为18-25个成熟核苷酸(nt)组成的内源性小分子非编码RNA，由DNA转录产生，pre-miRNA(precursor microRNA)剪切而来。通过碱基互补配对与其靶基因的mRNA 3′非编码区特异性结合，抑制靶基因表达并参与多种生物过程，包括细胞的增殖、凋亡、自噬、分化和转移。每个miRNA可以调节多个基因靶标，有多功能调节作用，而几个不同的miRNA也可以靶向作用于相同的信使RNA(mRNA)共同发挥作用。近期研究表明，miRNA在一系列的生命活动过程中具有不可替代的作用，如当机体内的某些miRNA表达发生变化时,更易罹患癌症和其他一系列疾病。这一现象提示,人们可通过对miRNA的检测来实现对相关疾病的早期诊断。

Klenow酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段，缺失5'-3'外切酶活性而保留了DNA聚合酶Ⅰ的5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切酶活性。Klenow酶的蛋白质晶体学研究发现,它包含两个不同的结构域,小结构域可以结合dNMP和二价金属离子,含有3'-5'外切酶活性中心,而C末端的大结构域中有一个可以结合双链DNA的“裂口”,被认为含有聚合酶活性中心。Klenow酶在分子生物学领域应用广泛,如粘性末端补齐、cDNA第二链合成、DNA的3'末端标记及焦磷酸测序等。Klenow是焦磷酸测序中使用最广泛的DNA聚合酶，但天然的Klenow由于其3'外切酶活性会对引物进行切割产生测序信号的混乱而无法直接用于测序反应，需对其进行改造使外切酶活性缺失才能保证测序的准确性。Klenow(3′→5′exo-)属于中温DNA聚合酶(mesophilic DNA polymerase)，该酶缺乏校正核酸酶活性(3′→5′)和缺口平移核酸酶活性(5′→3′)，在DNA合成过程中，它显示出中链置换活性。

CRISPR/Cas的基因座结构相对简单，一个典型的CRISPR/Cas基因座由一个编码Cas蛋白的操纵子和一个重复间隔序列(CRISPR)组成。位于CRISPR基因座5′端成簇的Cas基因，这些Cas基因是CRISPR免疫防御途径中的基本组成成分，编码的蛋白具有核酸酶相关的功能结构域，Cas蛋白通过位点特异性的切割将入侵DNA切断。Cas12a属于2类V型CRISPR效应蛋白，是在单链向导RNA引导下与靶DNA特定位点结合并切割的核酸内切酶。研究表明，CRISPR/Cas12a不仅对DNA具有活性，而且对RNA同样有较高的活性。Cas12a与成熟crRNA形成Cas12a-crRNA核糖核蛋白二元复合体，即可实现对靶基因的识别和剪切。

基于上述原因，本发明拟结合使用PCR技术和碱基互补配对原则，使用CRISPR/Cas技术特异性识别扩增得到的互补DNA序列，激活Cas12a的酶活性，采用对于自主加入BHQ-TTTTTTTTTT-Cy5序列的切割及荧光信号的检测，实现信号的级联放大效应，从而实现使用CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非诊断目的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

1.一种非诊断目的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)茎环和引物结合：茎环结构和DNA引物充分结合，发成构象变化，提供出klenow酶的识别位点；

2)在步骤1)得到klenow酶的识别位点后，在klenow酶的作用下进行扩增，扩增过程中将miRNA序列挤下，使miRNA进行循环，单链DNA结构在引物条件下进行扩增，得到双链DNA结构；

3)Cas12a特异性检测:步骤2)得到的双链DNA结构加入Cas12a进行特异性识别。

茎环结构为H3，5’-GCTT GTGG CCGT TTAC GTCG CCGT CCAG CTGC TATG CCAGCATC TTGC CTTA AACG GCCA CAAG C-3’；DNA引物为P1，5’-GGCC CGTT TA-3’。

具体包括下述步骤：1)分别取1-5μL的浓度为1-20μM的DNA茎环结构H1、H2、H3，加入其分别对应的1-5μL的浓度为1-20μM的引物P1、P2、P3、P4、P5；2)加入一定浓度的miRNA、1-10μL浓度为2-20mM的dNTP、以及1-5U的klenow酶、1-5μL的buffer，再加入5-15μL PBS保证体积为20μL，同时设置不存在miRNA时的对照反应，反应时间为15-50min；3)接着进行Cas12a反应；取5-20μL步骤2)得到的klenow酶扩增液，加入0.1-5μL的浓度为1-20μM的Cas12a、1-5μL的浓度为1-20μM的crRNA、1-5μL的浓度为5-10μM的BHQ-Cy5、1-5μL的buffer及1-10μL的PBS，反应时间为15-75min。

优选的，具体包括下述步骤：加入miRNA 10^-7M、dNTP 10mM、klenow 3U、buffer 2μL及PBS保证体积为20μL，在37℃孵育30min，再加入4pM Cas12a、20μM crRNA、10mM BHQ-Cy5、2.5μL buffer，37℃孵育90min，进行荧光检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.显著提高miRNA的检测灵敏度。主要通过放大检测信号，降低背景噪音两方面的有机结合，即以klenow酶扩增后得到大量与miRNA互补序列，提供大量待检测的核酸序列来放大检测信号；通过Cy5发光作为检测信号；从而显著提高了检测的灵敏度。

2.实现样品中miRNA的高效特异性检测，通过实验验证，本方法可检测出pM级别的miRNA，实现了样品中miRNA的高效特异性检测。

3.实现样品中miRNA的快速、灵敏检测，本方法检测仅需90min，即可得到显著且灵敏的检测信号，相较于电泳技术灵敏度更高，故可实现样品中miRNA的快速、灵敏检测。

附图说明

图1为非诊断目的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法检测原理示意图；

图2为制备的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的检测方法条件优化实验图；

图3为制备的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的琼脂糖凝胶电泳实验图。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明检测miRNA原理如图1所示，首先miRNA与茎环DNA互补配对结合，促进茎环结构在互补配对作用力下打开，茎环结构转变为单链结构，其中一部分与miRNA互补配对结合，同时引物结构中与茎环DNA互补序列结合，在klenow酶的作用下进行扩增，扩增过程中将miRNA序列挤下，使miRNA进行循环，单链DNA结构在引物为引物条件下进行扩增，得到双链DNA结构，此结构可被crRNA识别并结合，引导并激活Cas12a切割被BHQ-Cy5标记结合的胸腺嘧啶序列，从而释放Cy5荧光，实现miRNA的超灵敏检测。图3为制备的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的琼脂糖凝胶电泳实验图。

特异性DNA茎环的设计：通过对目标miRNA的序列分析，根据配对Tm温度值和△G能量值的差异，创造性的设计特异性的DNA茎环结构。miRNA配对Tm温度值为56.5℃，△G能量值为-15.3，因此设计的DNA茎环Tm值高于57℃，△G能量值应高于-15.3，DNA茎环可以高效特异的结合目标miRNA。使用miRNA31对DNA茎环序列的特异性进行评价，选择特异性最好的茎环序列。其中用到的核酸序列如表1示出：表1

实施例：

(1)分别用DNA茎环H1、H2、H3及其分别对应的引物(分别为P1、P2、P3、P4、P5)编号1-10组,分别设置miRNA的空白对照，加入miRNA 10^-9M、dNTP 10mM、klenow 1U、buffer 2μL及PBS保证体积为20μL，在反应温度为37℃下反应60min，加入过量Cas12a进行荧光检测，确定H3、P1为实验的DNA茎环结构和引物；

(2)Klenow酶反应条件的优化：

1)miRNA浓度优化：取10只1.5ml离心管，分别编号1-10，分别稀释，得到一系列浓度梯度为10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M，10^-11M，10^-12M，10^-13M，10^-14M、10^-15M、0的miRNA，分别加入步骤(1)中的其他反应物质，将10支离心管37℃孵育60min，加入过量Cas12a进行荧光检测，得到最适miRNA反应浓度10^-7M；

2)Klenow酶浓度优化：对比klenow、klenow exo-、BST三种扩增酶在本实验中的扩增能力，选择扩增性较强且非特异性扩增较弱的酶进行实验。取12只1.5ml离心管，分别编号1-12，分别加入0、0.5U、1U、2U、3U、4U的klenow酶(同时设置了不存在miRNA的对照组以便荧光检测)，分别加入其他反应物质，将12支离心管37℃孵育60min，加入过量Cas12a进行荧光检测，得到klenow酶反应浓度曲线，适合的klenow酶浓度为3U；(如图2中a所示)；

3)Klenow酶反应时间优化：取12只1.5ml离心管，分别编号1-12，分别加入miRNA10^-7M、dNTP 10mM、klenow 3U、buffer 2ul及PBS保证体积为20ul(同时设置了不存在miRNA的对照组以便荧光检测)，将12支离心管分别在37℃孵育0min、20min、30min、40min、50min，加入过量Cas12a进行荧光检测，得到klenow酶反应时间曲线(如图2中b所示)，适合的反应时间为30min；

(3)Cas12a反应条件的优化：

1)Cas12a反应浓度优化：取12只1.5ml离心管，分别编号1-12，分别加入miRNA 10^{- 7}M、dNTP 10mM、klenow 3U、buffer 2μL及PBS保证体积为20μL(同时设置了不存在miRNA的对照组以便荧光检测)，将12支离心管分别在37℃孵育30min，再分别加入0、1pM、2pM、4pM、6pM、8pM的Cas12a，分别加入20μM crRNA、10mM BHQ-Cy5、2.5μL buffer，将12支离心管37℃孵育60min，进行荧光检测，得到Cas12a反应浓度曲线(如图2中c所示)，得到适合的Cas12a为4pM；

2)Cas12a反应时间优化：取12只1.5ml离心管，分别编号1-12，分别加入miRNA 10^{- 7}M、dNTP 10mM、klenow 3U、buffer 2μL及PBS保证体积为20μL(同时设置了不存在miRNA的对照组以便荧光检测)，将12支离心管分别在37℃孵育30min，再分别加入4pM Cas12a、20μMcrRNA、10mM BHQ-Cy5、2.5μL buffer，将12支离心管分别于37℃孵育0min、15min、30min、45min、60min、75min，90min，105min，120min进行荧光检测，得到Cas12a反应时间曲线(如图2中d所示)；

以上完成本实验的反应条件优化，从而得到最适的基于BHQ-Cy5及CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法，实现miRNA的超灵敏定量检测。

以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (4)

1.一种非诊断目的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)茎环和引物结合：茎环结构和DNA引物充分结合，发成构象变化，提供出klenow酶的识别位点；

2)在步骤1)得到klenow酶的识别位点后，在klenow酶的作用下进行扩增，扩增过程中将miRNA序列挤下，使miRNA进行循环，单链DNA结构在引物条件下进行扩增，得到双链DNA结构；

3)Cas12a特异性检测:步骤2)得到的双链DNA结构加入Cas12a进行特异性识别。

2.根据权利要求1所述的非诊断目的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于，茎环结构为H3，5’-GCTT GTGG CCGT TTAC GTCG CCGT CCAG CTGC TATG CCAGCATC TTGC CTTA AACG GCCA CAAG C-3’；DNA引物为P1，5’-GGCC CGTT TA-3’。

3.根据权利要求1所述的非诊断目的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于，具体包括下述步骤：1)分别取1-5μL的浓度为1-20μM的DNA茎环结构H1、H2、H3，加入其分别对应的1-5μL的浓度为1-20μM的引物P1、P2、P3、P4、P5；2)加入10^-7-10^-15M的miRNA、1-10μL浓度为2-20mM的dNTP、以及1-5U的klenow酶、1-5μL的buffer，再加入5-15μL PBS保证体积为20μL，同时设置不存在miRNA时的对照反应，反应时间为15-50min；3)接着进行Cas12a反应；取5-20μL步骤2)得到的klenow酶扩增液，加入0.1-5μL的浓度为1-20μM的Cas12a、1-5μL的浓度为1-20μM的crRNA、1-5μL的浓度为5-10μM的BHQ-Cy5、1-5μL的buffer及1-10μL的PBS，反应时间为15-75min。

4.根据权利要求1所述的非诊断目的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法，其特征在于，具体包括下述步骤：加入miRNA 10^-7M、dNTP 10mM、klenow 3U、buffer 2μL及PBS保证体积为20μL，在37℃孵育30min，再加入4pM Cas12a、20μM crRNA、10mM BHQ-Cy5、2.5μLbuffer，37℃孵育90min，进行荧光检测。

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