CN117512076A - 一种基于劈裂式Cas9系统的RNA免反转录的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于劈裂式Cas9系统的RNA免反转录的检测方法，涉及RNA检测技术领域。其包括如下步骤：将待测RNA序列、sgRNA‑P1和sgRNA‑P2进行混合反应，再将Cas蛋白和带有荧光标记物的双链DNA序列与混合反应后的产物混合，反应后检测反应产物中的荧光标记物的荧光强度，以此作为检测结果判定。本发明基于CRISPR系统的检测原理提供的免反转录的RNA检测方法兼具高特异性、结果判读简单、操作简便、检测准确、通用性良好、检测成本低等技术优势。可以满足环境及仪器配置有限的地区的检测需求。

Description

一种基于劈裂式Cas9系统的RNA免反转录的检测方法
技术领域
本发明涉及RNA检测技术领域，具体而言，涉及一种基于劈裂式Cas9系统的RNA免反转录的检测方法。
背景技术
目标RNA特异性片段的检测是一种常见的核酸检测类型。其中聚合酶链式反应（PCR）已作为行业内的“金标准”，广泛应用于RNA的定性、定量分析。近年来，以PCR为基础衍生出的核酸检测技术（实时荧光定量PCR、多重PCR和数字PCR）逐步向多重、高通量、定量分析的方向发展。
目前，基于PCR的RNA检测技术依赖昂贵的仪器设备和经验丰富的技术人员，不适用于环境及仪器配置有限的地区。而且针对RNA核酸靶标的定性、定量方法都无法避免反转录成cDNA的过程。这样不仅增加了反应步骤、反应时间，而且反转录酶的介入也增加了反应体系的复杂程度和检测成本，不利于后续多技术结合。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种RNA免反转录的检测方法，从而对待测RNA进行免反转录检测。该方法极大程度上简化了检测流程，无需对RNA样本进行反转录就能够高效地实现RNA的检测，本发明提供的检测方法对于单链RNA样本均能够实现检测，具有普适性。而且本发明提供的检测方法具有检测准确性高的技术优势。此外，本发明检测方法的提出还有助于降低检测成本，满足环境及仪器配置有限的地区的检测需求。
本发明是这样实现的：
一种RNA免反转录的检测方法，其包括如下步骤：将待测RNA序列、sgRNA-P1和sgRNA-P2进行混合反应，再将Cas蛋白和带有荧光标记物的双链DNA序列与混合反应后的产物混合，反应后检测反应产物中的荧光标记物的荧光强度；
sgRNA-P1的结构包括：5’-第二序列-第一序列-3’；第一序列与待测RNA序列的5’端的序列反向互补配对；第二序列为tracrRNA序列；
sgRNA-P2的结构包括：5’-第五序列-第四序列-第三序列-3’；其中第五序列与待测RNA序列的5’端的序列反向互补配对；第三序列与双链DNA序列的其中一条链反向互补配对；第四序列与sgRNA-P1的部分第二序列反向互补配对，且第四序列的长度≥6bp；
双链DNA由能够自发互补成双链结构的单链DNA形成。
本发明利用CRISPR系统的高特异性结合RNA自组装的优势，具体而言，本发明开创性地将sgRNA设计为“劈裂式sgRNA”，“劈裂式sgRNA”包括sgRNA-P1和sgRNA-P2。该“劈裂式sgRNA”具有与待测RNA自组装为“三元自组装体”的功能。检测时，将sgRNA-P1和sgRNA-P2与待测RNA混合后，经过反应获得包含有“三元自组装体”的反应产物。“三元自组装体”的反应产物能够激活Cas蛋白的剪切活性。双链DNA的其中一条链由于能与sgRNA-P2进行互补配对，激活的Cas蛋白能够将与sgRNA-P2互补配对的那一条DNA链在PAM（PAM，protospaceradjacent motif）的区域后进行切开，具有双链切割功能的Cas蛋白也可以将不互补配对的另一条DNA链在PAM的区域后进行切开。从而使得双链DNA上的荧光标记物原本荧光被淬灭的荧光解除荧光的束缚，在激发光下发出荧光，通过荧光检测设备或荧光统计相机对荧光强度进行统计，从而对RNA进行检测。
在一种可选的实施方式中，若对同一种待测的RNA样本进行定量，可以将已知RNA含量的同一种RNA采用本发明提供的方法进行荧光强度检测，然后绘制荧光强度与RNA含量的标准曲线。再检测待测RNA样本的荧光强度，代入标准曲线中，即可获得其RNA含量。
基于上述检测原理的检测方法兼具高特异性、结果判读简单、操作简便、检测准确、通用性良好、检测成本低等技术优势。
由单链DNA分子形成双链DNA时的单链DNA的自折叠效率对于荧光淬灭效率密切相关。具体变现为：单链DNA互补效率越高，形成双链自淬灭结构越多，FAM荧光基团的淬灭越彻底。
在本发明应用较佳的实施方式中，待测RNA序列为单链RNA序列。
名词释义：microRNA为微小RNA，也称miRNA。
scRNA为细胞质小分子RNA。
在一种可选的实施方式中，待测RNA序列选自microRNA、解链后的siRNA、piRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、SLRNA、scRNA、SRPRNA和mRNA-like的非编码RNA中的至少一种。
待测RNA序列为来源于细菌、病毒、真菌、动物或植物的RNA序列。本发明提供的检测方法具有样本可检测范围广的优势。
在一种可选的实施方式中，microRNA选自microRNA-21、miR-144-5p、miR-30b-5p、miR-423-5p、miR-16-2-3p、miR-3200-5p、miR-4732-5p、miR-200c-3p、miR-125a-5p、miR-195-5p或miR-141-3p中的一种或几种。
在本发明应用较佳的实施方式中，sgRNA-P1和sgRNA-P2通过如下方式获得：
以待劈裂的sgRNA的3’端的第一个发夹结构中的任意位置为劈裂位点，然后将包括tracrRNA的序列与第一序列组合获得sgRNA-P1；
以来源于tracrRNA的功能性区域的序列作为第四序列，与第三序列和第五序列进行组合获得sgRNA-P2；
第一序列的长度为10-15bp，第五序列的长度为10-15bp。
优选地，以待劈裂的sgRNA的3’端的第一个发夹结构中的中间环状区域为劈裂位点。
劈裂位点是指，从原始sgRNA（待劈裂sgRNA）的发夹结构的非功能区（3’端的第一个发夹结构）中找出的劈裂位点。将sgRNA从3’端的第一个发夹结构劈裂，均能实现RNA的免反转录检测。当以待劈裂的sgRNA的3’端的第一个发夹结构中的中间环状区域为劈裂位点时，能够激活Cas9活性，具有更优地切割双链DNA分子的效果。根据该劈裂位点利用在线结构分析软件分析，避免过多二级结构产生，可以获得sgRNA-P1和sgRNA-P2，作为两条捕获目标RNA的捕获臂。
在本发明应用较佳的实施方式中，待劈裂的sgRNA的3’端的第一个发夹结构中的中间环状区域长度为6-8bp。
在本发明应用较佳的实施方式中，劈裂位点位于待劈裂的sgRNA序列5’端起第39位-第40位碱基之间。
第一序列的长度为10-15bp，第五序列的长度为10-15bp。发明人设计不同长度的第一序列和第五序列，针对不同长度的待测RNA序列进行组合筛选，发现第一序列和第五序列的长度对于待测RNA的捕获效率有着关键的影响。在上述长度范围内，具有更优的捕获效率，sgRNA-P1和sgRNA-P2能够更好地捕获待测RNA，过短会导致捕获效率降低，过长会导致sgRNA-P1和sgRNA-P2本身产生非特异性结构，降低捕获效率和Cas9识别功能。
例如第一序列的长度为10bp，11bp，12bp，13bp，14bp或15bp。第五序列的长度为10bp，11bp，12bp，13bp，14bp或15bp。第一序列和第五序列的长度可以相同，也可以不相同。更优选为相同。
sgRNA-P1和sgRNA-P2的混合摩尔比为(0.5-1):(1-2)； sgRNA-P1与Cas蛋白和带有荧光标记物的双链DNA序列的混合摩尔比为(0.8-1):(0.8-1):(2-3)。
例如1:1:2、0.8:0.8:2、0.9:0.8:2、0.9:1:2、0.8:0.8:3、0.8:1:3或0.9:0.9:3。
在本发明应用较佳的实施方式中，sgRNA-P1和sgRNA-P2的混合摩尔比为1:1；sgRNA-P1与Cas蛋白和带有荧光标记物的双链DNA序列的混合摩尔比为1:1:3。
在上述混合摩尔比下具有较高的自组装效率。当组装链sgRNA-P1和sgRNA-P2比例为0.5:1时，由于靶标捕获连较少，导致切割产物量较少。随着比例的不断增加，在1：1时切割产物量达到最高。再继续增加捕获连含量后，也会存在切割产物出现较少现象，这可能是由于自组装链发生分子内的自折叠，降低了靶标捕获的有效自组装结构。
在本发明应用较佳的实施方式中，待测RNA序列、sgRNA-P1和sgRNA-P2在 37℃、pH7.5、10 mM镁离子条件下进行“三元”自组装反应；
反应时间为10-20分钟。在上述反应条件下具有更优的自组装效率。
Cas蛋白和带有荧光标记物的双链DNA序列与混合反应后的产物混合后的反应条件为：20-40℃，反应20-30分钟。在上述反应条件下具有更优的切割效率。
Cas蛋白为Cas9蛋白、Cas12a蛋白、Cas12b蛋白、Cas12c蛋白、Cas13a蛋白、Cas13b蛋白或Cas14蛋白。本领域的技术人员知晓，依赖于一个单一的crRNA引导蛋白进行目标干扰均在本发明的保护范围之内。
在本发明应用较佳的实施方式中，荧光标记物为荧光报告基团和/或荧光淬灭基团；
在一种可选的实施方式中，双链DNA序列的其中一条链标记有荧光报告基团，双链DNA序列的另一条链标记有荧光猝灭基团，荧光报告基团选自HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、Texas Red、NED、Alexa Flour和VIC中的任一项，荧光猝灭基团选自MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和QSY中的任一项。此外，本领域的技术人员可以根据需要选择市售的任意一种荧光标记物作为DNA的标记物，并不限于上述列举的情形。
在本发明应用较佳的实施方式中，反式激活crRNA的序列如SEQ ID NO.1所示：UCAACAUCAGU。
sgRNA-P1的第二序列如SEQ ID NO.2所示：AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU。
在本发明应用较佳的实施方式中， sgRNA-P2的第五序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.3：CUGAUAAGCUA。
第四序列为GGUUUUAGA，第三序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.4：AAUGGAGAGUUUGCAAGGA。
对目标RNA样本进行定量检测的方法包括：采用所述RNA免反转录的检测方法获得已知RNA含量的同一种RNA的荧光强度，并绘制RNA含量与荧光强度的标准曲线；根据目标RNA样本的荧光强度在标准曲线上获得对应的RNA含量。
第二方面，本发明还提供了检测microRNA-21或microRNA-155的检测试剂或试剂盒，用于检测microRNA-21的检测试剂或试剂盒包括：如SEQ ID NO.5所示的sgRNA-P1、如SEQ ID NO.6所示的sgRNA-P2；优选地，用于检测microRNA-21的检测试剂或试剂盒还包括如SEQ ID NO.7-8所示的双链DNA；
用于检测microRNA-155的检测试剂或试剂盒包括：如SEQ ID NO.9所示的sgRNA-P1、如SEQ ID NO.10所示的sgRNA-P2；优选地，用于检测microRNA-21的检测试剂或试剂盒还包括如SEQ ID NO.7-8所示的双链DNA。
SEQ ID NO.5：
UCAACAUCAGUAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU。
SEQ ID NO.6：
AAUGGAGAGUUUGCAAGGAGGUUUUAGACUGAUAAGCUA。
SEQ ID NO.7：AATGGAGAGTTTGCAAGGA。
SEQ ID NO.8：TCCTTGCAAACTCTCCATT。
SEQ ID NO.9：
UCAACAUCAGUAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU。
SEQ ID NO.10：
AAUGGAGAGUUUGCAAGGAGGUUUUAGACUGAUAAGCUA。
本发明具有以下有益效果：
本发明基于CRISPR系统的检测原理提供的免反转录的RNA检测方法兼具高特异性、结果判读简单、操作简便、检测准确、通用性良好、检测成本低等技术优势。可以满足环境及仪器配置有限的地区的检测需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为传统sgRNA与劈裂自组装型sgRNA介导的Cas9功能激活比较图；
图2为劈裂位点的位置和电泳结果图（A为位点所在位置，其中两个茎位点S1和S2，两个环位点Hp1和Hp2；B为不同位置劈裂后，通过对质粒切割进行功能验证）；
图3为自组装PAGE电泳结果和荧光验证结果图（A为PAGE结果，其中T为靶标序列，P1为sgRNA-P1，P2为sgRNA-P2，Mix为自组装结果。B为荧光验证结果，其中，Mix-T为靶标存在时的组装，Mix-Non-T为不含有靶标时的组装）；
图4为自组装浓度和比例的荧光验证结果图（A，自组装中sgRNA-P1和sgRNA-P2的浓度比例优化，浓度分别为空白、1 nM、10 nM、50 nM、100 nM和500 nM；B为自组装比例优化荧光验证结果，其中sgRNA-P1和sgRNA-P2比例包括空白、0.5：1、1：1、1：1.5和1：2）；
图5为自组装浓度和比例的荧光验证结果图（A为缓冲溶液中Mg2+浓度优化结果图，浓度分别为空白、50 μM、500 μM、1 mM、5 mM和10 mM；B为反应温度优化荧光结果图，其中温度包括20°C、25°C、30°C、37°C、42°C和50°C）；
图6为针对microRNA-21为目标RNA的免反转录的检测方法的标准曲线以及测量值的验证结果图（A，荧光强度随浓度的标准曲线，浓度分别为10nM、50nM、100nM、500nM、1000nM和10000nM；B为理论值与样品测量值对照结果，其中理论结果分别为80nM和800nM）；
图7为针对microRNA-21为目标RNA的免反转录的检测方法的特异性验证结果；
图8为针对microRNA-155为目标RNA的免反转录的检测方法的标准曲线以及测量值的验证结果图（A，荧光强度随浓度的标准曲线，浓度分别为10nM、50nM、100nM、500nM、1000nM和10000nM；B为理论值与样品测量值对照结果，其中理论结果分别为80nM和800nM）；
图9为针对microRNA-155为目标RNA的免反转录的检测方法的特异性验证结果。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种以microRNA-21为目标RNA的免反转录的检测方法，检测原理参照图1的下图所示，具体包括如下步骤：
根据miRNA-21序列的碱基排列顺序设计sgRNA-P1和sgRNA-P2，具体序列信息如下表。所有RNA和DNA序列均由上海生工公司合成。
dsDNA由F-ssDNA和Q-ssDNA通过退火反应形成的。首先将F-ssDNA和Q-ssDNA混合在20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2的缓冲液中，95°C反应5分钟，静置降到适温后，-4°C保藏。
（1）RNA识别捕获元件（sgRNA-P1和sgRNA-P2）的构建：
对最优劈裂位点进行延长设计得到两条捕获臂（sgRNA-P1和sgRNA-P2），利用在线结构分析软件分析，避免过多二级结构产生。
最优劈裂位点验证方法如下：通过在sgRNA两个茎环结构处进行劈裂验证。设计4个位点，包括两个茎位点（S1和S2），两个环位点（Hp1和Hp2），具体位置如图2所示。在该位点进行劈裂后，进行序列延长得到捕获片段，通过添加靶标进行质粒切割验证。在Hp1位点劈裂后，可对质粒分子有效切割。其他位点包括环位点Hp2、茎位点S1和S2劈裂后，无法更好地激活Cas9活性，不能高效切割质粒分子。
外源添加miRNA-21，在37℃、pH 7.5、10 mM镁离子条件下进行“三元”自组装（100nM的sgRNA-P1、100 nM的sgRNA-P2和500 nM的miRNA-21），采用PAGE电泳技术和荧光共振能量转移技术对自组装效率进行验证（图3）。图3中A可看出miRNA-21存在的情况下，可以成功组装。由于分子量变大，迁移速率变慢。同样，图3中B荧光结果也可以看出，靶标（miRNA-21）存在时，可以触发自组装导致P1荧光强度被P2淬灭。
（2）优化RNA自组装链的浓度、比例、缓冲条件、结合温度参数。
具体实验方法和步骤如下。
为使所构建的方法具有最佳检测性能，对几个关键的实验参数进行了优化。首先对自组装链的浓度进行了优化，在50 μL反应体系中按照摩尔浓度比为1：1的比例加入sgRNA-P1和sgRNA-P2，设置4个浓度的反应体系，4个浓度的反应体系中分别添加1 nM、10nM、100 nM和500 nM的sgRNA-P1，反应30-60分钟后，进行荧光验证，结果如图4中A。随着自组装链浓度的不断增加，双链报告子逐渐被切割。在10 nM时，由于自组装链浓度相对较低，使激活的Cas9活性较弱，切割产物较少。当自组装链浓度超过100 nM后，切割产物的量逐渐达到平稳。然而，当浓度过大时，会抑制反应体系内的Cas9蛋白活性，使切割产物量有所降低。因此，选取100 nM作为反应体系中自组装链的最佳浓度。
随后，对自组装链P1：P2的比例进行了优化，在100 nM总浓度的前提下，设置了五个比例梯度，包括P1：P2为0.5:1、1：1、1：1.5和1：2，结果如图4中B所示。组装链比例为0.5:1时，由于靶标捕获连较少，导致切割产物量较少。随着比例的不断增加，在1：1时切割产物量达到最高。再继续增加捕获连含量后，切割产物出现较少现象，这可能是由于自组装链发生分子内的自折叠，降低了靶标捕获的有效自组装结构。
对实验缓冲溶液中Mg2+浓度进行了优化，设定P1和P2浓度为100nM，比例为1：1。从图5中A的DPV结果可以看出，随着Mg2+浓度不断增加，荧光强度不断增强，在5 mM达到最大。当浓度继续增加时，荧光信号开始减弱，这是Mg2+浓度过大干扰了自组装效率，使得信号降低。因此5 mM为最佳Mg2+浓度进行后持续实验。随后对反应温度进行了进一步优化，通过设置不同反应温度进行反应，最后通过荧光信号进行分析。设计温度从温度包括20°C、25°C、30°C、37°C、42°C和50°C，具体结果如图5中B所示。当温度达到Cas蛋白最适反应温度时，检测荧光信号达到最高，因此确定最佳反应温度为37℃。
（3）荧光自淬灭的双链DNA报告子(dsDNA-FQ)构建：利用碱基互补配对原则，设计能够自折叠成双链茎环结构的单链DNA；在两条单链上设计5’-FAM和3’-BHQ1，利用荧光共振能量转移原理分析切割关系。
综上，根据上述对于劈裂位点选择和设计的研究、构建方法的条件优化以及荧光自淬灭双链DNA报告子的构建，构成了整个针对RNA的免反转录检测方法，本实施例提供了如下的针对microRNA-21为目标RNA的免反转录的检测方法，具体包括如下步骤：
首先对本方法灵敏性进行了分析，将梯度稀释的miRNA-21序列（10nM、50nM、100nM、500nM、1000nM和10000nM）加入到20μL含有100nM的sgRNA-P1和sgRNA-P2的缓冲液（20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 无RNA酶水），37°C自组装反应15分钟。
然后将此20μL反应产物加入到60μL的含有10 nM的Cas9蛋白和50 mM的dsDNA-FQ缓冲液（20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA）中，反应30分钟。
最后通过荧光光谱仪或酶标仪进行荧光强度的检测。激发波长为485nm，发射波长520nm。标准曲线和检测结果如图6所示，拟合曲线R2达到98.49%。通过配置80nM和800nM两个浓度样品作为测试的理论值，通过本方法测出荧光强度进行计算得到测量值如图6中B，分别为81.39和766.71测量值与理论值接近。
通过添加与miRNA序列不一样的非同源序列，进行自组装特异性分析。通过人工合成荧光修饰的双链靶标底物（dsDNA），与Cas9和“三元”自组装体进行孵育1小时，测量反应产物荧光信号强度，验证自组装体激活Cas9蛋白活性的能力。利用本方法对靶标miRNA-21、miRNA-155、let-7a，单碱基错配、两碱基错配和三碱基错配的miRNA-21进行检测。
结果如图7所示。本方法可有效并且三碱基错配情况下可以进行分辨，对单碱基和两错配未能很好区分。可准确检出miRNA-21，对非同源性的miRNA-155和let-7a无法检出，说明本方法具有较好特异性。
实施例2
本实施例提供了一种以microRNA-155为目标RNA的免反转录的检测方法，具体包括如下步骤：
根据miRNA-155序列的碱基排列顺序设计sgRNA-P1和sgRNA-P2，具体序列信息如下表。所有RNA和DNA序列均由上海生工公司合成。
dsDNA由F-ssDNA和Q-ssDNA通过退火反应形成的。首先将F-ssDNA和Q-ssDNA混合在20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2的缓冲液中，95°C反应5分钟，静置降到适温后，-4°C保藏。
首先对本方法灵敏性进行了分析，将梯度稀释的miRNA-155序列（10nM、50nM、100nM、500nM、1000nM和10000nM）加入到20uL含有100nM的sgRNA-P1和sgRNA-P2的缓冲液（20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 无RNA酶水），37°C自组装反应15分钟。
然后将此20uL反应产物加入到60 uL的含有10 nM的Cas9蛋白和50 mM的dsDNA-FQ缓冲液（20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA）中，反应30分钟。
最后通过荧光光谱仪或酶标仪进行荧光强度的检测。激发波长为485nm，发射波长520nm。标准曲线和检测结果如图8所示，拟合曲线R2达到99.31%。通过配置80nM和800nM两个浓度样品作为测试的理论值，通过本方法测出荧光强度进行计算得到测量值如图8中B，分别为85.72和803.16，测量值与理论值接近。
随后对于本方法的特异性进行了分析，利用本方法对靶标miRNA-155、miRNA-21、let-7a，单碱基错配、两碱基错配和三碱基错配的miRNA-155进行检测，结果如图9所示。本方法可有效并且三碱基错配情况下可以进行分辨，对单碱基和两错配未能很好区分。可准确检出miRNA-155，对非同源性的miRNA-21和let-7a无法检出，说明本方法具有较好特异性。
综上，采用本发明提供的检测方法，结合RNA快速提取试剂盒可以对目标RNA进行免反转录检测，可以简化检测流程，降低检测检测成本。本发明利用CRISPR系统的高特异性结合RNA自组装的优势，使检测方法保证了高特异性的同时还具有结果判读简单、操作简便、检测准确等特点。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种RNA免反转录的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：将待测RNA序列、sgRNA-P1和sgRNA-P2进行混合反应，再将Cas蛋白和带有荧光标记物的双链DNA序列与所述混合反应后的产物混合，反应后检测反应产物中的荧光标记物的荧光强度；
所述sgRNA-P1的结构包括：5’-第二序列-第一序列-3’；所述第一序列与所述待测RNA序列的5’端的序列反向互补配对；所述第二序列为tracrRNA序列；
所述sgRNA-P2的结构包括：5’-第五序列-第四序列-第三序列-3’；其中所述第五序列与所述待测RNA序列的5’端的序列反向互补配对；所述第三序列与所述双链DNA序列的其中一条链反向互补配对；所述第四序列与sgRNA-P1的部分所述第二序列反向互补配对，且所述第四序列的长度≥6bp；
所述双链DNA由能够自发互补成双链结构的单链DNA形成。
2.根据权利要求1所述的RNA免反转录的检测方法，其特征在于，所述待测RNA序列为单链RNA序列；
所述待测RNA序列选自microRNA、解链后的siRNA、piRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、SLRNA、scRNA、SRPRNA和mRNA-like的非编码RNA中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的RNA免反转录的检测方法，其特征在于，所述sgRNA-P1和sgRNA-P2通过如下方式获得：
以待劈裂的sgRNA的3’端的第一个发夹结构中的任意位置为劈裂位点，然后将包括tracrRNA的序列与第一序列组合获得sgRNA-P1；
以来源于tracrRNA的功能性区域的序列作为第四序列，与第三序列和第五序列进行组合获得sgRNA-P2；
所述第一序列的长度为10-15bp，所述第五序列的长度为10-15bp。
4.根据权利要求3所述的RNA免反转录的检测方法，其特征在于，所述劈裂位点位于待劈裂的sgRNA序列5’端起第39位-第40位碱基之间。
5.根据权利要求1所述的RNA免反转录的检测方法，其特征在于，所述sgRNA-P1和sgRNA-P2的混合摩尔比为(0.5-1):(1-2)；所述sgRNA-P1与Cas蛋白和带有荧光标记物的双链DNA序列的混合摩尔比为(0.8-1):(0.8-1):(2-3)。
6. 根据权利要求5所述的RNA免反转录的检测方法，其特征在于，所述待测RNA序列、sgRNA-P1和sgRNA-P2在 25-40 ℃、pH 7.5、10 mM镁离子条件下进行“三元”自组装反应；反应时间为10-20分钟；
所述Cas蛋白为Cas9蛋白；
所述Cas蛋白和带有荧光标记物的双链DNA序列与混合反应后的产物混合后的反应条件为：20-40℃，反应20-40分钟。
7.根据权利要求1所述的RNA免反转录的检测方法，其特征在于，所述荧光标记物为荧光报告基团和/或荧光淬灭基团；
所述双链DNA序列的其中一条链标记有荧光报告基团，所述双链DNA序列的另一条链标记有荧光猝灭基团，所述荧光报告基团选自HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、Texas Red、NED、Alexa Flour和VIC中的任一项，所述荧光猝灭基团选自MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和QSY中的任一项。
8.根据权利要求1所述的RNA免反转录的检测方法，其特征在于，所述tracrRNA的序列如SEQ ID NO.1所示；所述sgRNA-P2的第四序列为：GGUUUUAGA，所述sgRNA-P2的第三序列如SEQ ID NO.4所示。
9.根据权利要求1所述的RNA免反转录的检测方法，其特征在于，对目标RNA样本进行定量检测的方法包括：采用所述RNA免反转录的检测方法获得已知RNA含量的同一种RNA的荧光强度，并绘制RNA含量与荧光强度的标准曲线；根据目标RNA样本的荧光强度在标准曲线上获得对应的RNA含量。
10.一种检测microRNA-21或microRNA-155的检测试剂或试剂盒，其特征在于，用于检测microRNA-21的检测试剂或试剂盒包括：如SEQ ID NO.5所示的sgRNA-P1、如SEQ ID NO.6所示的sgRNA-P2；
用于检测microRNA-21的检测试剂或试剂盒还包括如SEQ ID NO.7-8所示的双链DNA；
用于检测microRNA-155的检测试剂或试剂盒包括：如SEQ ID NO.9所示的sgRNA-P1、如SEQ ID NO.10所示的sgRNA-P2；用于检测microRNA-21的检测试剂或试剂盒还包括如SEQID NO.7-8所示的双链DNA。
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