CN106834508A

CN106834508A - 一种连接反应引发的超分支滚环扩增检测miRNA的方法

Info

Publication number: CN106834508A
Application number: CN201710162311.1A
Authority: CN
Inventors: 周翔; 刘奕侬; 王少儒; 田沺; 张小娥; 黄俊捷; 杨伊文
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2017-06-13

Abstract

本发明公开了一种连接反应引发的超分支滚环扩增检测miRNA的方法，属于分子生物学和核酸化学领域。本发明方法主要由三部分组成；第一部分是5'端磷酸化的锁式探针的两末端与靶标miRNA互补配对后利用SplintR连接酶连接成环；第二部分是超分支滚环扩增，锁式探针成环后作为模板、靶标miRNA作为引物，在phi29 DNA聚合酶的作用下发生线性滚环扩增，通过引入二级引物，使线性滚环扩增沿着支链方向发展，达到信号进一步放大；第三部分是往滚环扩增产物中加入SYBR GREEN I染料进行检测。本发明操作简单、成本较低、体系单一、灵敏度高、无背景荧光信号干扰，适于复杂生物环境中miRNA的检测。

Description

一种连接反应引发的超分支滚环扩增检测miRNA的方法

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸化学领域，具体涉及一种连接反应引发的超分支滚环扩增检测miRNA的方法。

背景技术

miRNA（微小RNA）是一类由内源基因编码的长度约为18-25个核苷酸的非编码单链核糖核酸分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。miRNA与siRNA有着类似的长度，并且都是由Dicer酶剪切而来。但不相同的是，成熟的miRNA是由原始的pri-miRNA加工一次形成pre-miRNA（微小RNA前体）后，再被加工形成成熟的miRNA，这些加工过程需要Dorsha酶和Dicer酶。在生物学功能方面，miRNA与靶信使RNA完全互补配对结合，会导致靶基因的信使RNA被降解，如果部分互补配对，会抑制信使RNA的表达。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。越来越多的证据表明miRNA在广泛的生物学过程中发挥着重要的调控作用，包括细胞的早期发育、细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡、造血功能以及免疫系统等。

miRNA因其表达含量低，家族序列间具有高度的同源性使其检测面对很大的挑战。目前发展的几类检测方法各有其优劣。如Northern blotting，是基于杂交的原理检测miRNA，该方法耗时长，一般需要几天，并且需要的样品量较大。RT-qPCR是应用最为广泛的检测方法，其灵敏度高，检测线性范围广；但是，该方法需要昂贵的实时荧光定量PCR仪，且操作较为复杂，引物设计对结果影响较大。基于芯片和新材料的检测方法，为miRNA的检测打开了新的大门，但是这需要特殊的方法制造芯片或者材料，并不适合大部分实验室或者临床上使用。

基于酶扩增的方法为信号放大提供了新的道路。滚环扩增是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。以环状DNA为模板，通过一个短的引物，在酶催化下将脱氧核糖核苷转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段。超分支滚环扩增即是在单链扩增产物DNA的基础上，增加一条与之互补配对的单链引物，引发二次扩增。对信号实现进一步放大。但是在这之前，需要先连接锁式探针成环作为扩增的模板，因此连接反应的效率也是影响检测灵敏度的重要因素。之前的研究中，广泛使用T4 DNA连接酶，但是在miRNA作为模板连接锁式探针的连接反应中，连接效率却并不十分理想。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种连接反应引发的超分支滚环扩增检测miRNA的方法，该方法能够高灵敏地检测miRNA。

本发明的的目的通过下述技术方案实现：

一种连接反应引发的超分支滚环扩增检测miRNA的方法，主要由三部分组成。第一部分是5'端磷酸化的锁式探针的两末端与靶标miRNA互补配对后利用SplintR连接酶连接成环；第二部分是超分支滚环扩增，锁式探针成环后作为模板、靶标miRNA作为引物，在phi29 DNA聚合酶的作用下发生线性滚环扩增，通过引入二级引物，使线性滚环扩增沿着支链方向发展，达到信号进一步放大；第三部分是往滚环扩增产物中加入SYBR GREEN I染料进行检测。

所述的5'端磷酸化的锁式探针根据靶标miRNA设计合成，该探针的两端序列分别与靶标miRNA互补配对，中间非互补配对的序列长度优选为35-40个碱基。所述的二级引物能与线性滚环扩增产物互补配对，其序列优选与锁式探针成环后的20-25个碱基序列相同，但不与靶标miRNA完全互补配对。

本发明的检测原理如图1所示。靶标miRNA能与5'端磷酸化的锁式探针的两末端互补配对，SplintR连接酶可识别该缺口并将其连接成环，形成靶标：锁式探针杂合体。以该环状DNA作为模板，靶标miRNA作为引物，引入二级引物，在phi29 DNA聚合酶催化下，引发超分支滚环扩增，得到大量含双链DNA和单链DNA的扩增产物。扩增产物可与荧光染液SG I结合，524nm可以检测到荧光信号增强。且荧光强度随着靶标浓度的增加而增强，可实现定量检测。

优选的，所述的连接反应引发的超分支滚环扩增检测miRNA的方法包括如下步骤：

（1）在连接体系中加入连接酶缓冲液、5'端磷酸化的锁式探针、待检样品、SplintR连接酶和水进行连接反应。连接反应的条件优选为16-37℃孵育15-30mins。

（2）向上一步体系加入phi29 DNA聚合酶缓冲液、二级引物、phi29 DNA聚合酶、dNTPs和水进行滚环扩增反应，反应结束后对酶进行灭活。滚环扩增反应的条件优选为30-37℃孵育6-8小时，灭活的条件优选为60-70℃ 10-20mins灭活。

（3）向上一步得到的滚环扩增产物加入SYBR GREEN I染料，避光孵育后测荧光，荧光激发波长488nm，发射波长524nm；靶标miRNA存在的情况下荧光强度增强，且荧光强度随着miRNA浓度增加而增强。避光孵育的条件优选为25-37℃避光孵育5-10mins。

本发明的优点和有益效果在于：

（1）本发明使用了一种新型连接酶，该酶大大缩短了连接时间，并且提高了连接效率，提高了检测的灵敏度。

（2）本发明用到的DNA都是普通无荧光标记的DNA，是在扩增产物中加入荧光染料进行定量检测。不仅避免了背景荧光信号的干扰，而且大大降低了检测成本。

（3）本发明操作简单、成本较低、体系单一，适于复杂生物环境中miRNA的检测。

附图说明

图1是本发明连接反应引发的超分支滚环扩增检测miRNA的工作原理图。

图2是不同浓度miRNA21检测的荧光光谱图。

图3是荧光强度与miRNA21浓度的关系图。

图4是针对miRNA21的锁式探针、二级引物对不同miRNA的检测结果图。

图5是连接温度对miRNA检测的影响结果图。

图6是SplintR连接酶和T4 DNA连接酶连接效率的对比结果图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例以miRNA21（序列为5'-uagcuuaucagacugauguuga-3'）作为检测靶标。

1、5'端磷酸化锁式探针P-21、二级引物S-1的设计合成

（1）5'端磷酸化锁式探针P-21序列为：

5'-CTGATAAGCTATTTGCATTTCAGTTTACGGTTTAGCATTTCGCAATTTTTCAACATCAGT-3'。

其中，两端标下划线的序列可与miRNA21（miR-21）分别互补配对，中间是一段序列长为38个碱基长度。

（2）二级引物S-1序列为：5'-AGTCTGATAAGCTA TTTGCA-3'，与磷酸化锁式探针部分序列相同，可与线性滚环扩增产物互补配对，从而引发超分支滚环扩增。

2、miRNA21的检测

（1）连接反应

在10μL连接反应体系中，加入10nmol/L的磷酸化锁式探针P-21，一系列浓度梯度的miRNA（0fmol/L，1fmol/L，5fmol/L，10fmol/L，50fmol/L，100fmol/L，500fmol/L，1pmol/L，5pmol/L，10pmol/L），1μL 10×SplintR连接酶缓冲液，20U RNase inhibitor，用无酶水补齐至9μL，55℃加热5分钟，缓慢降温至37℃，然后在37℃下预孵育30分钟后加入1.25USplintR连接酶（1μL），37℃孵育15分钟。

（2）超分支滚环扩增

在上一步连接体系中直接加入2μL 10×Phi 29 DNA聚合酶缓冲液，500μmol/L dNTPs，200 nmol/L二级引物S-1，2U Phi29 DNA聚合酶，加入无酶水补齐至20μL，30℃孵育6h。

将上述得到的产物转移至175μL去离子水中，再加入5μL 20×SYBR GREEN I染液，混匀后25℃避光孵育10分钟，然后检测体系524nm处的荧光强度。结果见图2、3，可检测到低至1fmol/L 的miRNA21；随着miRNA21浓度增加，荧光强度逐渐增强。

3、特异性检测

特异性检测所用到的其他miRNA如下：

miR-141：5'-uaacacugucugguaaagaugg-3'，

miR-155：5'-uuaaugcuaaucgugauaggggu-3'，

miR-199a：5'-acaguagucugcacauugguua-3'，

miR-429：5'-uaauacugucugguaaaaccgu-3'，

let-7a：5'-ugagguaguagguuguauaguu-3'。

所用探针及二级引物、方法等均同miRNA21的检测，所用miRNA浓度均为1pmol/L。结果见图4，图中，all是以上五种阴性对照miRNA（miR-141，miR-155，miR-199a，miR-429，let-7a）的混合物，all-21是五种阴性对照miRNA加miR-21的混合物。只有检测体系是靶标miR-21或者含有靶标miR-21时，才有明显的荧光增强。并且在复杂的混合样品中，也能成功检测到靶标miRNA的存在。

4、连接温度的影响

改变连接反应中预孵育及孵育的温度，从而探究温度对于检测结果的影响。

在10μL连接反应体系中，加入10nmol/L的磷酸化锁式探针P-21，1pmol/L miR-21，1μL 10×SplintR连接酶缓冲液，20U RNase inhibitor，用无酶水补齐至9μL，55℃加热5分钟，分别缓慢降温至16℃、25℃以及37℃预孵育30分钟，再加入1.25U SplintR连接酶（1μL），分别在16℃、25℃以及37℃孵育15分钟。最后检测结果如图5，图中，F表示在该温度条件下实验组（即1pmol/L miR-21）的荧光强度，F₀表示在该温度条件下空白对照组（即0pmol/LmiR-21）的荧光强度。分别计算16℃、25℃、37℃所得实验组荧光强度与空白对照组的比值（F/ F₀），37℃获得最高的F/F₀比值，因此37℃为最佳连接条件。

5、比较SplintR连接酶和T4 DNA连接酶连接效率的比较

在10μL连接反应体系中，加入1μmol/L磷酸化锁式探针P-21，100nmol/L miR-21，分别加入1μL 10×SplintR连接酶缓冲液或1μL 10×T4连接酶缓冲液，20U RNase inhibitor，用无酶水补齐至9μL，55℃加热5分钟，缓慢降温至37℃，然后在37℃下预孵育30分钟后加入1.25U SplintR连接酶或1.25U T4 DNA连接酶（1μL），37℃孵育15分钟后。用20%中性聚丙烯酰氨凝胶电泳分析，120v电泳1h 30min后，所得结果如图6所示，泳道1：miR-21 marker，泳道2：锁式探针P-21 marker，泳道3：在SplintR连接酶催化下的连接产物，泳道4：在T4 DNA连接酶催化下的连接产物。可以看到，只有泳道3有连接产物生成。证明在同等酶活力单位及同样反应条件下，SplintR连接酶表现出比T4 DNA连接酶更强的连接活性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 一种连接反应引发的超分支滚环扩增检测miRNA的方法

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5'端磷酸化锁式探针P-21

<400> 1

ctgataagct atttgcattt cagtttacgg tttagcattt cgcaattttt caacatcagt 60

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 二级引物S-1

<400> 2

agtctgataa gctatttgca 20

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

uagcuuauca gacugauguu ga 22

Claims

1.一种连接反应引发的超分支滚环扩增检测miRNA的方法，其特征在于：主要由三部分组成；第一部分是5'端磷酸化的锁式探针的两末端与靶标miRNA互补配对后利用SplintR连接酶连接成环；第二部分是超分支滚环扩增，锁式探针成环后作为模板、靶标miRNA作为引物，在phi29 DNA聚合酶的作用下发生线性滚环扩增，通过引入二级引物，使线性滚环扩增沿着支链方向发展，达到信号进一步放大；第三部分是往滚环扩增产物中加入SYBR GREENI染料进行检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的5'端磷酸化的锁式探针的两端序列分别与靶标miRNA互补配对；所述的二级引物能与线性滚环扩增产物互补配对，但不与靶标miRNA完全互补配对。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)在连接体系中加入连接酶缓冲液、5'端磷酸化的锁式探针、待检样品、SplintR连接酶和水进行连接反应；

(2)向上一步体系加入phi29 DNA聚合酶缓冲液、二级引物、phi29 DNA聚合酶、dNTPs和水进行滚环扩增反应，反应结束后对酶进行灭活；

(3)向上一步得到的滚环扩增产物加入SYBR GREEN I染料，避光孵育后测荧光，荧光激发波长488nm，发射波长524nm；靶标miRNA存在的情况下荧光强度增强，且荧光强度随着miRNA浓度增加而增强。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的连接反应的条件为16-37℃孵育15-30mins。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，滚环扩增反应的条件为30-37℃孵育6-8小时，灭活的条件为60-70℃10-20mins灭活。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的避光孵育的条件为25-37℃避光孵育5-10mins。