CN101591709A

CN101591709A - 用于小rna检测的探针组以及用此探针组检测小rna的方法

Info

Publication number: CN101591709A
Application number: CNA2009100844748A
Authority: CN
Inventors: 席建忠; 姚波; 李娟�
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2009-05-19
Filing date: 2009-05-19
Publication date: 2009-12-02

Abstract

本发明涉及一种用于小RNA检测的探针以及用此探针检测小RNA的方法，属于小RNA的检测领域。本发明的用于检测小RNA的DNA探针组由至少两个探针组成，所述至少两个探针连接起来以后，包括所有连接点在内的一段核苷酸序列与目标小RNA分子的核苷酸序列互补。本发明的检测小RNA的方法包括将所述探针与目标小RNA杂交、在连接酶的作用下连接，最后通过凝胶电泳或者实时聚合酶链式反应等检测目标小RNA。本发明的检测小RNA的方法具有灵敏度高、动态范围大、抗干扰能力强以及廉价等优点，在与小RNA探测相关的科学实验、临床诊断等多个领域具有广阔的应用前景。

Description

用于小RNA检测的探针组以及用此探针组检测小RNA的方法

技术领域

本发明涉及小RNA的检测领域。

背景技术

小RNA是非编码RNA家族(noncoding RNA，简称ncRNA)中的重要组成部分，包括微小RNA(microRNA或miRNA)、小型干扰RNA(siRNA)、小核RNA、小时序RNA，piwi蛋白结合RNA(piRNA)等。研究发现小RNA在生物体内细胞、组织等的发育、生长、分化，甚至疾病的发生以及病毒的入侵和防御等方面发挥至关重要的作用。小RNA发挥作用的方式也是多种多样，它们既可以通过修饰DNA直接调控基因的表达，也可以通过改变基因转录产物的稳定性等来调节蛋白的量等等。而在各种类型的小RNA中，微小RNA又是功能最为重要的一种。

微小RNA是生物体内源的长度为18-25个核苷酸的一种非编码RNA分子。它们广泛地分布在不同的器官中，主要是通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。在过去十年中，科学家们从海藻到动物体内分离鉴定出了数千种保守的和非保守的miRNA。虽然很多证据清楚地表明miRNA在增殖、发育、肿瘤发生以及病毒感染等一系列生物学过程中充当很重要的角色，但是我们对miRNA生理学功能的了解还很少。要想揭开miRNA在复杂的基因表达调控网络中的角色这块神秘的面纱，就需要发展灵敏、准确的miRNA检测方法。

然而，由于miRNA很短，而且一些miRNA成员之间具有非常相似的序列(例如let-7家族系列)，检测miRNA是一项非常有挑战性的工作。虽然在早期的miRNA剖面测量研究中，Northern印迹法被当作一种黄金标准方法，但是它费时费力，需要大量的总RNA样本，尤其是当检测低丰度miRNA的表达的时候，Northern方法就显得非常困难。除Northern印迹法之外，近年也发展出了大量其他的miRNA检测方法。在这些方法中，实时聚合酶链式反应(Real-Time PCR)毫无疑问是一种准确、定量检测基因表达的强大工具。如前所述，由于miRNA长度太短，以至于不能通过PCR方法直接来扩增，为克服这些困难，科学家们通过在miRNA尾部连接多个腺嘌呤(A)来延长miRNA(Shi，R.；Chiang，V.L.Bio techniques 2005，39，519-525.)，或者使用长的DNA探针(Chen，C.；Ridzon，D.A.；Broomer，A.J.；Zhou，Z.；Lee，D.H.；Nguyen，J.T.；Barbisin，M.；Xu，N.L.；Mahuvakar，V.R.；Andersen，M.R.Nucleic Acids Res.2005，33，e179.；Raymond，C.K.；Roberts，B.S.；Garrett-Engele，P.；Lim，L.P.；Johnson，J.M.RNA2005，11，1737-1744.)。然而，这些方法需要使用Taqman或者LNA等改良的探针来保证检测的特异性，从而显著增加了制备的困难性和实验成本。

发明内容

本发明的目的正是为了解决上述技术问题，提供一种易于制备的小DNA检测探针，以及使用此探针检测小RNA的简单、灵敏、精确且低成本的方法。

在本发明中，术语“小RNA”指的是核苷酸数目少，不方便直接用PCR技术扩增的RNA，包括但不限于微小RNA(microRNA，简称miRNA)、小型干扰RNA(short interfering RNA，简称siRNA)、小核RNA(small nuclear RNA，简称snRNA)、小时序RNA(small temporal RNA，简称stRNA)、piwi蛋白作用的RNA(Piwi-interacting RNA，简称piRNA)等。本发明的实施例中涉及的都是miRNA，但是本领域技术人员可以预见到，本发明的检测探针以及使用此探针检测小RNA的方法并不限于miRNA，而应当理解为上面定义的“小RNA”。

在本发明中，术语“杂交”指的是一个单链核酸分子的至少一部分与另外一个单链核酸分子的至少一部分通过碱基配对形成一条双链核酸分子。上述碱基配对可以是完全匹配的碱基配对，也可以是不完全匹配的碱基配对。其中如出现碱基不匹配的时候，只要探针分子能在目标小RNA分子的介导(存在)下，通过连接酶的作用，连接成为一条完整的核酸链，也属于本发明所称的“杂交”。

术语“探针”指的是根据目标RNA分子的核苷酸序列，设计、制备出的一段能与目标RNA分子至少部分核苷酸序列杂交的DNA分子。

术语“连接产物”是指至少两个DNA探针分子与目标小RNA分子的互补配对后，在连接酶的作用下，连接形成的一条完整的DNA链。

本发明是通过如下的技术方案实现的。先合成DNA探针分子，在小RNA的检测过程中，探针分子是多个一起使用的，多个一起使用的探针分子连接起来以后，包括所有连接点在内的一段核苷酸序列能与目标小RNA分子的至少一部分核苷酸序列杂交；优选两个一起使用或者三个一起使用，两个一起使用的探针分子连接起来以后，连接点左右的一段核苷酸序列能与目标小RNA分子的至少一部分核苷酸序列互补；三个一起使用的探针连接起来以后，包括两个连接点的一段核苷酸序列能与目标小RNA分子的至少一部分核苷酸序列互补。优选的，探针具有至少一个茎环结构。进一步优选的，两个一起使用的探针在茎环结构打开之前连接起来，包括连接点的一段核苷酸序列不能与目标小RNA分子的核苷酸序列杂交；三个(或多个)一起使用的探针在茎环结构打开之前连接起来，包括两个连接点的一段核苷酸序列不能与目标小RNA分子的核苷酸序列杂交。探针合成好以后，将探针分子加入到含有目标miRNA分子的体系中，如果探针分子不具有茎环结构，则两个(或多个)一起使用的探针分子与目标miRNA分子杂交(如图2所示)，在连接酶(如T4DNA连接酶)的作用下，两个(或多个)与目标miRNA分子杂交的探针分子在2d处连接起来，成为一条完整的链；如果探针分子具有茎环结构(如图3所示)，则先通过升温将探针分子的茎环结构打开，然后再缓慢地降温，在这个缓慢降温的过程中，两个(或多个)一起使用的探针分子与目标miRNA分子杂交，而未杂交的探针分子在温度降低之后又重新形成茎环结构，在T4DNA连接酶或其它连接酶的作用下，与目标miRNA分子杂交的两个(或多个)探针分子在3d处连接起来，形成一条完整的链。茎环结构的作用在于，当升温时茎环结构可以打开，当温度降低后，未与目标分子结合的探针分子，将重新形成茎环结构，从而阻止了探针分子之间的自连接反应，可大大减小了背景信号，提高了检测灵敏度。使用具有茎环结构的探针，可以检测到总量低至0.02ng-0.2ng的RNA输入。

连接步骤完成以后，连接产物较目标miRNA分子长度有所增加，可以进行PCR扩增反应；如没有目标miRNA分子存在时，探针分子不能正确连接，因而进行PCR扩增反应时不能给出阳性信号。扩增反应和检测反应符合常规的实时荧光定量聚合酶链式反应要求。简单描述如下：在反应体系中加入SYBR Green I染料、PCR引物，以及PCR反应所需的缓冲液等，对探针连接产物(作为底物)进行PCR扩增反应。同时，由于SYBR Green I染料可以嵌入双链的DNA分子中，荧光信号比嵌入单链DNA时强约1000倍，因此根据PCR的阈值C_T以及标准溶液中模板的拷贝数就可以计算出初始体系中底物的浓度以及目标miRNA分子的浓度。由于SYBR Green I染料比Taqman或者LNA等改良的探针便宜得多，而且SYBRGreen I染料与所有的DNA分子都可以结合，不像Taqman或者LNA等改良的探针需要针对每个目标miRNA分子设计特定的序列，使用本申请的方法检测miRNA可以大大减少成本，增加使用灵活度。

本发明技术方案总结如下：

1.一种用于检测已知序列的小RNA的DNA探针组，其特征在于所述探针组由至少两个探针组成，所述至少两个探针的总核苷酸数目大于等于40，所述至少两个探针连接起来以后，包括所有连接点在内的一段核苷酸序列能与目标小RNA的至少一部分核苷酸序列杂交。

2.根据第1项所述的用于检测已知序列的小RNA的DNA探针组，其特征在于所述至少两个探针连接起来以后，包括所有连接点在内的一段核苷酸序列能与目标小RNA的全部核苷酸序列杂交。

3.根据第1项或第2项所述的用于检测已知序列的小RNA的DNA探针组，其特征在于所述探针组的至少一个探针具有至少一个茎环结构。

4.根据第3项所述的用于检测已知序列的小RNA的DNA探针组，其特征在于组成探针组的探针在所有的茎环结构都未打开的状态下连接起来，包括所有连接点的任意一段核苷酸序列都不能与目标小RNA分子的任意一段核苷酸序列杂交。

5.根据第3项或第4项所述的用于检测已知序列的小RNA的DNA探针组，其特征在于组成探针组的每一个探针都有且仅有一个茎环结构。

6.根据第5项所述的用于检测已知序列的小RNA的DNA探针组，其特征在于具有茎环结构的探针中茎部的核苷酸数目不少于3个。

7.使用第1-6项的任一项所述的用于检测已知序列的小RNA的DNA探针组检测小RNA的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)杂交步骤：在此步骤中，探针分子与目标小RNA分子互补杂交；

(2)连接步骤：在连接酶的作用下，与目标小RNA分子杂交的探针分子之间连接起来，形成一条完整的核酸链；

(3)检测步骤：对连接步骤得到的连接产物进行检测。

8.根据第7项所述的检测小RNA的方法，其特征在于步骤(3)中的检测为凝胶电泳、Northern印记、基因芯片、质谱、聚合酶链式反应。

9.根据第8项所述的检测小RNA的方法，其特征在于所述聚合酶链式反应为实时荧光定量聚合酶链式反应。

10.根据第7项所述的检测小RNA的方法，其特征在于步骤(2)中的连接酶为T4DNA连接酶、T4RNA连接酶、Taq DNA连接酶、9°N DNA连接酶或E.ColiDNA连接酶。

附图说明

图1本发明的小RNA检测方法示意图

图2直链DNA探针结构示意图

图3具有一个茎环结构的DNA探针结构示意图

图4Mmu-mir-122、syn-aa、aga-mir-210、has-mir-549、has-mir-214和has-mir-21等6种miRNA连接反应产物的凝胶电泳图

图5老鼠let-7系列miRNA的检测结果图

图6具有茎环结构的探针组与不具有茎环结构的探针组对比实验结果图

图7茎环结构的作用示意图

图8本发明的小RNA检测方法的灵敏度和动态范围实验结果图

图9通过本发明中的基于酶促连接反应的Real-Time PCR(T4 ligation PCR)以及传统的Real-Time PCR(RT-PCR)对老鼠体内十种组织细胞中的U6表达水平进行检测的结果图，ht：心脏；lv：肝脏；sp：脾脏；In：肺；kd：肾；br：脑；co：结肠；pan：胰脏；ts：睾丸；sm：骨骼肌肉

图10使用本发明的基于酶促连接反应的Real-Time PCR对老鼠体内十种组织细胞中的4种miRNA的检测结果图

具体实施方式

实施例1

直链探针的设计与获取。下面将结合图2详细说明直链探针的设计。图2中的2a为miRNA-122序列示意图，其具有22个核苷酸，长度不够进行PCR扩增。探针2b具有31个核苷酸，2c具有30个核苷酸，当这一对DNA探针先与miRNA-122杂交，然后在T4DNA连接酶的作用下，在2d处连接起来之后，则能形成一个具有61个核苷酸的DNA链，而这个长度足够进行PCR扩增了。试验中用到的DNA探针是通过向中国上海的Invitrogen公司购买的。

实施例2

具有一个茎环结构的探针的设计。下面将结合图3详细说明具有一个茎环结构的探针的设计。图3中的3a为miRNA-122序列示意图，其具有22个核苷酸，长度不够进行PCR扩增。探针3b具有33个核苷酸，3c具有39个核苷酸，这一对探针在温度升高的时候，茎环结构可以打开，成为直链的DNA分子，再与miRNA-122杂交，然后在T4DNA连接酶的作用下，在3d处连接起来之后，则能形成一个具有72个核苷酸的DNA链，这个长度足够进行PCR扩增。

实施例3

miRNA的检测方法。本实施例将利用类似实施例2中的具有一个茎环结构的探针从含有6种miRNA的体系中检测出目标miRNA。6种miRNA分别是Mmu-mir-122、syn-aa、aga-mir-210、has-mir-549、has-mir-214和has-mir-21，其核苷酸序列见图4和表1所示。Mmu-mir-122为目标miRNA。这6种miRNA中，除syn-aa序列为满足本实验而人为设计，其余miRNA序列均从Sanger数据库获得。试验中用的上述6种miRNA都是从上海吉玛制药技术有限公司购得的。图4用着重号示出了5种非目标miRNA核苷酸序列中与目标miRNA相同的部分，由图可见，非目标miRNA中有2-8个核苷酸序列与目标miRNA中相同，这种现象在实际的miRNA检测中经常遇到。我们为Mmu-mir-122设计了两个DNA探针，分别是probe 122-1(简称Sp1)和probe 122-2(PO4)(简称Sp2)，其核苷酸序列见表2(下划线标出的核苷酸序列为与Mmu-mir-122杂交的部分)。分别将1.2×10¹³个上述6种miRNA分子配制成1μL的溶液，得到6个溶液。将25fmol DNA探针(Sp1和Sp2)与上述6个溶液之一混合，在65℃孵育3分钟，缓慢降温至室温(约45分钟)，最后将样品置于冰块上降温以形成异源双链核酸分子结构。至此杂交步骤就已经完成了。酶促连接反应按如下方案进行，准备一个新鲜的缓冲溶液，其组分以及各组分的浓度为：10mM MgCl₂、10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris HCl)、10μM三磷酸腺苷(ATP)、0.5μL Rnase抑制剂(Rnase inhibitor)和70U/μL T4DNA连接酶。将此缓冲溶液加入到上述样品溶液中，使最终溶液体积为10μL，将溶液在16℃孵育过夜，最后加热到70℃并保持20分钟以终结连接反应。将连接反应之后得到的产物用10％的聚丙烯酰胺在200V下进行30分钟凝胶电泳，结果如图4下部所示，两个DNA探针Sp1和Sp2只在目标miRNAMmu-mir-122存在的情况下杂交并连接起来了，而在其他非目标miRNA分子存在的情况下，并不发生连接反应。

实施例4

miRNA的检测方法。本实施例中的实验条件与实施例3中基本相同，只是检测的对象变成了8个核苷酸序列非常接近的老鼠let-7系列的miRNA，包括mmu-let-7a～7g以及mmu-let-7i，其核苷酸序列见图5以及表1。图5中用着重号示出了mmu-let-7b～g以及mmu-let-7i核苷酸序列中与mmu-let-7a不相同的部分，由图5可知，这一组miRNA的核苷酸序列更加接近，因而检测难度也就更大。我们为每一个miRNA都设计了DNA探针组，每个DNA探针组由两个或者三个配合使用的DNA探针组成，相应DNA探针的核苷酸序列见表2，其中用下划线标出的核苷酸序列为与目标miRNA分子杂交的部分。酶促连接反应的试验条件与实施例3中相似，只是用每一组DNA探针检测所有8种miRNA，这样一共有64个连接反应试验。将连接反应完成之后得到的产物进行凝胶电泳分析或者实时聚合酶链式反应(Real-Time PCR)，得到的实验结果分别列于图5b和5c。Real-Time PCR实验操作按如下方案进行：Real-Time PCR是在美国Bio-Rad(伯乐)DNA Engine Opticon 2双色实时PCR仪上进行的，将10μL SYBR Green qPCR Supermix(TransStart)、0.8μL 10μM正向和反向引物(forward and reverse primers)混合，移入酶连接反应的产物作为PCR模板并使最后的混合溶液体积为20μL。将反应体系置于一个96孔板(96-well plate)中，在95℃下孵育2分钟，然后在94℃下15秒、60℃下30秒、72℃下30秒进行40个循环。所有的反应均平行做三次。临界循环数(C_T)定义为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。C代表Cycle，T代表Threshold。

由图5b可以看出，检测结果的特异性很好，只有当用let-7a的探针检测let-7e以及用let-7f的探针检测let-7a的时候，凝胶电泳实验中出现了噪音信号。

由图5c的Real-Time PCR的实验结果来看，检测结果的特异性也非常好。图4c中的数值是这样计算得到的：以第一行为例，用let-7a的探针组检测let-7a～g以及let-7i，得到各自C_T值，将每组所测对象(C_T值最低)的相对表达量设定为100％，其余各miRNA的相对表达量由标准曲线计算得到。由图5c的结果可知，只有用let-7a的探针组检测let-7d和let-7e、用let-7c的探针组检测let-7b以及用let-7f的探针组检测let-7a等4个数值在1％以上。更进一步的，可以设计一组普适的DNA探针分子对一个系列的miRNA分子一起检测。例如，可以用一对DNA探针分子probe let-7-1和probe let-7-2(PO₄)(其核苷酸序列见表2)不加区分地与let-7系列的8个miRNA分子发生连接反应(图5d)，这个特性可能在某些情况下得到应用，例如一个miRNA系列的所有成员一起对一组功能性蛋白的表达起调控作用，因此并不需要区分系列中每个成员的表达水平。

实施例5

DNA探针中茎环结构的作用。为了说明DNA探针中茎环结构的作用，我们为miRNA分子mmu-mir-122设计了两组DNA探针，分别是具有茎环结构的probe 122-1(简称Sp1)、probe 122-2(PO4)(简称Sp2)和不具有茎环结构(即为线性结构)的probe 122-3(简称Lp1)、probe 122-4(PO4)(简称Lp2)，它们的核苷酸序列列于表2中。利用上述两组探针进行如下两个实验：在第一个实验中，分别利用两组探针与mmu-mir-122进行酶促连接反应并随后进行Real-Time PCR扩增；第二个实验与第一个实验条件相同，只是不加入目标miRNA分子mmu-mir-122。实验结果见图6。从图6可以看出来，当体系中有目标miRNA分子mmu-mir-122存在的时候，用两组探针得到的实验结果差不多(图6中的Sp1/2+mir-122和Lp1/2+mir-122)；而当体系中没有目标miRNA分子mmu-mir-122存在的时候，用两组探针得到的实验结果相差较大(图6中的Pure Lp1/2和Pure Sp1/2)。实验结果表明，使用Lp1和Lp2进行检测的情况下，没有mmu-mir-122存在的时候得到的C_T值仅比有mmu-mir-122存在的时候的C_T值大一点，而使用Sp1和Sp2进行检测的情况下，没有mmu-mir-122存在的时候得到的C_T值比有mmu-mir-122存在的时候的C_T值大很多。这表明与直线型的探针相比，使用带有茎环结构的DNA探针可以明显减小探针之间自连接带来的背景噪音。这个结果可以作如下解释：茎环结构的DNA探针在升温-退火的过程中打开茎环并与目标miRNA分子杂交，温度降低之后，未杂交上的DNA探针又会重新形成茎环结构或者与自身杂交，从而由于空间位阻的原因，探针Sp1和Sp2之间的自连接将被抑制(图7)。

实施例6

miRNA前体对miRNA检测的干扰。包含整个成熟miRNA核苷酸序列的miRNA前体可能对miRNA的检测造成干扰。为了研究本发明的miRNA检测方法对miRNA前体的抗干扰能力，我们合成了mir-122和mir-1的前体，合成方法如下：首先将50pmol的正向DNA引物与50pmol的反向DNA引物(序列见表三)混合后75℃加热5分钟，缓慢降到室温进行退火杂交(约30分钟)。接下来进行转录所需的DNA模板合成，在20μL的反应体系中加入上述已经退火好的DNA引物，10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，50mMNaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇(DTT)，2.5μM dNTPs以及5U的Klenow(3’-5’exo)酶，37℃反应1小时候以合成DNA模板。75℃加热20分钟失活Klenow酶，再将溶液缓慢降至室温。

最后是合成实验所需的miRNA前体，具体实验如下，50μL的反应体系中含有20μL上述合成的DNA模板，0.5mM NTPs，40mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，6mM MgCl₂，10mM二硫苏糖醇(DTT)，2mM亚精胺，40～200U RNA酶抑制剂以及50U T7RNA聚合酶，在37℃条件下反应4小时。反应结束后，加入1U的DNAse I酶消化DNA模板，对溶液进行酚氯仿抽提得到提纯的miRNA前体。合成的miRNA前体可以通过2％的琼脂糖凝胶检测其合成质量，使用NanoDrop分光光度计测量其浓度。(dsDNA序列见表3)。

在本实施例中，所有的探针都具有茎环结构。对mir-122，我们使用的DNA探针还是Sp1和Sp2，而对mir-1，我们使用的探针是probe mir-1-1和probe mir-1-2(PO4)(其核苷酸序列见表2)。考虑到通常情况下，miRNA前体的熔点高于75℃，我们在65℃下进行杂交，以保证两个具有茎环结构的探针Sp1和Sp2与miRNA杂交，而不是与对应的miRNA前体杂交。实验结果列于表4中。由表4可以看出，相同数量的miRNA前体只能产生它们对应的成熟miRNA0.2％的信号强度。即便体系中miRNA前体的量是对应成熟miRNA的100倍，miRNA前体也只能贡献小于1.5％的信号强度。这个结果表明，本发明的miRNA检测方法能有效阻止miRNA前体与DNA探针杂交，其对成熟miRNA的检测具有很高的特异性。

实施例8

本发明miRNA检测方法的灵敏度和动态范围。我们用DNA探针Sp1和Sp2与mmu-mir-122进行酶促连接反应并随后进行Real-Time PCR扩增，目标mmu-mir-122分子数从10¹⁰减少到10⁵，扩增图显示了目标分子数的对数与C_T值之间具有非常好的线性关系，从而证明了本发明miRNA检测方法具有至少从10⁵到10¹⁰一共6个log的动态范围(图8a，8b)。另外，针对4种miRNA测试了本发明miRNA检测方法的检测下限，结果示于图8c中。目标miRNA的输入量从2μg减少到0.02ng，在5个数量级的范围内，C_T值与miRNA的输入量之间都呈现出很好的线性关系(R²＞0.994)。由这些结果可知，本发明的miRNA检测方法即便使用总RNA样本的时候，也具有很宽的动态范围和很好的灵敏度。

实施例9

本发明miRNA检测方法与传统real-time RT-PCR(实时荧光定量聚合酶反应)在检测内参RNA的比较。在实时荧光定量聚合酶链式反应中，将不同样本miRNA相对于内参进行归一化对于miRNA的定量测定非常关键。小核RNA(snRNA)U6经常被用来作为传统miRNA或其他RNA检测的内参，我们用本发明中的基于酶促连接反应的Real-Time PCR以及传统的Real-Time PCR对老鼠体内十种组织细胞中的U6表达水平进行了检测，结果示于图9。从图9可以看出，本发明的基于酶促连接反应的Real-Time PCR检测U6结果与传统的Real-TimePCR非常接近。这表明本发明的基于酶促连接反应的Real-Time PCR可以用来定量检测不同组织细胞中的miRNA。

实施例10

使用本发明的基于酶促连接反应的Real-Time PCR方法检测不同组织细胞中的miRNA。检测对象为老鼠体内10种组织细胞中的mir-122、mir-1、mir-34a和let-7a，使用的内参为小核RNA U6。实验结果列于图10，正与预计的结果一样，mir-1主要表达在肌肉中，mir-122主要表达在肝脏中，而mir-34a和let-7a广泛地分布在各种组织细胞中。

附表：

表1，本申请涉及的miRNA核苷酸序列

表2，本申请涉及的DNA探针和PCR前体核苷酸序列

表3，本申请涉及的dsDNA模板核苷酸序列

Pre-mir-1forward 1	TAATACGACTCACTATAGGGAGCTTGGGACACATACTTCTTTATATGCCCATATGAACC
Pre-mir-1forward 1	TAATACGACTCACTATAGGGAGCTTGGGACACATACTTCTTTATATGCCCATATGAACC	Pre-mir-1reverse 1	GCCTGAAATACATACTTCTTTACATTCCATAGCTTAGCAGGTTCATATGGGCATATAAA
Pre-mir-122forward1	TAATACGACTCACTATAGGGAAGCTGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTGTCCA	Pre-mir-1reverse 1	GCCTGAAATACATACTTCTTTACATTCCATAGCTTAGCAGGTTCATATGGGCATATAAA
Pre-mir-122forward1	TAATACGACTCACTATAGGGAAGCTGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTGTCCA	Pre-mir-122reverse 1	AGCTATTTAGTGTGATAATGGCGTTTGATGGTTTGGACACAAACACCATTGTCACACTC

表4，miRNA前体对miRNA检测的干扰

Claims

2.根据权利要求1所述的用于检测已知序列的小RNA的DNA探针组，其特征在于所述至少两个探针连接起来以后，包括所有连接点在内的一段核苷酸序列能与目标小RNA的全部核苷酸序列杂交。

3.根据权利要求1或2所述的用于检测已知序列的小RNA的DNA探针组，其特征在于所述探针组的至少一个探针具有至少一个茎环结构。

4.根据权利要求3所述的用于检测已知序列的小RNA的DNA探针组，其特征在于组成探针组的探针在所有的茎环结构都未打开的状态下连接起来，包括所有连接点的任意一段核苷酸序列都不能与目标小RNA分子的任意一段核苷酸序列杂交。

5.根据权利要求3或4所述的用于检测已知序列的小RNA的DNA探针组，其特征在于组成探针组的每一个探针都有且仅有一个茎环结构。

6.根据权利要求5所述的用于检测已知序列的小RNA的DNA探针组，其特征在于具有茎环结构的探针中茎部的核苷酸数目不少于3个。

7.使用权利要求1-6的任一项所述的用于检测已知序列的小RNA的DNA探针组检测小RNA的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(3)检测步骤：对连接步骤得到的连接产物进行检测。

8.根据权利要求7所述的检测小RNA的方法，其特征在于步骤(3)中的检测为凝胶电泳、Northern印记、基因芯片、质谱、聚合酶链式反应。

9.根据权利要求8所述的检测小RNA的方法，其特征在于所述聚合酶链式反应为实时荧光定量聚合酶链式反应。

10.根据权利要求7所述的检测小RNA的方法，其特征在于步骤(2)中的连接酶为T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶、Taq DNA连接酶、9°N DNA连接酶或E.Coli DNA连接酶。