CN104593496A - 基于杂交连接法检测非编码rna转录水平的方法 - Google Patents

Abstract

一种基于杂交连接法检测非编码RNA转录水平的方法，包括以下步骤：经提取、提纯获得含待检测目标ncRNA的样本液；配制杂交反应体系，使样本液中的待检测目标ncRNA与两个完全互补配对的DNA片段进行杂交，形成ncRNA-oligos杂合链；配制连接反应体系，用T4DNA连接酶对得到的ncRNA-oligos杂合链进行缺口修复，得到含HL-DNA的待检测样本；以上述得到的含HL-DNA的待检测样本为模板，直接用于荧光定量PCR的检测，根据检测结果分析待检测目标ncRNA的转录水平。本发明的方法简便、快速、安全，能准确地进行定量分析待测非编码RNA，提高实验结果的可重现性。

Description

基于杂交连接法检测非编码RNA转录水平的方法

技术领域

本发明涉及一种精确测量非编码RNA转录水平的方法，尤其涉及一种与实时荧光定量PCR联用检测非编码RNA的方法。

背景技术

传统观念认为RNA的主角就是mRNA、rRNA、tRNA这些基因表达的重要组件，有关ncRNA全新功能的发现为生命科学研究带来了一个全新领域，现在越来越多的研究证实RNA可以在生命活动中扮演更多不同的角色。除了基因转录和蛋白质合成，ncRNA还参与到了各种RNA进程、DNA损伤修复以及基因组重排这些生命活动中。随着越来越多的新ncRNA被发现及鉴定出来，它们组成了一个日渐庞大的生物网络，不仅革新了生命科学领域的传统观念，并且展示出在临床应用方面的无限可能，也让生物学家们更加关注ncRNA的功能机制以及它们在人类疾病中所起到的作用。

现在，大多数的人类ncRNA已经被鉴定及测序并且可以在GenBank、NONCODE、还有UCSC等数据库中查找得到。除了蛋白质外，ncRNA会对外界胁迫以及环境刺激产生应答。在受刺激之后的细胞中ncRNA表达量的变化将成为了解细胞应对环境刺激的关键所在。因此，通过分析特定ncRNA的表达水平将有助于识别诊断细胞的状态变化，比如判断其是否处于肿瘤形成期间或正在应对某种外界环境的刺激。那么，与临床参数(如疾病严重等级或治疗效果)相关的ncRNA的稳定表达水平可以作为临床应用相关的生物学指标。所以，一种可以精确测定人体细胞或组织中ncRNA某时期稳定表达水平的方法会是发现ncRNA在健康和疾病中所起到的生物学、病理学以及临床角色的重要工具。

实时荧光定量PCR无疑是定量检测核酸分子的生物技术先驱。大量新发现的细胞调控机制以及对临床诊断和预后生物靶标的不断研究，导致使用此技术发表的论文数目一直都在快速增长中，同时也反映了其在分子生物学领域的重要地位，其常与逆转录联用(RT-qPCR)广泛地应用于ncRNA的表达检测。为了获得始终一致的、生物学相关的qPCR测量值，研究者们必须完成大量复杂的技术步骤、充分解决一系列的质控问题、合理地设置仪器得到精确的扩增图谱，还要选择合适的相关统计学方法分析所得到的数据。

实际上，许多被报道出来的qPCR结果都是无意义的，因为若无法获取反应条件优化、质控过程、数据分析等步骤的具体信息，论文读者也不能将可信结果从一大堆有偏差的数据中区分开来。而这种无意义的qPCR结果往往是由于与逆转录反应联用所产生的，主要是因为逆转录效率严格受到样品本身的质量、样品的制备方法、模板的特性及所采用的分析方法等各因素影响，具有极大的局限性和不稳定性。

在与非编码RNA相关的研究中，检测它转录水平的变化是非常关键的数据。该数据可能表征或预示人类是否健康和处于某种疾病，可以成为临床诊断的依据之一(该数据只是在未来的研究中可能成为临床诊断疾病的一种依据，但与疾病诊断并不构成严格的一一对应关系，且除了用于疾病诊治，该数据还可广泛应用到其他非诊断类的生物医学科研活动中)。实时荧光定量PCR常与逆转录联用(RT-qPCR)广泛地应用于非编码RNA的检测，但由于逆转录非编码RNA的效率不稳定，使许多有重大意义的研究结果都无法重现。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种基于杂交连接法检测非编码RNA转录水平的方法，该方法能简便、快速、安全、准确地进行定量分析待测非编码RNA，且能提高实验结果的可重现性。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种基于杂交连接法检测非编码RNA转录水平的方法，包括以下步骤：

(1)经提取、提纯获得含待检测目标ncRNA的样本液；

(2)配制杂交反应体系，使上述样本液中的待检测目标ncRNA与两个完全互补配对的DNA片段进行杂交，形成ncRNA-oligos杂合链；

(3)配制连接反应体系，用T4DNA连接酶对上述得到的ncRNA-oligos杂合链进行缺口修复，得到含杂交连接DNA(简称HL-DNA)的待检测样本；前述合成HL-DNA的方法可称为“杂交连接法”，所构建的体系可称为“杂交连接检测体系”；

(4)以上述得到的含HL-DNA的待检测样本为模板，直接用于荧光定量PCR的检测，根据检测结果分析待检测目标ncRNA的转录水平。

上述的方法中，优选的，所述步骤(1)中的提取是采用Trizol法，具体包括以下操作：

(1.1)以特定目标细胞为培养对象，培养完成后吸除旧培养液，用预热后的1×PBS清洗目标细胞；

(1.2)使用细胞刮刀将目标细胞刮下、收集，经冷冻离心机离心处理；

(1.3)将离心处理后的上清液去除，加入Trizol，经涡旋震荡后，加入氯仿，继续将其涡旋震荡，室温放置后自然分相；

(1.4)再经冷冻离心机离心处理，此时样品分为三层，取上层无色透明清液转移至离心管中；

(1.5)在转移后的无色透明清液中加入异丙醇，然后静置，再离心处理；

(1.6)当离心处理分层后，移除上清液，在剩余的白色沉淀中加入预冷的乙醇冲洗，震荡清洗白色沉淀；

(1.7)继续离心处理，去除上清液后干燥；

(1.8)最后加入RNase-free H₂O溶解干燥后的沉淀，使其充分溶解，离心处理后转移至EP管中保存。

上述的方法中，优选的，所述步骤(1)中的提纯是采用DNase I处理和抽提处理，具体包括以下操作：

(2.1)使用DNase I处理经提取后获得的总RNA，反应体系如下：按照一定的添加比例向总RNA中加入DNase I和Reaction Buffer，无菌水补足至最终体积，上下颠倒混匀，置于37℃反应，然后加入一定量的EDTA，震荡离心，65℃反应一段时间；

(2.2)在经过上述DNase I处理后的总RNA中加入为总体积1/10的NaAc溶液，再加入等体积的氯仿/苯酚/异丙醇，涡旋震荡，离心；取上层清液，再加入等体积的氯仿，涡旋震荡，离心；取出上层清液，使用糖原沉淀RNA，稍加混匀后再加入无水乙醇略微震荡混匀；于-80℃中放置超过15min，离心，弃上层清液，再加入乙醇溶液，震荡，清洗沉淀，再离心处理后弃上层清液，室温晾干沉淀，干燥后加入适量ddH₂O溶解沉淀。

上述的方法中，优选的，所述步骤(2)中的杂交反应体系的配制方法包括：

配制组分：

上游片段，1μM，0.5μL；

下游片段，1μM，0.5μL；

10×杂交缓冲液0.5μL；

提纯后的总RNA，≤2.555μg，补加RNase-free H₂O至5μL；

混匀后，按照以下条件进行杂交反应：95℃、5min，45℃、30min，然后立即取出冷却至室温(针对不同的目标非编码RNA，本领域人员可以自行设计与待检测非编码RNA互补配对的上游片段和下游片段)。更优选的，所述上游片段和下游片段的长度范围为50～59bp。

上述的方法中，优选的，所述步骤(3)中的连接反应体系的配制方法包括：

配制组分：

步骤(2)杂交后的杂交产物，2μL；

5×Buffer(连接缓冲液)，4μL；

T4DNA连接酶，1μL；

补加RNase-free H₂O至20μL；

混匀后，按照以下条件进行酶连反应：25℃、2h，65℃、10min，冷却至4℃；

最后将连接好的HL-DNA瞬间离心，可放于-20℃长期保存。

上述的方法中，优选的，所述步骤(4)中的荧光定量PCR的扩增程序包括：预变性95℃、5min，变性温度95℃、10s，退火温度55℃～57℃、30s，延伸温度72℃、10s，循环次数40，紧接熔解曲线分析；检测结束后，使用Bio-Rad CFX Manager进行结果分析。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明设计了一种全新的单一ncRNA检测方法可以越过逆转录这一步骤，直接针对目标ncRNA，这让检测变得更准确、更专一。相比逆转录法与实时荧光定量PCR联用，杂交连接法取代了逆转录这一步骤，且直接针对待检测的目标ncRNA，这为检测特定的ncRNA转录水平提供了更优越的检测环境。因此，本发明对定量检测某一特定ncRNA的准确度有所提升，且检测结果的可重现性更佳，若用其检测不同时期细胞中同一ncRNA的转录量可信度更高，更能够真实地反映出其转录水平的变化。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明基于杂交连接法检测非编码RNA转录水平的操作流程示意图。

图2为本发明方法(HL-qPCR法)与随机引物法(RT-qPCR法)检测RNU4-1的熔解曲线图。其中，A图、C图分别为HL-qPCR法与RT-qPCR法检测RNU4-1的熔解曲线图。

图3为本发明方法(HL-qPCR法)与随机引物法(RT-qPCR法)检测AK026510的熔解曲线图。其中，B图、D图分别为HL-qPCR法与RT-qPCR法检测AK026510的熔解曲线图。

图4为重新设计新的引物对后采用随机引物法(RT-qPCR法)检测AK026510的熔解曲线图。

图5为本发明方法(HL-qPCR法)检测RNU4-1和AK026510相对浓度的结果对比图。

图6为采用随机引物法(RT-qPCR法)检测RNU4-1和AK026510相对浓度的结果对比图；其中：*P<0.05，**P<0.01(单尾检验)。

图7为本发明方法(HL-qPCR法)检测不同浓度总RNA中AK026510和RNU4-1的转录量比值结果。

图8为采用随机引物法(RT-qPCR法)检测不同浓度总RNA中AK026510和RNU4-1的转录量比值结果；其中：*P<0.05(单尾检验)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例：

一种如图1所示本发明的基于杂交连接法检测非编码RNA转录水平的方法，包括以下步骤：

1.细胞体外培养

HeLa细胞购自于中国科学院细胞库(上海)，并使用含10％FBS(胎牛血清)、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM培养基(细胞培养基)，将细胞置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中进行培养。

2.总RNA的提取

Trizol法提取RNA的步骤如下：①从培养箱中取出细胞，吸掉旧培养液，迅速使用预热37℃的1×PBS清洗细胞，将残余PBS吸出，再加入3～5mL预热37℃的1×PBS。②使用细胞刮刀迅速将细胞刮下，收集于10mL离心管中，放入冷冻离心机中(需提前预冷)，4℃、3000r/min，离心5min。③将上清液去除，加入Trizol 1mL，经过5min的涡旋震荡后，每管各加入200μL氯仿(0.2mL氯仿/1mL Trizol)，然后将其涡旋震荡1min，室温放置2～3min，自然分相。④4℃预冷离心机，12000g离心10min；此时样品会分为三层，取上层无色透明清液，即RNA，注意避免吸到中间白色沉淀，转移至新的1.5mL离心管中。⑤在上清液中加入-20℃冰冻好的异丙醇(0.5mL异丙醇/1mL Trizol)，然后静置样品于-20℃超过15min后4℃12000g离心10min。⑥可见到白色沉淀，移除上清液，再使用移液器吸走残余液体，在RNA沉淀中加入75％预冷的乙醇冲洗RNA(1mL乙醇/1mL Trizol)，震荡清洗白色沉淀。⑦4℃7000r/min离心5min后，去除上清液体；打开离心管盖子置于空气中干燥15min，但注意不能完全干燥至沉淀透明，否则会降低RNA的溶解度。⑧加入100～200μL RNase-freeH₂O溶解沉淀，用手捂5～7min，将RNA充分溶解，4℃，1000r/min离心1min，转移至1.5mL EP管中，-80℃保存。

3.总RNA的提纯

上述步骤2提取的总RNA中可能含有蛋白、基因组DNA等杂质，而蛋白质杂质、基因组DNA片段会影响荧光定量PCR的准确性，因此需要更深层地纯化总RNA提取物。为了提纯总RNA，需要进行DNase I(RNase-free)和抽提处理。

(1)使用DNase I处理提取的总RNA，反应体系如下：每1μg RNA中加入1μL DNaseI和1μL Reaction Buffer，无菌水补足至10μL的最终体积。过程中要注意DNase I对物理变性较为敏感，故不能涡旋振荡，上下颠倒混匀即可。置于37℃反应30min，然后加入为总体积1/10的EDTA，震荡离心，65℃反应10min。

(2)在经过DNase I处理后的总RNA中加入为总体积1/10的NaAc溶液(pH＝5.2)，再加入等体积的氯仿/苯酚/异丙醇，涡旋震荡1min，4℃，12000r/min离心10min。取上层清液，再加入等体积的氯仿，涡旋震荡1min，4℃，12000r/min离心10min。取出上层清液，使用糖原沉淀RNA(1μL)，稍加混匀后再加入两倍体积的无水乙醇(-20℃冰冻)，略微震荡混匀。于-80℃冰箱中放置超过15min，4℃，12000r/min离心15min，弃上层清液，再加入500μL 75％乙醇(-2℃冰冻)，震荡，清洗沉淀，再4℃，12000r/min离心10min。弃上层清液，打开离心管盖子，放置于室温15min晾干沉淀，干燥后加入适量ddH₂O溶解沉淀。

4.总RNA的检测

(1)抽提后的总RNA运用紫外分光光度计间接测得其浓度。将总RNA样品稀释50倍，即取1μL提纯后的总RNA加到49μL ddH₂O中，混匀测其在230nm、260nm、280nm、320nm处的OD值，然后运用公式OD260×稀释倍数(50倍)×0.04μg/μL，独立重复此实验三次，计算出此时总RNA的浓度为0.886μg/μL。

(2)使用1×TBE作为电泳缓冲液，进行1％琼脂糖凝胶(含10％HCHO)电泳，电压100～130V，0.5～1h，检测总RNA的质量。

5.互补DNA片段与对应ncRNA杂交

按下面条件配制杂交反应体系：

上游片段(1μM)0.5μL，下游片段(1μM)0.5μL，10×杂交缓冲液(100mM PBS、1.5M NaCl，pH 7.0)0.5μL，总RNA 0～2.555μg，补加RNase-free H₂O至5μL。混匀后，按照以下条件进行杂交反应：95℃、5min，45℃、30min，然后立即取出冷却至室温。

杂交反应体系中的DNA片段(上游片段、下游片段)序列可根据UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu)资源设计，引物序列可通过Oligo软件设计，也可由上海生工生物技术有限公司合成。考虑到荧光定量PCR中SYBR Green I染料的插入量与所检测双链的碱基数目是成正比的，也就是说适当长度的DNA片段将有利于信号扩增并且能够方便更好地设计使用荧光定量PCR检测目标ncRNA时所需引物。如果DNA片段过长就需要更高的杂交温度，同时还增加了与其他片段杂交的可能性，加大了它的合成难度并影响其合成的准确性。经过我们的优化设计，最终确定的DNA片段(上游片段、下游片段)长度范围优选为50～59bp。(以下检测分析实例中我们优化设计的两个非编码RNA的上、下游片段分别如下表1所示)

6.T4DNA连接酶反应

按下面条件配制连接反应体系：杂交产物2μL，5×Buffer 4μL，T4DNA连接酶1μL，补加RNase-free H₂O至20μL。混匀后，按照以下条件进行酶连反应：25℃、2h，65℃、10min，冷却至4℃。最后将连接好的HL-DNA瞬间离心，可放于-20℃长期保存。

7.荧光定量PCR

荧光定量PCR反应总体系为10μL：ddH₂O 3.6μL，Mix(Rox)5μL，Primer–forward 0.2μL，Primer–reverse 0.2μL，引物对应的待检测HL-DNA样品1μL。定量PCR扩增程序：预变性95℃、5min，变性温度95℃、10s，退火温度55℃～57℃(根据引物决定)、30s，延伸温度72℃、10s，循环次数40，紧接熔解曲线分析。检测结束后，使用Bio-Rad CFX Manager进行结果分析。

应用效果对比分析：

1.分析上述本实施例方法(即HL-qPCR法)与常规基于逆转录检测方法(即RT-qPCR法)对PCR引物特异性要求的对比

作为对照，逆转录步骤如下：使用美国Invitrogen公司逆转录试剂盒(Life Technologies，Cat.No.18080-051)按下面条件配制逆转录反应体系：RNA变性：总RNA 0.03～1.1μg，Randomhexamers 1μL，dNTP Mix 1μL，补加RNase-free H₂O至10μL。混匀后，放于65℃，反应5min后立即取出置于冰上至少1min。加入反应液：10×RT buffer 2μL，MgCl₂4μL，DTT 2μL，RNaseOUTTM 1μL，SuperScriptTM III RT 1μL到变性后的RNA中。按照以下条件进行逆转录反应：25℃、10min，50℃、50min，85℃、5min后立即置于冰上。最后加入1μL RNase-freeH₂O在37℃孵化20min。将逆转录成的cDNA第一链瞬间离心，放于-20℃长期保存。

参照AK026510和RNU4-1引物对的Tm值和荧光定量PCR的检测原理，退火温度设定为56℃，其余参数按照上述实施例的步骤7所述要求设置。使用Bio-Rad CFX96检测AK026510和RNU4-1的相对浓度时，PCR产物的熔解曲线如图2～图4所示。从图2中可知：在检测RNU4-1的相对浓度时，不管PCR的模板是HL-DNA(参见图2-A)或者是cDNA(参见图2-C)，在测量过程中只产生单一的PCR产物，都满足荧光定量PCR对引物对特异性的要求。然而，在检测AK026510时，若以随机引物法逆转录的cDNA为模板，扩增产物的熔解曲线则出现双峰(参见图3-D)，说明该引物对的特异性无法满足荧光定量PCR的要求。但是使用HL-DNA用作PCR模板时，在同等条件下，其PCR产物的熔解曲线表明只有单一产物，满足荧光定量PCR对PCR特异性的要求(参见图3-B)。

可见，杂交连接法获得的HL-DNA是荧光定量PCR检测时唯一可以作为PCR扩增模版的DNA片段，从理论上可以推断，HL-qPCR方法对PCR引物的特异性要求不高。在同等条件下，使用RT-qPCR检测目标ncRNA时，逆转录产出大量无关cDNA片段，因此要求引物对必须有极高的特异性(见图2和图3)。以上结果充分说明：HL-qPCR对引物对的特异性基本没有要求，因为在检测目标片段相对浓度时，没有其他的干扰。根据文献报道可知：引物对的特异性是影响RT-qPCR结果的重要因素之一。因此，使用本发明的HL-qPCR可以解决引物对特异性引起的问题。

2.分析上述本实施例方法与常规基于逆转录检测方法在检测目标ncRNA准确度上的对比分析

采用RT-qPCR方法检测AK026510时，由于引物对的特异性不够高(参见下表1中的AK026510-forward和AK026510-reverse)，不能满足荧光定量PCR检测的要求。为了解决此问题，重新设计一对新引物(引物对序列见表1中的AK026510(cDNA)-forward和AK026510(cDNA)-reverse)。使用新的引物对，再用RT-qPCR检测AK026510时的熔解曲线如图4所示。图上清楚显示只有单一PCR产物，因此满足荧光定量PCR检测的要求。随后凡是用RT-qPCR方法检测AK026510时都使用该引物对。

表1：本实施例中涉及的DNA片段及引物序列

上表1中，P代表磷酸基团，B代表生物素标记。

为了探索HL-qPCR法和RT-qPCR法检测目标ncRNA的准确性，本实验制备了一系列标准样品，制备方法如下表2所示。由于测定ncRNA的绝对浓度十分困难，而且目前的生命科学研究考察的是其相对浓度的变化，所以我们将1#样品中的所有ncRNA浓度定义为1。其他样品根据制备时反应液所含总RNA浓度可以预计该样品中ncRNA的相对浓度。例如：1a#样品在制备HL-DNA时，反应缓冲液中总RNA的浓度为1.825ng/μL；而2a#样品在制备HL-DNA时，反应缓冲液中总RNA的浓度为3.65ng/μL，那么2a#样品中目标ncRNA的浓度是1a#样品的2倍。如果制备的HL-DNA与目标ncRNA成1:1的比例，而且制备HL-DNA的效率与总RNA浓度无关，但是考虑到由微量移液器造成的误差有10％，2a#样品中与目标ncRNA对应的HL-DNA相对浓度应该在2±0.2附近。同理，若制备cDNA时，逆转录效率若能保持一致，2c#样品中任一ncRNA是1c#样品中的2±0.2倍。本实验中从同一质检过的总RNA库中取样，根据以上本实施例的方法制备了一系列标准样品，如下表2所示。考虑到用移液枪进行稀释的准确度以及所用总RNA的浓度，系列标准样品中用于制备HL-DNA或cDNA的总RNA浓度分别设定为1.825、3.65、7.30、14.6、21.9、29.2、36.5、43.8和51.1(单位ng/μL)。根据以上设定浓度计算好所需总RNA体积，加入对应的逆转录反应液或DNA-ncRNA杂交反应液以制作cDNA或HL-DNA样品。同样地，检测HL-qPCR法和RT-qPCR法可重现性的标准样品也根据计算好的合适总RNA浓度依此制作。以上所有样品制备实验独立重复三次。

表2：本实验系列标准样品的制备

使用HL-qPCR法分别检测标准样品系列1a#-9a#和1b#-9b#中RNU4-1和AK026510相对浓度的结果如图5所示，从低浓度的1a#、1b#样到高浓度的9a#、9b#样，不论是检测RNU4-1还是AK026510，所有检测值都在预测值附近小范围波动。此实验结果表明，使用全新的HL-qPCR法制备HL-DNA的效率与总RNA浓度无关，将其用作荧光定量PCR的扩增模板可以准确地测量特定ncRNA的相对浓度。并且，对于同一总RNA浓度的检测样品，使用HL-qPCR法检测到的RNU4-1和AK026510相对浓度都十分接近，跟理论预测基本一致，这说明不同ncRNA的结构特征不影响HL-DNA的制备效率，以HL-DNA作为模板进行荧光定量PCR检测具有较高的准确性以及优异的可重复性。

同样地，作为对比参照，使用RT-qPCR法分别检测标准样品系列1c#-9c#中RNU4-1和AK026510的相对浓度，结果如图6所示，以随机引物法逆转录不同浓度总RNA得到的cDNA作为荧光定量PCR的扩增模板，RNU4-1和AK026510的相对浓度检测值均高于其对应的预测值。在2c#样品中此差异尚不明显，随着总RNA浓度的增加，检测到的RNU4-1和AK026510相对浓度与预测浓度之间的差值也越来越大，说明ncRNA浓度的变化对逆转录制备cDNA的效率产生了影响，使检测结果偏离预测的真实值范围。并且，在3c#-9c#样品中，使用单尾检验分析RNU4-1相对浓度的检测值与AK026510相对浓度的检测值有显著性差异，说明ncRNA的不同结构与特性会对逆转录制备相应的cDNA模板效率产生影响，降低了RT-qPCR法检测特定ncRNA的准确性。

通过对比上述的图5和图6中的结果发现，使用HL-qPCR法检测某一特定ncRNA的相对浓度不受总RNA浓度及ncRNA结构的变化影响，检测值在预测值附近合理波动；相比之下，使用RT-qPCR法检测特定ncRNA的相对浓度不仅受到总RNA浓度变化的影响还与ncRNA的特异性结构相关，说明HL-qPCR法检测目标ncRNA具有更高的准确性和可重复性。

3.分析本发明方法与常规基于逆转录检测方法在检测目标ncRNA可重现性上的对比分析

目前的生命科学研究主要通过考察ncRNA相对浓度的变化说明其转录水平的波动，RNU4-1作为常用的ncRNA检测内参基因，通过检测同一总RNA不同浓度样品中随机选取的ncRNA AK026510和内参ncRNA RNU4-1的转录量比值可以反映所用检测方法的可重现性。

为了探索HL-qPCR方法和RT-qPCR方法检测目标ncRNA的可重现性，本实验选取用同一质检过的总RNA作为ncRNA原料制备的12个样品，考察转录量比值AK026510/RNU4-1的波动变化，其中含使用HL-qPCR检测的四组样品(3a#-3b#、4a#-4b#、6a#-6b#、8a#-8b#)和使用RT-qPCR检测的四个样品(3c#、4c#、6c#、8c#)，制备方法如上表2所示。例如：3a#和3b#样品在制备对应ncRNA的HL-DNA时，反应缓冲液中总RNA的浓度均为7.30ng/μL，那么3b#样品中目标ncRNA AK026510的浓度与3a#样品中目标ncRNA RNU4-1浓度的比值反映的就是所用总RNA中的转录量比值AK026510/RNU4-1。如果杂交反应和连接反应条件稳定，而且单次制备HL-DNA的效率与总RNA浓度无关，4b#样品中目标ncRNA AK026510的浓度与4a#样品中目标ncRNA RNU4-1浓度的比值应该与3b#和3a#的比值相同。同理，若制备cDNA时，逆转录效率若能保持一致，3c#、4c#、6c#、8c#样品中AK026510的浓度与RNU4-1浓度的比值应保持恒定不变。

使用HL-qPCR法检测3a#-3b#、4a#-4b#、6a#-6b#、8a#-8b#四对样品中AK026510的浓度与RNU4-1浓度的比值，如图7所示，在四组总RNA浓度递增的平行样品中，此比值以0.82为中心轴，在其左右小范围合理波动，没有显著性差异。以上实验结果表明，杂交连接法使用的杂交反应和连接反应条件稳定，单次制备HL-DNA的效率与总RNA浓度无关，使用HL-qPCR法检测目标ncRNA的可重现性高。同样的，使用RT-qPCR法检测3c#、4c#、6c#、8c#四个样品中AK026510的浓度与RNU4-1浓度的比值，如图8所示，使用cDNA检测此比值波动变化较大，随着总RNA浓度的升高此比值降低，低浓度样品3c#、4c#与高浓度样品6c#、8c#的检测值有显著性差异。换言之，在制备cDNA时，逆转录特定ncRNA的效率受到总RNA浓度的影响。由图7和图8可见，使用本发明的HL-qPCR法替代RT-qPCR法可以提高ncRNA相对浓度检测的可重现性。

Claims (8)

1.一种基于杂交连接法检测非编码RNA转录水平的方法，包括以下步骤：

(1)经提取、提纯获得含待检测目标ncRNA的样本液；

(2)配制杂交反应体系，使上述样本液中的待检测目标ncRNA与两个完全互补配对的DNA片段进行杂交，形成ncRNA-oligos杂合链；

(3)配制连接反应体系，用T4DNA连接酶对上述得到的ncRNA-oligos杂合链进行缺口修复，得到含HL-DNA的待检测样本；

(4)以上述得到的含HL-DNA的待检测样本为模板，直接用于荧光定量PCR的检测，根据检测结果分析待检测目标ncRNA的转录水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的提取是采用Trizol法，具体包括以下操作：

(1.1)以特定目标细胞为培养对象，培养完成后吸除旧培养液，用预热后的1×PBS清洗目标细胞；

(1.2)使用细胞刮刀将目标细胞刮下、收集，经冷冻离心机离心处理；

(1.3)将离心处理后的上清液去除，加入Trizol，经涡旋震荡后，加入氯仿，继续将其涡旋震荡，室温放置后自然分相；

(1.4)再经冷冻离心机离心处理，此时样品分为三层，取上层无色透明清液转移至离心管中；

(1.5)在转移后的无色透明清液中加入异丙醇，然后静置，再离心处理；

(1.6)当离心处理分层后，移除上清液，在剩余的白色沉淀中加入预冷的乙醇冲洗，震荡清洗白色沉淀；

(1.7)继续离心处理，去除上清液后干燥；

(1.8)最后加入RNase-free H₂O溶解干燥后的沉淀，使其充分溶解，离心处理后转移至EP管中保存。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的提纯是采用DNase I处理和抽提处理，具体包括以下操作：

(2.1)使用DNase I处理经提取后获得的总RNA，反应体系如下：按照一定的添加比例向总RNA中加入DNase I和Reaction Buffer，无菌水补足至最终体积，上下颠倒混匀，置于37℃反应，然后加入一定量的EDTA，震荡离心，65℃反应一段时间；

(2.2)在经过上述DNase I处理后的总RNA中加入NaAc溶液，再加入氯仿/苯酚/异丙醇，涡旋震荡，离心；取上层清液，再加入等体积的氯仿，涡旋震荡，离心；取出上层清液，使用糖原沉淀RNA，稍加混匀后再加入无水乙醇略微震荡混匀；于-80℃中放置超过15min，离心，弃上层清液，再加入乙醇溶液，震荡，清洗沉淀，再离心处理后弃上层清液，室温晾干沉淀，干燥后加入适量ddH₂O溶解沉淀。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的杂交反应体系的配制方法包括：

配制组分：

上游片段，1μM，0.5μL；

下游片段，1μM，0.5μL；

10×杂交缓冲液，0.5μL；

提纯后的总RNA，≤2.555μg，补加RNase-free H₂O至5μL；

混匀后，按照以下条件进行杂交反应：95℃、5min，45℃、30min，然后立即取出冷却至室温。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述上游片段和下游片段的长度范围为50～59bp。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述杂交缓冲液中含100mM PBS和1.5MNaCl，杂交缓冲液的pH为7.0。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的连接反应体系的配制方法包括：

配制组分：

步骤(2)杂交后的杂交产物，2μL；

5×Buffer，4μL；

T4DNA连接酶，1μL；

补加RNase-free H₂O至20μL；

混匀后，按照以下条件进行酶连反应：25℃、2h，65℃、10min，冷却至4℃；

最后将连接好的HL-DNA瞬间离心，可放于-20℃长期保存。

8.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的荧光定量PCR的扩增程序包括：预变性95℃、5min，变性温度95℃、10s，退火温度55℃～57℃、30s，延伸温度72℃、10s，循环次数40，紧接熔解曲线分析；检测结束后，使用Bio-Rad CFXManager进行结果分析。