CN116356079A - 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒试剂盒及应用 - Google Patents
一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116356079A CN116356079A CN202310371752.8A CN202310371752A CN116356079A CN 116356079 A CN116356079 A CN 116356079A CN 202310371752 A CN202310371752 A CN 202310371752A CN 116356079 A CN116356079 A CN 116356079A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rpa
- cas12a
- crispr
- probe
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 78
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 51
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 title claims description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 41
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 35
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 31
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 31
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 claims description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 9
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 9
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 241001519517 Kappaphycus Species 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 30
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 19
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 241000608297 Getah virus Species 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 4
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000288902 Lemur catta Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 101150059443 cas12a gene Proteins 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-(2,6-diethylphenyl)-n-(methoxymethyl)acetamide;2,6-dinitro-n,n-dipropyl-4-(trifluoromethyl)aniline Chemical compound CCC1=CC=CC(CC)=C1N(COC)C(=O)CCl.CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 108010040467 CRISPR-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 241001026509 Kata Species 0.000 description 1
- 241000289581 Macropus sp. Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241001135549 Porcine epidemic diarrhea virus Species 0.000 description 1
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241001137860 Rotavirus A Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000014987 limb edema Diseases 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 244000059546 zoonotic virus Species 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明公开了一种基于RPA‑CRISPR‑Cas12a可视化检测盖塔病毒的试剂盒及其应用，所述试剂盒包含特异性crRNA、盖塔病毒特异性RPA引物对及ssDNA探针，所述特异性crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述RPA上游引物RPA‑F1‑GETV如SEQ ID NO:2所示，RPA下游引物RPA‑R3‑GETV如SEQ ID NO:7所示，荧光法和试纸条法ssDNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；探针5’端标记荧光基团，3’端标记猝灭基团。所述试剂盒具有操作便捷、耗时少、灵敏性高和特异性强等特点，全程在37℃环境下进行，可以有效脱离实验室大型仪器的依赖，便于快速现场检测。
Description
技术领域
本发明属于病原体快速检测技术领域，具体涉及一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒试剂盒及应用。
背景技术
盖塔病毒(Getah virus,GETV)是一种蚊媒传播的单股正链RNA病毒，属于披膜病毒科甲病毒属。该病毒宿主范围广泛，在猪、马、人、牛、袋鼠、狐狸、鸟类等多种动物群体的血清中均有检测到GETV抗体，牲畜感染后会引发疾病，症状包括马发烧、皮疹、四肢水肿和淋巴结肿大，并且可以导致母猪流产。近年来，GETV的地理分布不断扩大，由其感染引起的动物疫病暴发的频率和范围不断增长，病毒载体和感染动物的种类不断增多，其作为一种具有潜在公共卫生风险的人畜共患病毒，由于甲病毒属病毒的适应性突变会导致致病性的增加，监测其流行情况以及控制其传播对公共卫生具有重要意义。
成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR associated proteins,Cas)构成CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas技术是近年快速发展的基因编辑技术，该技术为生物工程、医药领域、病原核酸检测等领域带来新的思路。Cas12a又称Cpf1，当Cas12a识别靶标DNA后，Cas12a/crRNA/DNA形成三元复合物被激活，Cas12a在特异性切割靶标序列的同时，可以非特异性切割体系中任意的单链DNA(ssDNA)，基于此特性，已成为体外诊断领域的研究热点。
重组酶聚合酶扩增(RPA)是利用来源于T4噬菌体的重组酶、单链结合蛋白及DNA聚合酶在37～42℃恒温下进行的体外核酸扩增技术。RPA完整的扩增反应分为三步：模板双链DNA在重组酶的作用下解链；引物与单链模板碱基互补配对结合；DNA聚合酶在引物的引导下合成新链。RPA技术2006年由SM科技有限公司NiallArmes研发，并用来鉴定金黄色葡萄球菌的不同表型，后来又被用于诊断艾滋病毒(HIV)，Grannell等通过将反应管放于腋下孵育，利用体温对HIV-1进行了RPA检测，很大程度上摆脱了对仪器设备的依赖。
将CRISPR-Cas12a的切割特性与RPA技术结合，通过RPA技术恒温扩增目的片段，然后进行CRISPR-Cas12a检测切割反应，最后通过蓝光照射或者Cas12/13专用核酸检测试纸条进行结果的可视化。将两种技术结合的意义在于不需要在RPA扩增阶段引入探针，而是通过CRISPR-Cas12a系统的特异性识别目的片段和切割特性保证检测结果的准确性；该检测系统可以通过改变CRISPR-Cas12a检测反应中的crRNA序列即可实现多种病原微生物的检测，表现出该检测方法的广泛适用性及用于现场快速检测的实用性。
发明内容
针对现有技术中缺少可以现场快速可视化检测盖塔病毒的检测方法，本发明提供了一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒的试剂盒及应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
第一方面，本发明保护一种用于检测盖塔病毒的组合物，所述组合物主要包括特异性crRNA序列、特异性RPA引物序列，以及荧光法ssDNA探针或试纸条法ssDNA探针：
所述特异性crRNA序列信息如下所示：
crRNA-GETV(SEQ ID NO:1)：
5’–UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCAAAUGAGAGAAYUACCAA-3’；
crRNA序列信息中的带下划线的序列为LbCas12a同源的茎环序列；
所述特异性RPA扩增引物序列信息如下所示：
RPA上游引物RPA-F1-GETV(SEQ ID NO:2)：
5’-CAAAACACGYTACAAAACGTRCTAGCCGCGGCCAC-3’；
RPA下游引物RPA-R3-GETV(SEQ ID NO:7)：
5’-GGTGGTGATCCGTATAGGRTTGTCTTTRAATTCTT-3’；
所述荧光法ssDNA探针序列信息如下所示：
ssDNA-Probe-1(SEQ ID NO:8)：5’-6-FAM-TTTATTT-BHQ1-3’，探针5’端标记荧光基团为6-羧基荧光素(6-Carboxy Fluorescein，6-FAM)，3’端标记猝灭基团为黑洞猝灭剂1(Black Hole Quencher 1，BHQ1；
所述试纸条法ssDNA探针序列信息如下所示：
ssDNA-Probe-2(SEQ ID NO:9)：5’-6-FAM-CCGGAAAAAAAAAAAACCGG-Biotin-3’，探针5’端标记荧光基团为6-羧基荧光素(6-Carboxy Fluorescein，6-FAM)，3’端标记猝灭基团为生物素(Biotin)。
第二方面，本发明保护一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒的产品，所述产品选自如下任一种：
(A1)含有权利要求1所述组合物的试剂；
(A2)含有权利要求1所述组合物的试剂盒；
(A3)含有(A1)所述试剂的试剂盒。
在具体的实施方案中，所述试剂盒还包含RPA恒温快速扩增试剂盒(安普未来生物WLB8201KIT)和CRISPR-Cas12a切割检测试剂。
在具体的实施方案中，所述试剂盒还包含CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条(沃博生物JY0301)，该试纸条包括检测线T线和质控线C线，具体包被有双抗的质控线C线和包被有链霉亲和素的检测线T线。
本发明针对盖塔病毒基因组中的序列保守区域，设计了特异性RPA扩增引物以及crRNA序列；通过先对待测样品进行扩增，再在crRNA的介导下，引导CRISPR-Cas12a体系对扩增产物进行识别结合并激活非特异性核酸酶的切割功能，然后任意切割体系中的ssDNA荧光探针得到切割产物，最后通过切割产物的可视化检测结果进行判断。
第三方面，本发明还保护前文所述的组合物，前文所述的试剂，或前文所述的试剂盒在如下任一所述的应用：
(1)在可视化检测盖塔病毒中的应用；
(2)在制备可视化检测盖塔病毒的产品中的应用。
第四方面，本发明保护一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒的方法，是通过以下步骤予以实现的：
步骤1，获取待检样品的cDNA：提取待测样品的RNA，反转录为cDNA模板；
步骤2，使用特异性RPA引物进行目的基因片段的扩增：以步骤1中获得的cDNA作为模板，将上述特异性RPA引物RPA-F-GETV(SEQ ID NO:2)和RPA-R-GETV(SEQ ID NO:3)加入体系，在37～39℃下进行恒温核酸扩增反应，得到扩增产物；
步骤3，进行CRISPR-Cas12a切割反应：利用上述的crRNA-GETV(SEQ ID NO:1)制备Cas12a-crRNA复合物，再加入ssDNA-Probe-1(SEQ ID NO:8)或者ssDNA-Probe-2(SEQ IDNO:9)探针，以及步骤2得到的扩增产物，在37℃下进行切割反应得到切割产物；
步骤4，荧光可视化检测结果：若在步骤3中加入的是ssDNA-Probe-1(SEQ ID NO:8)探针，则将步骤3得到的切割产物在蓝光或凝胶成像仪下进行裸眼观察或者显色，若在蓝光或凝胶成像仪下无荧光亮度，则表示待测样品中无盖塔病毒感染，反之若可观察到荧光亮度，则表示待测样品中存在盖塔病毒感染；
步骤5，试纸条可视化检测结果：若在步骤3中加入的是ssDNA-Probe-2(SEQ IDNO:9)探针，则在步骤3得到的切割产物加入nuclease-free水至体积为50μL，滴于CRISPRCas12/13HybriDetect试纸条上，若是检测线T线显示红色条带则表示待测样品存在盖塔病毒感染；若是检测线T线未显示条带，质控线C线上出现红色条带，则表示待测样品未感染盖塔病毒；若是检测线T线和质控线C线都未出现红色条带，则该检测结果提示所用的试纸条或扩增试剂可能已经损坏、失效或操作有误，需要调整后重新检测。
进一步地，步骤1中反转录使用
II 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行，其反应总体系为20μL，包括：1μL Random hexamers,1μL Oligo(dT)23VN,5μLnuclease-free Water,5μL总RNA，4μL 4×gDNA wiper Mix，吹打混匀后42℃加热2min，继续加入：2μL 10×RT Mix、2μL/>
II Enzyme Mix。
进一步地，步骤1中反转录的反应程序为：50℃加热15min，85℃加热2min，反应后得到cDNA模板。
进一步地，步骤2中RPA恒温扩增的反应体系为：29.4μL A buffer，RPA-F-GETV、RPA-R-GETV和cDNA模板各2μL，2.5μL B buffer，ddH2O加至体系总体积为50μL。其中引物浓度均为10μM。
进一步地，步骤3中CRISPR-Cas12a切割反应的体系为：步骤2得到的扩增产物和NEBuffer 2.1各2μL，crRNA-GETV和
Lba Cas12a(Cpf1)各0.5μL，1μL ssDNA-Probe-1或ssDNA-Probe-2，nuclease-free水加至体系总体积为20μL。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明筛选得到了一种用于检测盖塔病毒的组合物，所述组合物由特异性crRNA、特异性RPA引物对和探针组成，所述RPA引物对和crRNA的特异性好，灵敏性高，可以快速准确地检测到盖塔病毒；
2、本发明采用CRISPR-Cas12a体系建立了快速可视化检测盖塔病毒的方法，通过RPA扩增以及crRNA识别双重特异地对盖塔病毒进行检测，反应全程在37～40℃环境下进行，检测结果可通过蓝光照射下裸眼直接观察、凝胶成像仪显色或者CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条显色三种方法可供选择进行观察，脱离了实验室大型仪器的限制和依赖，实现现场快速检测，具有成本低、操作便捷、耗时少、灵敏性高和特异性强的优点。
3、本发明中检测方法的建立，为盖塔病毒的监测提供了可靠的技术支持。
附图说明
图1为不同特异性RPA引物对序列检测盖塔病毒的凝胶成像图；
图2为不同浓度Lba-Cas12a蛋白检测体系检测盖塔病毒的荧光曲线图；
图3为不同浓度Lba-Cas12a蛋白浓度检测体系检测盖塔病毒的凝胶成像图；
图4为不同浓度Lba-Cas12a蛋白浓度检测体系检测盖塔病毒的蓝光照射显色图；
图5为不同浓度ssDNA探针检测体系检测盖塔病毒的荧光曲线图；
图6为不同浓度ssDNA探针浓度检测体系检测盖塔病毒的凝胶成像图；
图7为不同浓度ssDNA探针浓度检测体系检测盖塔病毒的蓝光照射显色图；
图8为CRISPR-Cas12a切割反应最佳体系检测梯度浓度标准质粒(1×100～1×107copies/μL)的荧光曲线图；
图9为CRISPR-Cas12a切割反应最佳体系检测梯度浓度标准质粒(1×100～1×107copies/μL)的的凝胶成像图；
图10为CRISPR-Cas12a切割反应最佳体系检测梯度浓度标准质粒(1×100～1×107copies/μL)的的蓝光照射显色图；
图11为CRISPR-Cas12a切割反应最佳体系检测梯度浓度标准质粒(1×100～1×107copies/μL)的的核酸试纸条显色结果图；
图12为特异性试验，使用CRISPR-Cas12a切割反应最佳体系检测其它病原阳性样品的凝胶成像图；
图13为特异性试验，使用CRISPR-Cas12a切割反应最佳体系检测其它病原阳性样品的蓝光照射图；
图14为特异性试验，使用CRISPR-Cas12a切割反应最佳体系检测其它病原阳性样品的核酸试纸条显色结果图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
用于检测盖塔病毒的特异性crRNA和特异性RPA引物对的设计
1、实验方法
(1)在美国国家生物技术信息中心网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载目前已有所有的盖塔病毒(Getah virus,GETV)基因组序列并进行序列比对；
(2)使用MEGA7和Oligo7.0软件针对GETV基因保守区域进行特异性crRNA序列和特异性RPA引物序列的设计，为了筛选扩增效率更高的RPA引物对，围绕crRNA分别设计三条RPA上游引物序列和三条RPA下游引物序列，将其两两组合可以得到共9组RPA引物对，通过核酸凝胶电泳筛选出扩增效率最高的RPA引物对；
(3)将设计完成的多对特异性RPA引物、荧光法ssDNA探针和试纸条法ssDNA探针交由上海生工生物公司进行合成，特异性crRNA交由北京擎科生物科技有限公司进行合成。
2、实验结果
(1)设计的具体序列如下：
所述用于检测盖塔病毒的特异性crRNA序列信息如下所示：
crRNA-GETV(SEQ ID NO:1)：
5’–UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCAAAUGAGAGAAYUACCAA-3’；
crRNA序列信息中的带下划线的序列为LbCas12a同源的茎环序列。
所述用于检测盖塔病毒的特异性RPA扩增引物序列信息如下所示：
RPA上游引物RPA-F1-GETV(SEQ ID NO:2)：
5’-CAAAACACGYTACAAAACGTRCTAGCCGCGGCCAC-3’；
RPA上游引物RPA-F2-GETV(SEQ ID NO:3)：
5’-TACAAAACGTRCTAGCCGCGGCCACYAAAAGAAA-3’；
RPA上游引物RPA-F3-GETV(SEQ ID NO:4)：
5’-AAYGTCACCCAAATGAGAGAAYTACCAACCATGGA-3’；
RPA下游引物RPA-R1-GETV(SEQ ID NO:5)：
5’-GGRTTGTCTTTRAATTCTTGCCAATATTCGCCGGT-3’；
RPA下游引物RPA-R2-GETV(SEQ ID NO:6)：
5’-ACGTACGTCGTTATGTTTTCGGTGGTGATCCGTAT-3’；
RPA下游引物RPA-R3-GETV(SEQ ID NO:7)：
5’-GGTGGTGATCCGTATAGGRTTGTCTTTRAATTCTT-3’；
所述用于检测盖塔病毒的荧光法ssDNA探针序列信息如下所示：
ssDNA-Probe-1(SEQ ID NO:8)：5’-6-FAM-TTTATTT-BHQ1-3’；
所述用于检测盖塔病毒的试纸条法ssDNA探针序列信息如下所示：
ssDNA-Probe-2(SEQ ID NO:9)：5’-6-FAM-CCGGAAAAAAAAAAAACCGG-Biotin-3’
实施例2
最佳特异性RPA引物对的设计和筛选
1、实验方法
(1)提取GETV阳性样品的总RNA，反转录后得到cDNA样品，使用实施例1中设计并合成的特异性RPA引物对，使用恒温快速扩增试剂盒(安普未来生物WLB8201KIT)，进行重组酶聚合酶扩增反应(RPA)，扩增目的片段；
(2)根据说明书，RPA恒温扩增反应体系为：29.4μL A buffer，RPA-F-GETV、RPA-R-GETV和cDNA模板各2μL，2.5μL B buffer，ddH2O加至体系总体积为50μL，其中引物浓度均为10μM；
(3)RPA恒温扩增反应程序为：37℃下反应20min，得到扩增产物；
(4)将步骤(3)得到的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳并进行成像分析。
2、实验结果
如图1所示，经过筛选我们选择RPA-F1-GETV(SEQ ID NO:2)和RPA-R3-GETV(SEQID NO:7)作为本检测试剂盒中的特异性RPA引物对。
实施例3
构建最佳CRISPR-Cas12a切割反应体系
1、实验方法
(1)使用实施例2中得到的RPA扩增产物，进行CRISPR-Cas12a切割反应；
(2)最佳Lba Cas12a酶浓度CRISPR-Cas12a切割反应的体系为：扩增产物和NEBuffer2.1各2μL，0.5μL crRNA-GETV，1μL ssDNA-Probe-1，
Lba Cas12a(Cpf1)分别加入0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL、1.5μL、1.75μL、2μL，nuclease-free水加至体系总体积为20μL；
(3)最佳ssDNA探针浓度CRISPR-Cas12a切割反应的体系为：扩增产物和NEBuffer2.1各2μL，crRNA-GETV和
Lba Cas12a(Cpf1)各0.5μL，ssDNA-Probe-1分别加入0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL、1μL，nuclease-free水加至体系总体积为20μL；
(4)CRISPR-Cas12a切割反应程序：在37℃下反应20min，反应在荧光定量仪中进行，反应过程中收集荧光信号，反应结束后置于凝胶成像仪中进行蓝光照射下的成像和肉眼观察。
2、实验结果
(1)如图2、3和4所示，当体系中加入0.5μL的
Lba Cas12a(Cpf1)时，荧光定量仪收集到的荧光强度最高，蓝光照射下的凝胶成像和肉眼观察时荧光强度无明显区别；
(2)如图5、6和7所示，当体系中加入1μL的ss-DNA探针时，蓝光照射下的凝胶成像和肉眼观察时荧光强度最高，荧光定量仪收集到的荧光强度相近；
(3)最佳CRISPR-Cas12a切割反应体系为：扩增产物和NEBuffer 2.1各2μL，crRNA-GETV和
Lba Cas12a(Cpf1)各0.5μL，1μL ssDNA-Probe-1，nuclease-free水加至体系总体积为20μL。
实施例4
基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒的试剂盒的灵敏性检验
1、实验方法
(1)构建盖塔病毒目的基因标准质粒：使用普通PCR扩增目的基因，将目的基因连接到pMD-18t质粒中，制备稀释倍数为10倍，浓度为1×107copies/μL～1×100copies/μL的标准质粒；
(2)使用上述质粒标准品进行RPA恒温扩增，反应体系为：29.4μL A buffer，RPA-F-GETV、RPA-R-GETV和cDNA模板各2μL，2.5μL B buffer，ddH2O加至体系总体积为50μL，其中引物浓度均为10μM；
(3)RPA恒温扩增反应程序为：37℃下反应20min，得到扩增产物；
(4)使用步骤(3)得到的各浓度质粒标准品RPA扩增产物，置于最佳CRISPR-Cas12a切割反应体系中：扩增产物和NEBuffer 2.1各2μL，crRNA-GETV和
Lba Cas12a(Cpf1)各0.5μL，1μL ssDNA-Probe-1或ssDNA-Probe-2，nuclease-free水加至体系总体积为20μL；
(5)CRISPR-Cas12a切割反应程序：在37℃下反应20min，反应在荧光定量仪中进行，反应过程中收集荧光信号，反应结束后置于凝胶成像仪中进行蓝光照射下的成像和肉眼观察，或将切割产物滴于CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条(沃博生物JY0301)进行反应并进行结果判读。
2、实验结果
(1)如图8、9和10所示，当体系中加入荧光法ssDNA探针，通过荧光定量仪收集荧光信号、蓝光照射下肉眼观察以及凝胶成像仪中成像的结果，可以得到荧光法检测灵敏性为1copies/μL；
(2)如图11所示，当体系中加入试纸条法ssDNA探针，通过对试纸条的显色结果进行判读，可以得到试纸条法检测灵敏性为10copies/μL。
实施例5
基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒的试剂盒的特异性检验
1、实验方法
(1)使用猪圆环病毒2型、猪繁殖和呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、盖塔病毒和A群轮状病毒阳性样品，提取样品的总RNA，反转录为cDNA模板样品；
(2)使用上述cDNA模板样品进行RPA恒温扩增，反应体系为：29.4μL A buffer，RPA-F-GETV、RPA-R-GETV和cDNA模板各2μL，2.5μL B buffer，ddH2O加至体系总体积为50μL，其中引物浓度均为10μM；、
(3)RPA恒温扩增反应程序为：37℃下反应20min，得到扩增产物；
(4)使用步骤(3)得到的各浓度质粒标准品RPA扩增产物，置于最佳CRISPR-Cas12a切割反应体系中：扩增产物和NEBuffer 2.1各2μL，crRNA-GETV和
Lba Cas12a(Cpf1)各0.5μL，1μL ssDNA-Probe-1或ssDNA-Probe-2，nuclease-free水加至体系总体积为20μL；
(5)CRISPR-Cas12a切割反应程序：在37℃下反应20min，反应结束后置于凝胶成像仪中进行蓝光照射下的成像和肉眼观察，或将切割产物滴于CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条(沃博生物JY0301)进行反应并进行结果判读。
2、实验结果
(1)如图12和13所示，当体系中加入荧光法ssDNA探针，凝胶成像仪成像和蓝光照射肉眼观察结果显示只有盖塔病毒阳性样品检测结果显示阳性，荧光法检测特异性表现优异；
(2)如图14所示，当体系中加入试纸条法ssDNA探针，CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条显色结果显示只有盖塔病毒阳性样品检测结果显示阳性，试纸条法检测特异性表现优异。
实施例6
基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒的试剂盒的临床样品检测
1、实验方法
(1)对来自于全国各地猪场的24份组织和拭子样品进行总RNA提取，反转录后得到cDNA模板样品；
(2)使用上述cDNA模板样品进行RPA恒温扩增，反应体系为：29.4μL A buffer，RPA-F-GETV、RPA-R-GETV和cDNA模板各2μL，2.5μL B buffer，ddH2O加至体系总体积为50μL，其中引物浓度均为10μM；、
(3)RPA恒温扩增反应程序为：37℃下反应20min，得到扩增产物；
(4)使用步骤(3)得到的各浓度质粒标准品RPA扩增产物，置于最佳CRISPR-Cas12a切割反应体系中：扩增产物和NEBuffer 2.1各2μL，crRNA-GETV和
Lba Cas12a(Cpf1)各0.5μL，1μL ssDNA-Probe-1或ssDNA-Probe-2，nuclease-free水加至体系总体积为20μL；
(5)CRISPR-Cas12a切割反应程序：在37℃下反应20min，反应结束后置于凝胶成像仪中进行蓝光照射下的成像和肉眼观察，或将切割产物滴于CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条(沃博生物JY0301)进行反应并进行结果判读。
(6)使用盖塔病毒普通PCR检测方法检测步骤(1)得到的cDNA模板样品，将PCR检测结果与步骤(5)得到的检测结果进行对比验证。
2、实验结果
对比RPA-CRISPR-Cas12a检测结果和PCR检测结果，两者检测结果一致，24份临床样品中共有3份阳性样品和21份阴性样品，表明本发明可用于临床检测盖塔病毒。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种组合物，其特征在于，所述组合物主要包括crRNA序列、特异性RPA引物对，以及荧光法ssDNA探针或试纸条法ssDNA探针；
所述crRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述特异性RPA引物对的上游引物RPA-F1-GETV的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物RPA-R3-GETV的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述荧光法ssDNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
所述试纸条法ssDNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
2.一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒的产品，其特征在于，所述产品选自如下任一种：
(A1)含有权利要求1所述组合物的试剂；
(A2)含有权利要求1所述组合物的试剂盒；
(A3)含有(A1)所述试剂的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含Cas12a专用核酸检测试纸条，所述Cas12a专用核酸检测试纸条包括检测线T线和质控线C线；
优选的，所述T线上包被有双抗，所述C线上包被链霉亲和素。
4.权利要求1所述的组合物，权利要求2所述的产品，或权利要求3所述的试剂盒在如下任一所述的应用：
(1)在可视化检测盖塔病毒中的应用；
(2)在制备可视化检测盖塔病毒的产品中的应用。
5.一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
步骤1，获取待检样品的cDNA：提取待测样品的RNA，反转录为cDNA模板；
步骤2，使用特异性RPA引物进行目的基因片段的扩增：以步骤1中获得的cDNA作为模板，将权利要求1所述的特异性RPA引物RPA-F-GETV和RPA-R-GETV加入体系，在37～39℃下进行恒温核酸扩增反应，得到扩增产物；
步骤3，进行CRISPR-Cas12a切割反应：利用权利要求1所述的crRNA-GETV制备Cas12a-crRNA复合物，再加入SEQ ID NO:8所述的ssDNA-Probe-1或者SEQ ID NO:9所述的ssDNA-Probe-2探针，以及步骤2得到的扩增产物，在37℃下进行切割反应得到切割产物。
6.根据权利要求5所述的基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒的方法，其特征在于，若在步骤3中加入的是ssDNA-Probe-1探针，则将步骤3得到的切割产物在蓝光或凝胶成像仪下进行裸眼观察或者显色，若在蓝光或凝胶成像仪下无荧光亮度，则表示待测样品中无盖塔病毒感染，反之若可观察到荧光亮度，则表示待测样品中存在盖塔病毒感染。
7.根据权利要求5所述的基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒的方法，其特征在于，若在步骤3中加入的是ssDNA-Probe-2探针，则在步骤3得到的切割产物加入nuclease-free水至体积为50μL，滴于CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条上，若是检测线T线显示红色条带则表示待测样品存在盖塔病毒感染；若是检测线T线未显示条带，质控线C线上出现红色条带，则表示待测样品未感染盖塔病毒；若是检测线T线和质控线C线都未出现红色条带，则该检测结果提示所用的试纸条或扩增试剂可能已经损坏、失效或操作有误，需要调整后重新检测。
8.根据权利要求5所述的基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒的方法，其特征在于，步骤1中反转录使用
II 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行，其反应总体系为20μL，包括：1μL Random hexamers,1μL Oligo(dT)23VN,5μL nuclease-freeWater,5μL总RNA，4μL 4×gDNA wiper Mix，吹打混匀后42℃加热2min，继续加入：2μL 10×RT Mix、2μL/>
II Enzyme Mix；
优选的，步骤1中反转录的反应程序为：50℃加热15min，85℃加热2min，反应后得到cDNA模板。
9.根据权利要求5所述的基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒的方法，其特征在于，步骤2中RPA恒温扩增的反应体系为：29.4μL A buffer，RPA-F-GETV、RPA-R-GETV和cDNA模板各2μL，2.5μL B buffer，ddH2O加至体系总体积为50μL；其中引物浓度均为10μM。
10.根据权利要求5所述的基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒的方法，其特征在于，步骤3中CRISPR-Cas12a切割反应的体系为：步骤2得到的扩增产物和NEBuffer 2.1各2μL，crRNA-GETV和
Lba Cas12a(Cpf1)各0.5μL，1μL ssDNA-Probe-1或ssDNA-Probe-2，nuclease-free水加至体系总体积为20μL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310371752.8A CN116356079A (zh) | 2023-04-10 | 2023-04-10 | 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310371752.8A CN116356079A (zh) | 2023-04-10 | 2023-04-10 | 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒试剂盒及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116356079A true CN116356079A (zh) | 2023-06-30 |
Family
ID=86937041
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310371752.8A Pending CN116356079A (zh) | 2023-04-10 | 2023-04-10 | 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒试剂盒及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116356079A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117169499A (zh) * | 2023-10-27 | 2023-12-05 | 南京农业大学三亚研究院 | 一种盖他病毒的双抗体夹心elisa检测试剂盒以及应用 |
-
2023
- 2023-04-10 CN CN202310371752.8A patent/CN116356079A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117169499A (zh) * | 2023-10-27 | 2023-12-05 | 南京农业大学三亚研究院 | 一种盖他病毒的双抗体夹心elisa检测试剂盒以及应用 |
| CN117169499B (zh) * | 2023-10-27 | 2024-01-09 | 南京农业大学三亚研究院 | 一种盖他病毒的双抗体夹心elisa检测试剂盒以及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111187856B (zh) | 一种用于新冠病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其制备方法与应用 | |
| CN110551846B (zh) | 一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法 | |
| CN110184329A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法和试剂盒 | |
| CN107299155A (zh) | 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针 | |
| CN107630109A (zh) | 一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光定量pcr引物及试剂盒 | |
| CN109182481B (zh) | 一种高通量检测多种靶基因的方法 | |
| CN113584167B (zh) | 一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试剂盒 | |
| CN110453012A (zh) | 一种raa荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型通用引物、探针及检测方法 | |
| CN114774565A (zh) | 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法 | |
| CN107142335A (zh) | 用于h7亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用 | |
| CN116356079A (zh) | 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒试剂盒及应用 | |
| CN103276099B (zh) | 用于荧光定量pcr检测幽门螺杆菌的引物和试剂盒 | |
| CN112899383B (zh) | 一种基于实时荧光rpa技术的鼠疫耶尔森菌检测试剂盒及其应用 | |
| CN116411141A (zh) | 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒试剂盒及应用 | |
| CN107974514A (zh) | 一种用于猪a型塞内卡病毒检测的试剂、检测方法及应用 | |
| CN108611442B (zh) | 一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量rt-pcr引物和探针及方法与应用 | |
| CN113667668B (zh) | 基于CRISPR/Cas系统的HBV检测 | |
| CN106521038B (zh) | 一种高灵敏度的bhv‑2实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 | |
| CN105400908B (zh) | 一种利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾鮰病毒的引物、试剂盒和检测方法 | |
| CN113151495A (zh) | Lfd-rpa可视化通用检测日本血吸虫和曼氏血吸虫核酸的引物、探针、试剂盒及方法 | |
| CN106939359A (zh) | 一种lamp法检测hpv常见亚型的引物组及检测体系 | |
| CN107119110A (zh) | 微量样本中人类基因组DNA SRY基因的TaqMan探针实时荧光PCR检测的引物 | |
| CN112980844A (zh) | 针对有转录活性的SARS-CoV-2的检测试剂盒和使用方法 | |
| CN112553379A (zh) | 基于液相芯片检测呼吸道传染病病毒的方法及试剂盒 | |
| CN110257560A (zh) | 一种用于蓝舌病病毒8型检测的试剂、检测方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |