CN107974514A

CN107974514A - 一种用于猪a型塞内卡病毒检测的试剂、检测方法及应用

Info

Publication number: CN107974514A
Application number: CN201711091159.9A
Authority: CN
Inventors: 林彦星; 花群义; 曹琛福; 黄超华; 杨俊兴; 吕建强; 阮周曦; 曾少灵; 马静云; 张彩虹; 廖立珊; 祁振强
Original assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2018-05-01

Abstract

本申请公开了一种用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请的猪A型塞内卡病毒检测试剂，包括引物对和探针，引物对上下游引物分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或其反向互补序列；SEQ ID No.3所示的探针序列中，第31个碱基修饰6‑荧光基团‑dT，第32个碱基替换为碱基类似物，第33个碱基修饰荧光淬灭基团‑dT，3’末端修饰C3 Spacer。本申请的试剂，通过重组酶聚合酶扩增对SVA进行灵敏、特异、高效检测。与现有检测方法相比，本申请的试剂和方法，时间短，易操作，可快速得出结论，适于现场检测，对SVA的快速防控具有重大意义。

Description

一种用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂、检测方法及应用

技术领域

本申请涉及猪A型塞内卡病毒检测领域，特别是涉及一种用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂及其应用，以及基于该试剂的猪A型塞内卡病毒的检测方法。

背景技术

A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)，以前称为塞内卡谷病毒(Seneca Valleyvirus,SVV)，是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、塞内卡病毒属(Senecavirus)的唯一成员。SVA为直径约27nm的二十面体无囊膜的单股正链RNA病毒，基因组长约7.2kb。SVA最初被认为是细胞培养物中的污染物，并推测其来源于猪的胰酶或胎牛血清。在2007年之前，SVA主要作为溶瘤细胞被研究，用于治疗某些神经内分泌肿瘤，一直被认为是一种非致病性病毒。2007年，一批自加拿大运往美国明尼苏达州的猪鼻镜出现水泡，蹄部冠状带溃烂等类似水疱病症状，经检测排除口蹄疫(FMD)、猪水泡病(SVD)、水泡性口炎(VSV)，最终通过PCR检测确定为SVA阳性。直到2014年巴西爆发大规模SVA导致仔猪死亡，该病毒才在养猪业内逐渐被重视起来。2015年我国广东省部分猪场出现SVA感染的情况，研究人员首次分离到SVA中国毒株并测定了其全基因组序列；2016年湖北也有部分猪场出现SVA感染情况。

由于该病是一种新发现的动物传染病，染病猪临床症状主要表现为鼻镜及蹄部冠状带处出现水泡、溃烂创面等水泡性病变，类似于我国一类动物传染病口蹄疫(FMD)、猪水泡病(SVD)，若未能及时作出准确的诊断，将会导致防控措施采取不当，进而造成严重的后果。因此，建立SVA快速检测方法，对SVA的防控具有重要的意义。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂、检测方法及应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂，该试剂包括引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq IDNo.3所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-GCGCGCTGCCAAACTGGGGTATAAGATGACTCCT-3’

Seq ID No.2：5’-TTTAAATCCATAACTGGTTTATATAAGCCGTCATT-3’

Seq ID No.3：

5’-AGGGTTCCGTCTTCCCTCCGACTTCCTCTCTCTCCGATGCTGTTTTTC-3’

其中，SEQ ID No.3所示的探针序列中，第31个碱基修饰6-荧光基团-dT，第32个碱基替换为碱基类似物，第33个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，3’末端修饰C3Spacer。

需要说明的是，本申请的试剂中，引物对和探针是针对猪A型塞内卡病毒设计的，是特别用于重组酶聚合酶扩增的引物和探针。重组酶聚合酶扩增，缩写RPA，是英国TwistDx公司开发的一种新型的核酸等温扩增技术；该技术的关键之一是设计合适的扩增引物对和探针。但是，常用的PCR引物对和探针并不适合RPA；常规PCR的引物相对太短、重组效率低；常规的探针系统，与RPA也不兼容。因此，无法通过常规的引物或探针设计软件直接输出适用于RPA的引物对和探针。目前设计RPA引物对和探针，主要根据TwistDx公司网站上提供的筛选指南，人工设计多条特异性引物和探针进行试验筛选，以获得扩增效率高、灵敏度高、特异性强的引物和探针。本申请的一种实现方式中，针对靶标设计了3条上游引物、3条下游引物和1条探针进行试验筛选，最终筛选出Seq ID No.1所示序列和Seq ID No.2所示序列的引物对，以及SEQ ID No.3所示序列的探针，作为本申请的猪A型塞内卡病毒检测试剂。

还需要说明的是，RPA的原理是采用三个酶，在恒温下使一对引物对靶标进行指数扩增；本申请的试剂中，考虑到通过荧光检测的方式对RPA扩增产物进行检测，因此，在一对特异性引物的基础上提供了相应的特异性探针。可以理解，RPA扩增产物也可以采用其它方式，例如侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等进行检测；因此，如果不采用荧光检测，则可以不使用SEQ ID No.3所示序列的探针。也就是说，本申请的试剂中，可以单独使用SeqID No.1和Seq ID No.2所示序列的引物，也可以与探针一起使用，具体使用方式可以根据检测条件和环境选择。本申请的一种实现方式中，由于采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪，优选的将引物和探针一起使用，通过荧光法对RPA扩增产物进行检测。

优选的，6-荧光基团-dT为6-FAM-dT。

优选的，碱基类似物为dSpacer。

优选的，荧光淬灭基团-dT为BHQ1-dT。

需要说明的是，根据探针的设计原则，只需要在碱基类似物的两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团即可，本申请的优选方案中，优选的使用FAM荧光基团和BHQ1荧光淬灭基团。可以理解，荧光基团的选择是根据所使用的荧光检测仪的荧光通道进行的，不同的荧光检测仪具有检测一种或多种荧光基团的通道，例如FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5等；而荧光淬灭基团则是根据荧光基团进行选择的，荧光淬灭基团的吸收光谱只要能够覆盖荧光基团的发射光谱即可，不只限于BHQ1。

优选的，本申请用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂中，还包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。

需要说明的是，本申请的试剂，是特别针对猪A型塞内卡病毒的重组酶聚合酶扩增检测设计的，因此，为了使用方便，试剂中完全可以进一步的包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。其中，反应液在本申请的一种实现方式中为RehydrationBuffer，酶可以是混合有多种酶的RPA冻干酶粉，反应添加剂在本申请的一种实现方式中采用的是MgAc。

本申请的另一面公开了本申请的用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂在猪A型塞内卡病毒检测中的应用。

本申请的另一面公开了本申请的用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂在制备猪A型塞内卡病毒检测试剂盒或设备中的应用。

本申请的再一面公开了一种用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂。

本申请的再一面公开了一种猪A型塞内卡病毒的检测方法，包括采用本申请的用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂，对待测样品的核酸进行重组酶聚合酶扩增检测，并采用荧光检测仪收集荧光。

需要说明的是，本申请的检测方法，通过重组酶聚合酶扩增对猪A型塞内卡病毒进行快速检测，一方面，重组酶聚合酶扩增检测速度快，只需要十几二十分钟就可以完成检测；另一方面，整个检测只需要在相对较低的恒温下就可以完成，例如采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪即可。因此，本申请检测方法特别适合于猪A型塞内卡病毒的现场快速检测，为疫病的快速检测和防控提供有力的科学依据。

优选的，重组酶聚合酶扩增的反应条件为，40℃恒温反应20分钟。

需要说明的是，RPA所采用的酶的活性在37℃左右，RPA通常十几分钟或者在十分钟内就可以完成检测；但是，本申请优选的方案中，为了保障检测结果的准确性，优选在40℃恒温反应20分钟。

本申请的有益效果在于：

本申请用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂，能够通过重组酶聚合酶扩增，对猪A型塞内卡病毒进行敏感、特异、高效的检测。采用本申请的试剂进行猪A型塞内卡病毒检测，与现有的常规PCR或实时荧光PCR方法相比，本申请的试剂和检测方法，检测时间短，且操作简单方便，可很快做出结果判定，特别适用于现场检测，这对于猪A型塞内卡病毒的快速防控，减少经济损失，最大限度的保障生产安全具有重大意义。

附图说明

图1是本申请实施例中猪A型塞内卡病毒特异性检测结果；

图2是本申请实施例中猪A型塞内卡病毒灵敏度检测结果。

具体实施方式

近年来，多种恒温核酸扩增技术的出现解决了传统PCR技术成本高、耗时长、依赖精密温度循环仪器等局限。其中，重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)是一种新型的等温核酸扩增技术，被视为“最可能替代传统PCR”的恒温扩增技术。RPA技术主要依赖三种酶：单链DNA结合蛋白(Single-stranded DNABingding，SSB)、重组酶、链置换DNA聚合酶。该技术原理是在恒温下，重组酶与引物结合形成复合体，酶促使引物定位到DNA双链模板的同源靶序列上，并在单链DNA结合蛋白的协助下，解链模板DNA，随后在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，循环进行从而实现DNA的指数增长，反应体系中增加反转录酶则可以对RNA模板进行一步法快速扩增。RPA最佳反应温度范围是37℃至42℃，反应时间少于二十分钟。结合荧光探针使用的实时RPA检测技术，可在便携式恒温扩增荧光检测仪中实现检测结果的直接读取，极大简化了反应程序，检测时间和便利性优于传统PCR法，非常适用于设备简配的基层或现场实验室，在动物疫病检测方面具有广泛的应用前景。而目前尚未有猪A型塞内卡病毒RPA检测的相关研究，因此，本申请率先提出并研发了用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、材料与方法

1.供试核酸

本例使用的猪A型塞内卡病毒(SVA)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪水泡病病毒(SVDV)、印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IN)、新泽西型水泡性口炎病毒(VSV-NJ)、口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型和非洲猪瘟病毒(ASFV)等灭活毒株均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心(下称“深圳检验检疫局动植中心”)提供和保藏。

2.主要的试剂和仪器

病毒RNA抽提试剂盒MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit(AM1836)为美国Thermo公司产品。TwistAmp exo RT kit为英国TwistDx公司产品。

Thermo全自动磁珠提取纯化系统，BioDrop超微量核酸蛋白浓度分析仪，Axxin恒温扩增仪，Eppendorf 5415R型高速离心机等。

3.核酸的提取

使用Thermo病毒RNA抽提试剂盒MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit(AM1836)及磁珠纯化系统提取病毒核酸，具体操作方法按照核酸抽提试剂盒和全自动磁珠提取纯化系统说明书进行。分别从各灭活毒株中提取核酸，保存于-80℃，备用。

4.RPA引物和探针的设计与筛选

本例根据猪A型塞内卡病毒因组中序列保守稳定的3D基因序列，设计了多条特异性的引物和探针，设计好引物和探针后，通过BLAST比对确定其特异性，然后再用于后续试验筛选，引物和探针具体序列如表1所示。本例所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1供试引物和探针

表1中，SEQ ID No.3所示序列的SVA-RPA-P1探针中，第31个碱基修饰6-FAM-dT，第32个碱基替换为dSpacer，第33个碱基修饰BHQ1-dT，3’末端修饰C3Spacer。

5.反应体系和反应条件

本例采用TwistAmp exoRT Kit试剂盒进行RPA扩增。

反应体系为50μL。将Rehydration Buffer 29.5μL，两条浓度为10μM的引物各2.1μL，浓度为10μM的探针0.6μL，DEPC水11.2μL，核酸模板2μL混合均匀后加入到RPA冻干酶粉的反应管中，混匀，最后加入浓度为280mM的MgAc溶液2.5μL，混匀。将上述反应管置于Axxin恒温扩增仪中，40℃反应4分钟，取出混合，再继续反应16分钟，反应过程中实时读取荧光信号。

其中，两条浓度为10μM的引物是指上游引物和下游引物。

6.引物和探针筛选

在筛选的过程中，先采用其中一条上游引物，对下游引物进行筛选，然后再根据筛选出来的下游引物，再去筛选上游引物，以获得最佳的猪A型塞内卡病毒检测用引物探针组合。引物和探针筛选采用“5.反应体系和反应条件”。

7.特异性试验

采用筛选的引物和探针组合，按“5.反应体系和反应条件”，对SVA、PRV、CSFV、SVDV、VSV-IN、VSV-NJ、口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型和ASFV等9种核酸模板进行检测。并设置一个空白水对照。

8.敏感性和重复性试验

本例将SVA核酸按10倍梯度稀释至10^-6，采用各梯度浓度的稀释核酸模板，按“5.反应体系和反应条件”进行RPA试验，试验中设置一个水空白对照，以测试引物探针的灵敏性。此外，各梯度浓度的稀释核酸用RPA重复检测六次分析其稳定性。

二、结果和分析

1.引物和探针筛选

经过筛选，本例最终从表1的引物探针中，筛选出Seq ID No.1所示序列的上游引物SVA-RPA-F2、Seq ID No.2所示序列的下游引物SVA-RPA-R2和Seq ID No.3所示序列的探针SVA-RPA-P1，该引物和探针组合可用于对SVA进行特异性检测。

根据筛选结果可见，即使是相同的探针，不同的上游和下游引物组合，对重组酶聚合酶扩增的扩增效率、特异性和灵敏度都有影响。

2.特异性试验结果

特异性检测结果如图1所示，图中，曲线1为SVA核酸的检测结果、曲线2-10分别为PRV、CSFV、SVDV、VSV-IN、VSV-NJ、口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型、ASFV核酸和水空白对照的检测结果。可见，仅SVA核酸有荧光曲线，呈阳性；而其它病原核酸和水空白对照都没有荧光曲线，呈阴性。因此，本例的引物和探针能对SVA核酸进行特异性检测，与SVA、PRV、CSFV、SVDV、VSV-IN、VSV-NJ、口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型和ASFV核酸无交叉反应，具有良好的特异性。

3.灵敏性和重复性试验结果

灵敏性检测结果如图2所示，图中，曲线1至曲线4依序为SVA核酸稀释度分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3的扩增曲线，曲线5-7依序为10^-4、10^-5和水空白对照的扩增曲线。由检测结果可知，本例中RPA最低可以检测到所提取SVA核酸10^-3稀释度。测得所提取SVA核酸浓度为1.35μg/mL，10^-3稀释度对应的核酸浓度为1.35pg/μL，说明本例的SVA RPA检测方法灵敏度高，检测时间短，极大提升了检测效率。

将10⁰～10^-3各梯度浓度的稀释核酸用本例RPA方法重复检测六次，检测结果一致，均可观察到相应的荧光曲线，说明本例RPA方法重复性良好。

本例的猪A型塞内卡病毒检测方法和试剂，检测时间短，反应条件简单且无需大型仪器设备，大大提升了检测效率。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

<120> 一种用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂、检测方法及应用

<130> 17I25315

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgcgctgcc aaactggggt ataagatgac tcct 34

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttaaatcca taactggttt atataagccg tcatt 35

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agggttccgt cttccctccg acttcctctc tctccgatgc tgtttttc 48

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgccaaact ggggtataag atgactcctg ccaac 35

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cggcgcgctg ccaaactggg gtataagatg act 33

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cataactggt ttatataagc cgtcattgtt ttgga 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gattgcagct tctcgagtag tgttcctggt ttgaa 35

Claims

1.一种用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述探针在引物对的扩增靶标区域内，所述引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，所述引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者SeqID No.3所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-GCGCGCTGCCAAACTGGGGTATAAGATGACTCCT-3’

Seq ID No.2：5’-TTTAAATCCATAACTGGTTTATATAAGCCGTCATT-3’

Seq ID No.3：

5’-AGGGTTCCGTCTTCCCTCCGACTTCCTCTCTCTCCGATGCTGTTTTTC-3’

2.根据权利要求1所述的用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂，其特征在于：所述6-荧光基团-dT为6-FAM-dT。

3.根据权利要求1所述的用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂，其特征在于：所述碱基类似物为dSpacer。

4.根据权利要求1所述的用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂，其特征在于：所述荧光淬灭基团-dT为BHQ1-dT。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂，其特征在于：还包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。

6.根据权利要求1-5任一项所述的用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂在猪A型塞内卡病毒检测中的应用。

7.根据权利要求1-5任一项所述的用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂在制备猪A型塞内卡病毒检测试剂盒或设备中的应用。

8.一种用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1-5任一项所述的用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂。

9.一种猪A型塞内卡病毒的检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1-5任一项所述的用于猪A型塞内卡病毒检测的试剂，对待测样品的核酸进行重组酶聚合酶扩增检测，并采用荧光检测仪收集荧光。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述重组酶聚合酶扩增的反应条件为，40℃恒温反应20分钟。