CN105603124B - 用于i亚群禽腺病毒检测的lamp引物组及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于I亚群禽腺病毒检测的LAMP引物组，所述LAMP引物组由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成；其中，外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；内引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；环引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。利用本发明提供的LAMP引物组检测病原一般仅需60min左右，而常规PCR方法则需要4‑5h，且LAMP方法灵敏度高，最小核酸浓度为8.4×10‑ 9ng/μL，其灵敏度较常规PCR方法高104倍，不需要昂贵仪器，检测结果易于观察，安全性好。适用于在基层兽医疾病防控机构或普通养殖场推广。

Description

用于I亚群禽腺病毒检测的LAMP引物组及检测方法
技术领域
本发明涉及禽腺病毒检测方法，具体的，涉及一种基于LAMP技术的用于I亚群禽腺病毒检测的LAMP引物组及检测方法。
背景技术
禽腺病毒(fowl adenovirus，FAV)属于腺病毒科禽腺病毒属，既可水平传播，也可垂直传播，还可引起轻度呼吸道症状、产蛋下降和胰腺萎缩、坏死等。Ⅰ亚群禽腺病毒为线状双链DNA病毒，具有共同的群抗原，共12个血清型(FAV1-FAV12)。
快速诊断和及时监测是腺病毒感染防控的重要环节，腺病毒病原学诊断中可以采用病毒分离及生物学特性的鉴定的方法，但病毒的分离鉴定需要将病料接种鸡胚或组织培养，试验周期较长、操作繁琐，不能满足临床疾病防控工作的需要。其他的实验室检测方法还有双向免疫扩散(DID)试验、酶联免疫吸附(ELISA)试验、DNA原位杂交(ISH)、聚合酶链式反应(PCR)、免疫荧光(IF)等。然而上述方法在操作过程中都需要借助复杂的检测仪器，在一些基层的实验室操作时受到限制。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)能在等温(60～65℃)条件下，短时间内进行核酸扩增的方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、在恒温条件下即可完成扩增，反应结束后可通过目视、电泳、紫外激发观察等多种方法对结果进行判定。该技术具有简单、快速、特异性强的特点，在灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于常规PCR技术。但是迄今为止，还没有开发出能够灵敏特异的检测Ⅰ亚群禽腺病毒的LAMP检测技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够灵敏特异的检测Ⅰ亚群禽腺病毒的LAMP引物组及检测方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的发明人通过研究Ⅰ亚群禽腺病毒的结构蛋白功能发现，六邻体(hexon)是Ⅰ亚群禽腺病毒的主要结构蛋白，具有型、群和亚群特异抗原决定簇，是中和抗体的靶目标，因此，依据编码该蛋白基因建立起来的检测方法对于该病毒引起的疫病有重要应用价值。因此针对该蛋白的编码基因设计了一种用于I亚群禽腺病毒检测的LAMP引物组，其中，所述LAMP引物组由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成；其中，外引物对的序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；内引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；环引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了所述LAMP引物组在制备检测或诊断I亚群禽腺病毒的制剂中的用途。
本发明还提供了一种I亚群禽腺病毒检测方法，所述方法包括使用本发明所述的LAMP引物组进行LAMP扩增反应。
其中，LAMP扩增反应的条件包括：61-65℃下反应55-65min，80℃作用1.5-5min结束反应。
其中，每25μL的LAMP扩增反应的反应体系中，含有外引物对的正向引物和反向引物各10pmol，内引物对的正向引物和反向引物各20pmol，环引物对的正向引物和反向引物各10pmol。
在本发明的一种实施方式中，LAMP扩增反应的反应体系包括：Reaction Mix 12.5μL，SEQ ID NO.1(10pmol)1.0μL，SEQ ID NO.2(10pmol)1.0μL，SEQ ID NO.3(10pmol)2.0μL，SEQ ID NO.4(10pmol)2.0μL，SEQ ID NO.5(10pmol)1.0μL，SEQ ID NO.6(10pmol)1.0μL，Enzyme Mix 1.0μL，待检样品2.0μL，补充Distilled Water至总体系为25μL。
在本发明的一种实施方式中可以通过以下所列举的方法进行结果检测，
(1)直观检测：
显色法：在反应液中加入1μL钙黄绿素，阳性反应结果显示黄绿色，阴性反应保持原黄色不变，在紫外光激发下，阳性样品显示明亮荧光；
目视浊度法：将反应物离心，阳性反应结果可观察到沉淀，阴性反应无沉淀；
荧光实时监测法：加入SYBR Green显色剂，然后置于荧光定量仪实时观察；
(2)琼脂糖凝胶电泳：用2.0％的琼脂糖凝胶电泳进行分析，阳性反应呈现特有的梯状条带，阴性反应测无条带出现。
本发明还涉及一种I亚群禽腺病毒LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的LAMP引物组。
本发明所述的试剂盒还包括LAMP反应试剂，所述LAMP反应试剂内含ReactionMix、Enzyme Mix和Distilled Water及显色剂。
Reaction Mix、Enzyme Mix和Distilled Water均可按照常规现有方法制备，所述引物可按照现有方法制成冻干粉，经HPLC纯化，显色剂优选为钙黄绿素。
本发明通过研究I亚群禽腺病毒的结构蛋白功能，找到了适用于12个血清型检测的靶位点，设计了具有高灵敏度和特异性的LAMP引物组，利用本发明提供的LAMP引物组检测病原一般仅需60min左右，而常规PCR方法则需要4-5h，且LAMP方法灵敏度高，最小核酸浓度为8.4×10-9ng/μL，其灵敏度较常规PCR方法高104倍，不需要昂贵仪器，检测结果易于观察，安全性好。适用于在基层兽医疾病防控机构或普通养殖场推广。
附图说明
图1为LAMP体系优化结果，
图1A中1～5分别为反应混合物的反应温度分别为61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，M为DL2000-plus marker；
图1B中1～4分别为反应混合物的反应时间分别为20min、40min、60min、80min，5为阴性对照，M为DL2000-plus marker。
图2为LAMP特异性试验
1～12分别为FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8、FAdV-9、FAdV-10、FAdV-11、FAdV-12，13为阴性对照，14～18分别为产蛋下降综合征病毒、禽呼肠孤病毒、禽传染性法氏囊病病毒、禽传染性支气管炎病毒、新城疫病毒，M为DL2000-plus marker。
图3为LAMP敏感性试验，1～12为10倍梯度稀释的FAdV DNA(8.4ng/μL～8.4×10- 12ng/μL),13为阴性对照，M为DL2000-plus marker。
图4为敏感性试验，常规PCR检测结果，1～12为10倍梯度稀释的FAdV DNA(8.4ng/μL～8.4×10-12ng/μL),13为阴性对照，M为DL2000-plus marker。
图5为在反应体系中加入显色剂，反应结束后置于紫外灯下照射，1为加入腺病毒模板的反应液发出明亮荧光，2为阴性对照。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
1试验材料和方法
1.1主要试剂
Ⅰ亚群禽腺病毒12个血清型标准毒株禽腺病毒1型～12型，购自中国兽医药品监察所，产蛋下降综合征病毒(EDSV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、禽传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(ND)、禽腺病毒分离毒株(FAdV)等，均为实验室保存的本领域常规毒株。
DNA恒温扩增试剂盒购自安洁优科技有限公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit购自北京全式金生物技术有限公司；SYBR Green I购自Invitrogen公司；钙黄绿素购自日本荣研公司。
1.2引物设计
针对Ⅰ亚群禽腺病毒hexo基因的保守区域设计6条引物，分别是外引物(FAdV-F3(SEQ ID No.1所示)和FAdV-B3(SEQ ID No.2所示))，内引物(FAdV-FIP(SEQ ID No.3所示)和FAdV-BIP(SEQ ID No.4所示))和环引物(FAdV-LF(SEQ ID No.5所示)和FAdV-LB(SEQ IDNo.6所示))(表1)。
表1 LAMP因组
1.3 DNA提取
取I亚群禽腺病毒12个血清型标准毒株，4株禽腺病毒分离毒株，使用北京全式金生物技术有限公司EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒，按照说明书从200μL病毒液中提取病毒DNA，最后溶于30μL RNase-free Water中，-80℃冰箱中储存备用。
1.4 LAMP检测
(1)平行设置5个实验组，FAdV LAMP反应总体积为25μL，将反应温度分别设为61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，反应时间为60min，80℃作用2min终止反应。
25μL的LAMP反应体系为：Reaction Mix 12.5μL，SEQ ID No.1(10pmol)1.0μL，SEQID No.2(10pmol)1.0μL，SEQ ID No.3(10pmol)2.0μL，SEQ ID No.4(10pmol)2.0μL，SEQ IDNo.5(10pmol)1.0μL，SEQ ID No.6(10pmol)1.0μL，Enzyme Mix 1.0μL，待检样品2.0μL，补充Distilled Water至25μL。
反应产物以2％琼脂糖凝胶进行电泳分析，结果如图1A所示。
(2)平行设置4个实验组，反应时间设置为20min、40min、60min、80min，反应温度为65℃。80℃作用2min终止反应。
25μL的LAMP反应体系为：
Reaction Mix 12.5μL，SEQ ID No.1(10pmol)1.0μL，SEQ ID No.2(10pmol)1.0μL，SEQ ID No.3(10pmol)2.0μL，SEQ ID No.4(10pmol)2.0μL，SEQ ID No.5(10pmol)1.0μL，SEQ ID No.6(10pmol)1.0μL，Enzyme Mix 1.0μL，待检样品2.0μL，补充Distilled Water至25μL。
反应产物以2％琼脂糖凝胶进行电泳分析，结果如图1B所示。
实施例2特异性研究
取正常鸡胚尿囊液、产蛋下降综合征病毒、禽呼肠孤病毒、禽传染性法氏囊病病毒、禽传染性支气管炎病毒、新城疫病毒，同时设I亚群禽腺病毒12个血清型的DNA模板进行扩增，进行LAMP方法的特异性检测。
25μLLAMP反应体系为：
Reaction Mix 12.5μL，SEQ ID No.1(10pmol)1.0μL，SEQ ID No.2(10pmol)1.0μL，SEQ ID No.3(10pmol)2.0μL，SEQ ID No.4(10pmol)2.0μL，SEQ ID No.5(10pmol)1.0μL，SEQ ID No.6(10pmol)1.0μL，Enzyme Mix 1.0μL，待检样品2.0μL，补充Distilled Water至25μL。
反应条件：65℃恒温60min，80℃作用2min终止反应。
观察可视化结果，并取2μL LAMP反应产物于2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
结果显示，只有I亚群禽腺病毒12血清型扩增出特征性梯状条带，而其他模板未见扩增条带(图2)，说明该LAMP方法的特异性较好。
实施例3灵敏度研究
提取I亚群禽腺病毒DNA，测得浓度后，进行10倍系列稀释，DNA浓度为8.4ng/μL～8.4×10-12ng/μL，同时用建立的LAMP和常规PCR进行检测，常规PCR引物序列为：
H3：AACGTCAACCCCTTCAACCACC，
H4：TTGCCTGTGGCGAAAGGCGG，
比较LAMP与常规PCR检测的灵敏度。
25μL LAMP反应体系为：
Reaction Mix 12.5μL，SEQ ID No.1(10pmol)1.0μL，SEQ ID No.2(10pmol)1.0μL，SEQ ID No.3(10pmol)2.0μL，SEQ ID No.4(10pmol)2.0μL，SEQ ID No.5(10pmol)1.0μL，SEQ ID No.6(10pmol)1.0μL，Enzyme Mix 1.0μL，待检样品2.0μL，补充Distilled Water至25μL。
反应条件：65℃恒温60min，80℃2min终止反应。
25μL PCR反应体系为：
10×Taq Buffer 2.5μL，H3(10pmol)1.0μL，H4(10pmol)1.0μL，2.5mM dNTPs 2μL，待检样品2.0μL，DNA Polymerase 0.5μL，Distilled Water至25μL。
反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30s、55℃退火45s、72℃延伸1.5min，共35个循环，最后72℃延伸8min。
将反应产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，结果(图3)显示，LAMP可以检测到DNA浓度为8.4×10-9ng/μL，而常规PCR仅能检测到8.4×10-5ng/μL(图4)。
实施例4可视化检测结果鉴定
使用北京全式金生物技术有限公司EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒，按照说明书从200μL病毒液中提取I亚群禽腺病毒DNA，最后溶于30μL RNase-free Water中，-80℃冰箱中储存备用。进行LAMP扩增反应：
25μLLAMP反应体系为：
Reaction Mix 12.5μL，SEQ ID No.1(10pmol)1.0μL，SEQ ID No.2(10pmol)1.0μL，SEQ ID No.3(10pmol)2.0μL，SEQ ID No.4(10pmol)2.0μL，SEQ ID No.5(10pmol)1.0μL，SEQ ID No.6(10pmol)1.0μL，Enzyme Mix 1.0μL，待检样品2.0μL，补充Distilled Water至25μL。
反应条件：65℃恒温60min，80℃2min终止反应。
在反应体系中加入1μL钙黄绿素显色剂，在自然光下，阳性结果显示黄绿色，阴性结果显示黄色。在紫外光下阳性观察结果显示明亮荧光(如图5所示)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.用于I亚群禽腺病毒检测的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成；其中，外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；内引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；环引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
2.一种非诊断目的的I亚群禽腺病毒检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的LAMP引物组进行LAMP扩增反应。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，LAMP扩增反应的条件包括：61-65℃下反应55-65min，80℃作用1.5-5min结束反应。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，每25μL的LAMP扩增反应的反应体系中，含有外引物对的正向引物和反向引物各10pmol，内引物对的正向引物和反向引物各20pmol，环引物对的正向引物和反向引物各10pmol。
5.一种I亚群禽腺病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的LAMP引物组。
6.权利要求1所述的LAMP引物组在制备检测或诊断I亚群禽腺病毒的制剂中的用途。
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