CN106435031A

CN106435031A - 一种特异检测ⅰ群禽腺病毒pcr检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN106435031A
Application number: CN201611022045.4A
Authority: CN
Inventors: 罗玲; 温国元; 罗青平; 邵华斌; 王红琳; 汪宏才; 卢琴; 张腾飞; 艾地云; 张蓉蓉; 李林涛
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2016-11-16
Publication date: 2017-02-22

Abstract

本发明涉及一种特异检测Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒及其检测方法。所述检测试剂盒包括：Ⅰ群禽腺病毒PCR反应液、10×PCR buffer for UNG plus、热启动型DNA聚合酶、dU plus dNTP mix、尿嘧啶DNA糖基化酶、阳性质控品和阴性质控品；其中，所述Ⅰ群禽腺病毒PCR反应液包括：浓度为5μM的上游引物，其序列为5‘‑ATGGCCAAYTTCATGCCCATGG‑3’；浓度为5μM的下游引物，其序列为5‘‑GTGGAAGTACTGWCKGTCGGGCCAG‑3’。使用上述PCR检测试剂盒进行检测时，PCR扩增反应的条件为：25℃UNG处理10min，95℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。本发明的试剂盒具有灵敏度高(稀释到1:10⁵仍然为阳性)、重复性好的特点，且操作简单、方便快捷，适合Ⅰ群禽腺病毒病的早期诊断，能够及时满足疾病防控的需求。

Description

一种特异检测Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明所涉及的是一种特异检测Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒及其检测方法，属于病毒核酸检测领域。

背景技术

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，根据其群特异性抗原的不同，禽腺病毒可分为3群：Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群。Ⅰ群禽腺病毒主要从鸡、火鸡、鹅及其他禽类获得，分为5个种(A-E)，每个种内的病毒主要根据交叉中和实验结果进一步分为12个血清型(FAdV1-12)，它们有共同的群抗原。Ⅰ群禽腺病毒主要引起包涵体肝炎、心包积水综合征等，发病率高，死亡率高，2015-2016年我国较多省份爆发了该病，给养禽业造成了严重的经济损失。同时，该病既可水平传播，也可垂直传播，给该病的防控带来了巨大的挑战，因此建立快速、敏感和特异的诊断方法和试剂盒是防控该病的关键。目前，检测Ⅰ群禽腺病毒的诊断方法有病毒分离、电镜观察、琼脂扩散试验和ELISA等，这些传统方法费时、繁琐，使得该病不能得到及时诊断，从而影响了该病的流行病学监测和净化，造成严重的经济损失。六邻体hexon是禽腺病毒的主要结构蛋白，带有主要属和亚属特异性抗原决定簇以及次要种特异性抗原决定簇，是中和抗体的靶目标和主要保护性抗原基因，与致病性密切相关，因此作为诊断抗原具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的上述缺陷，建立一种特异检测Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明在GenBank选择23株Ⅰ群禽腺病毒Hexon基因全/部分序列，涵盖Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型(FAdV1-12)，把这23株序列用ClustalX软件进行比对分析，寻找最为保守的区域，作为引物设计区域，并用兼并碱基Y代表C和T、K代表G和T、W代表A和T，最终设计并合成1对兼并引物，并以该引物为核心组装了一种用于检测Ⅰ群禽腺病毒的PCR试剂盒。该试剂盒具有使用方便、检测准确等特点，对该病的流行病学调查及防控具有重要意义。

本发明为解决上述技术问题而采取的技术方案为：

一种特异检测Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：

Ⅰ群禽腺病毒PCR反应液、10×PCR buffer for UNG plus、热启动型DNA聚合酶(HotStar Taq DNA Polymerase)、dU plus dNTP mix(dUTP、dATP、dGTP、dCTP的混合物)、尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)、阳性质控品和阴性质控品；其中，所述Ⅰ群禽腺病毒PCR反应液包括：

(1)浓度为5μM的上游引物，其序列为5‘-ATGGCCAAYTTCATGCCCATGG-3’，

(2)浓度为5μM的下游引物，其序列为5‘-GTGGAAGTACTGWCKGTCGGGCCAG-3’。

其中，所述的尿嘧啶DNA糖基化酶主要用于防止PCR扩增产物的污染。PCR反应中加入的UNG酶能选择性断裂单链和双链DNA中U碱基的糖苷键，降解反应体系中含U的DNA，有效消除PCR产物的残留污染，大大降低扩增产物污染导致的假阳性。

按上述方案，优选地，所述阳性质控品为含有目的基因片段的质粒,其由下述方法提取得到:

将Ⅰ群禽腺病毒标准毒株在CEK细胞上传代增殖,-40℃/常温条件下冻融2次，然后6000r/min，离心10min，取上清提取DNA。

按上述方案，优选地，所述阴性质控品为从健康且无病原的鸡只组织提取的DNA,具体提取方法如下:

采集健康且无病原的鸡只组织，按质量体积比1g：10mL加入含1％双抗的PBS，充分匀浆破碎，-40℃/常温条件下冻融2次，然后6000r/min，离心10min，去除沉淀，取上清提取DNA所得。其中，所述鸡只组织包括但不限于鸡的肝脏、心脏等组织。

按上述方案，优选地，所述检测试剂盒中各种试剂的含量为：

本发明还提供上述的特异检测Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤具体为：

1)配制PCR反应体系：分别配制待检样品DNA模板、阳性对照、阴性对照的PCR反应体系，具体如下：

取待检样品DNA模板、阳性质控品、阴性质控品各1.0μL，各加入所述10×PCRbuffer for UNG plus 5μL、热启动型DNA聚合酶0.25μL、dU plus dNTP mix 4μL、Ⅰ群禽腺病毒PCR反应液2μL和尿嘧啶DNA糖基化酶0.5μL，再各用灭菌ddH₂O补足至50μL，分别得待检样品DNA模板的PCR反应体系、阳性对照的PCR反应体系和阴性对照的PCR反应体系；

2)进行PCR扩增反应；

3)结果判定。

按上述方案，优选地，步骤1)中所述待检样品DNA模板由下述方法提取得到：

取待检组织样品0.1g，加入含1％双抗的PBS 1mL，匀浆15min，-40℃/常温条件下反复冻融两次，6000r/min，离心10min，取上清，提取DNA，得待检样品DNA模板。其中，待检组织样品包括但不限于鸡、火鸡、鹅及其它禽类的肝脏、心脏等组织。

按上述方案，优选地，步骤2)中所述PCR扩增反应的进行条件为：25℃UNG处理10min，95℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

按上述方案，优选地，步骤2)中所述结果判定方法如下：

电泳紫外灯下观察，阳性对照有一条530bp的清晰条带，阴性对照无条带；若待检样品电泳紫外灯下观察出现大小约为530bp的条带，即为阳性，表明该样品含有该病毒；若待检样品紫外灯下观察无条带，则为阴性，表明该样品不含该病毒。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明的试剂盒特异性强。该试剂盒的引物在设计时所选Hexon基因序列涵盖Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型(FAdV1-12)，并且引入合适数量的兼并碱基，同时试剂盒含有防污染试剂，并以dUTP代替传统的dTTP，形成了含dU碱基的PCR扩增产物，从而保证特异且准确地检测Ⅰ群禽腺病毒的1-12个血清型，为Ⅰ群禽腺病毒病的早期诊断和流行病学调查提供了一种有效手段。

2、本发明的试剂盒具有灵敏度高(稀释到1:10⁵仍然为阳性)、重复性好的特点，且操作简单、方便快捷，适合Ⅰ群禽腺病毒病的早期诊断，能够及时满足疾病防控的需求。

附图说明

图1为本发明实施例3中Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒敏感性检测的结果。

图2为本发明实施例3中Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒特异性检测的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应当理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。

实施例1

Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒组成与配制

1、试剂组成

禽腺病毒标准毒株购自中国兽药监察所；10×PCR buffer for UNG plus、HotStar Taq DNA Polymerase(5U/μL)、UNG(5U/μL)和dU plus dNTP mix(12.5×)购自TaKaRa公司，将dU plus dNTP mix(12.5×)稀释12.5倍后得到dU plus dNTP mix；引物由上海生物工程公司合成；ddH₂O为本实验室自制。

2、引物设计与合成：

在GenBank选择23株Ⅰ群禽腺病毒Hexon基因全/部分序列，涵盖Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型(FAdV1-12)，把这23株序列用ClustalX软件进行比对分析，寻找最为保守的区域，作为引物设计区域，并用兼并碱基Y代表C和T、K代表G和T、W代表A和T，最终设计并合成1对兼并引物。上游引物序列为5‘-ATGGCCAAYTTCATGCCCATGG-3’，下游引物序列为：5‘-GTGGAAGTACTGWCKGTCGGGCCAG-3’。

3、Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒，包括

4、试剂配制

(1)Ⅰ群禽腺病毒PCR反应液的制备：分别将0.002μmol的上游引物(序列为5‘-ATGGCCAAYTTCATGCCCATGG-3’)和0.002μmol的下游引物(5‘-GTGGAAGTACTGWCKGTCGGGCCAG-3’)各自加入到200μL灭菌的ddH₂O中，混合，配制成400μL的Ⅰ群禽腺病毒PCR反应液，其中所述上游引物和下游引物的终浓度均为5μM；

(2)阳性质控品的制备：Ⅰ群禽腺病毒标准毒株(毒株编号AV211)在CEK细胞上传代增殖,-40℃/常温条件下冻融2次，然后6000r/min，离心10min，取上清提取DNA,即含有目的基因片段的质粒；

(3)阴性质控品的制备：采集健康且无病原的鸡只心脏、肝脏等组织，按质量体积比1g：10mL加入含1％双抗的PBS，充分匀浆破碎，-40℃/常温条件下冻融2次，然后6000r/min，离心10min，去除沉淀，取上清提取DNA所得；

(4)自备试剂：灭菌的双蒸水ddH₂O。

实施例2

实施例1配制的Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒的使用方法，具体步骤如下：

1)样品处理：将收集到的待检样品的肝脏、心脏等组织0.1g，加入含1％双抗的PBS1mL匀浆15min，-40℃/常温条件下反复冻融两次，6000r/min，离心10min，取上清待检；

2)待检样品DNA提取：取步骤1)处理的待检样品上清，提取DNA，作为待检样品DNA模板；

3)配制PCR反应体系：取阳性质控品、阴性质控品、步骤2)得到的待检样品DNA模板各1.0μL分别加入不同的PCR反应管中，并向各管加入10×PCR buffer for UNG plus 5μL、HotStar Power Taq DNA Polymerase 0.25μL、dU plus dNTP mix 4μL、Ⅰ群禽腺病毒PCR反应液2μL和UNG 0.5μL，最后加灭菌ddH₂O补至50μL，混匀；

4)PCR扩增：将步骤3)配成的反应体系分别按照如下反应条件进行PCR反应：25℃10min(UNG处理)，95℃预变性2min；98℃变性10S，55℃退火30S，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；

5)结果判定：电泳紫外灯下观察，阳性对照有一条530bp的清晰条带，阴性对照无条带；若待检样品电泳紫外灯下观察出现大小约为530bp的条带，即为阳性，表明该样品含有该病毒；若待检样品紫外灯下观察无条带，则为阴性，表明该样品不含该病毒。

实施例3

Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒的初步应用

1、敏感性试验

将Ⅰ群禽腺病毒标准毒株在CEK细胞上传代增殖,冻融3次，然后离心取上清提取DNA(浓度为25ng/μL),将提取的DNA进行系列稀释(1:10、1:10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶、1:10⁷)，并将系列稀释的DNA作为模板，用本发明实施例1配制的Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒，按照实施例2中所述方法进行检测，检测结果显示：将提取的Ⅰ群禽腺病毒DNA稀释到1:10⁵时，结果仍然为阳性(见图1和表1)，试验结果表明实施例1配制的Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒敏感性较好。

表1

编号

1

2

3

4

5

6

7

稀释度

1:10

1:10²

1:10³

1:10⁴

1:10⁵

1:10⁶

1:10⁷

PCR检测结果

阳性

阴性

2、特异性试验

用本发明实施例1配制的Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒，按照实施例2中所述方法对标准毒株禽腺病毒4型(FAdV-4，Ⅰ群禽腺病毒)和10型(FAdV-10，Ⅰ群禽腺病毒)、5株临床分离禽腺病毒4型(FAdV-4临1-3、5-6)、产蛋下降综合征(EDS，Ⅲ群禽腺病毒)、新城疫、禽流感、大肠杆菌等进行检测，试验结果：标准毒株Ⅰ群禽腺病毒4型和10型以及5株临床分离禽腺病毒4型检测结果均为阳性，产蛋下降综合征、新城疫、禽流感、大肠杆菌等检测结果均为阴性(见表2)，试验结果表明特异性较好。

表2

3、临床样品检测：

对30份不同地区采集的鸡和鹅心脏、肝脏等疑似病料，用本发明的检测试剂盒进行检测，共检出阳性样品26份。将阳性样品PCR产物送上海生物工程公司进行测序，与GenBank中登陆的hexon基因序列进行比对分析，结果均为Ⅰ群禽腺病毒。以上试验结果充分表明该试剂盒在临床样品的检测中具有很好的特异性。

4、重复性试验：

(1)批内重复性试验：取同一批次3个试剂盒对已感染的6份阳性样品和2份阴性样品进行检测，结果显示已感染的6份阳性样品全部扩增出目的条带，而2份阴性样品均未扩增出目的条带，表明本试剂盒具有较好的批内重复性(见表3)。

(2)批间重复性试验：取不同批次的3个试剂盒对6份阳性样品和2份阴性样品进行检测，结果显示已感染的6份阳性样品全部扩增出目的条带，而2份阴性样品均未扩增出目的条带，表明本试剂盒具有较好的批间重复性(见表4)。

表3批内重复性试验结果

表4批间重复性试验结果

序列表

<110>湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>一种特异检测Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒及其检测方法

<160>2

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<223>上游引物

<400>1

ATGGC CAAYT TCATG CCCAT GG 22

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<223>下游引物

<400>2

GTGGA AGTAC TGWCK GTCGG GCCAG 25

Claims

1.一种特异检测Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：

Ⅰ群禽腺病毒PCR反应液、10×PCR buffer for UNG plus、热启动型DNA聚合酶、dUplus dNTP mix、尿嘧啶DNA糖基化酶、阳性质控品和阴性质控品；其中，所述Ⅰ群禽腺病毒PCR反应液包括：

2.根据权利要求1所述的特异检测Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有目的基因片段的质粒,其由下述方法提取得到:

3.根据权利要求1所述的特异检测Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为从健康且无病原的鸡只组织提取的DNA,具体提取方法如下:

采集健康且无病原的鸡只组织，按质量体积比1g:10mL加入含1％双抗的PBS，充分匀浆破碎，-40℃/常温条件下冻融2次，然后6000r/min，离心10min，去除沉淀，取上清提取DNA所得。

4.根据权利要求1-3任一项所述的特异检测Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中各种试剂的含量为：

。

5.权利要求4所述的特异检测Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤具体为：

取待检样品DNA模板、阳性质控品、阴性质控品各1.0μL，各加入所述10×PCR bufferfor UNG plus 5μL、热启动型DNA聚合酶0.25μL、dU plus dNTP mix 4μL、Ⅰ群禽腺病毒PCR反应液2μL和尿嘧啶DNA糖基化酶0.5μL，再各用灭菌ddH₂O补足至50μL，分别得待检样品DNA模板的PCR反应体系、阳性对照的PCR反应体系和阴性对照的PCR反应体系；

2)进行PCR扩增反应；

3)结果判定。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中所述待检样品DNA模板由下述方法提取得到：

取待检组织样品0.1g，加入含1％双抗的PBS 1mL，匀浆15min，-40℃/常温条件下反复冻融两次，6000r/min，离心10min，取上清，提取DNA，得待检样品DNA模板。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增反应的进行条件为：

25℃UNG处理10min，95℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中所述结果判定方法如下：