CN110699489B - 非洲猪瘟病毒cd2v基因的实时荧光pcr检测引物探针组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种非洲猪瘟病毒CD2V基因的实时荧光PCR检测引物探针组、试剂盒及检测方法。本发明的引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。本发明所提供的引物探针组及试剂盒可以快速、方便、高效、特异地检测样本中是否含有非洲猪瘟病毒及鉴别是否为CD2V基因缺失，适宜于临床的鉴别检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及非洲猪病病毒CD2V基因核酸荧光PCR检测引物探针组、试剂盒及检测方法。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是一种高发病性、高死亡性的急性猪传染病，对猪和猪产品国际贸易产生巨大卫生和社会经济影响。ASF的流行病学非常复杂，可以经过许多途径传播，如饲料、运输、虫媒等等。该病的致病因子非洲猪瘟病毒(ASFV)是非洲猪瘟病毒科家族的唯一成员，属Asfivirus。它是一种复杂的包膜病毒，具有二十面体形态，由四个同心层和一个大的双链DNA分子组成，长度在170至193kbp之间。
疫苗接种是传染病的最佳控制措施之一。目前在非洲猪瘟疫苗的研究中主要集中在灭活疫苗、弱毒疫苗、病毒活载体疫苗、核酸疫苗等。灭活疫苗指运用物理或化学方法去除病原活性，感染能力丧失，但仍具有抗原性。到目前为止，运用多种传统方法制备的ASF灭活疫苗都不能对猪提供有效的免疫保护。弱毒疫苗以不同的毒株来源分为三种：天然致弱病毒株、传代致弱毒株以及重组致弱毒株。大量实验结果表明：天然弱毒株及传代弱毒株在生物安全方面仍存在问题。目前在我国研究者根据非洲猪瘟病毒在中国的流行株的基因型别，开发了一系列的重组弱毒株疫苗，通过生物技术方法，将ASFV中的某个或某几个基因进行敲出，制备出基因缺失疫苗，其中CD2V基因缺失疫苗是研究最多的一种基因缺失ASFV疫苗。
由于当前对非洲猪瘟病毒CD2V基因缺失的疫苗的研究数据还不充分，其具体的免疫效果仍有待进一步的研究，在疫苗使用过程中需要对ASFV野毒株和CD2V基因缺失的疫苗株进行区分鉴定，从而实现对使用疫苗的有非洲猪瘟症状的猪群的感染源进行正确的鉴别。
发明内容
基于上述背景介绍，本发明的目的是提供一种非洲猪瘟病毒CD2V基因的实时荧光PCR检测引物探针组、试剂盒及检测方法。
作为本发明的第一方面，本发明提供一种非洲猪病病毒CD2V基因的实时荧光PCR检测引物探针组。
作为优选，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
作为优选，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。
作为本发明的第二方面，本发明提供一种非洲猪病病毒CD2V基因的实时荧光PCR检测试剂盒。
作为优选，所述试剂盒包括非洲猪病病毒CD2V基因的实时荧光PCR检测引物探针组，其中，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
作为优选，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。
作为优选，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。
作为优选，所述阳性对照品为含有非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区序列的阳性质粒，所述阳性质粒的碱基序列如SEQ ID NO.10所示。
作为优选，所述阴性对照品为ddH2O。
作为优选，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、PCR底物、MgCl2、DNA聚合酶和/或水解酶。
作为本发明的第三方面，本发明提供一种非洲猪病病毒CD2V基因的实时荧光PCR检测方法。
作为优选，所述检测方法包括如下步骤：提取待测样本的DNA，以待测样本的DNA为模板，采用本发明所述的试剂盒进行实时荧光PCR反应，根据实时荧光PCR扩增曲线分析待测样本，确定待测样本是否存在非洲猪病病毒CD2V基因。
具体如下：提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA为模板，在非洲猪瘟病毒CD2V基因的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及PCR Mix存在下进行实时荧光PCR反应，根据实时荧光PCR扩增曲线分析待测样品；其中所述非洲猪瘟病毒CD2V基因正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示、所述非洲猪瘟病毒CD2V基因反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
作为优选，所述实时荧光PCR反应程序为：50℃，1min；95℃，5min；95℃，15s，60℃，30s，共计45个循环。
本发明所述检测方法需要实时荧光PCR反应结束后，利用实时荧光PCR仪分析软件，根据实时荧光PCR的扩增曲线分析待测样品。优选的，当待测样本FAM通道扩增曲线呈“S”型且CT值≤40，判断为非洲猪瘟病毒CD2V基因阳性结果，则当前样本为非洲猪瘟野毒株感染样本；当待测样本无明显扩增曲线且CT值≥45，判断为非洲猪瘟病毒CD2V基因阴性结果，则当前样本为非洲猪瘟CD2V疫苗猪或阴性猪只；当待测样本FAM通道扩增曲线呈“S”型且40＜CT值＜45，判为可疑，需要排除环境污染造成的不准确结果后，再次检测，若样本的结果仍然为40＜Ct值＜45，则该待测样本判为非洲猪瘟病毒CD2V基因阳性。
作为本发明的第四方面，本发明提供了本发明所述的引物探针组、试剂盒在用于检测非洲猪瘟病毒CD2V基因中的应用。本发明所提供的引物探针组及试剂盒可以快速、方便、高效、特异地检测样本中是否含有非洲猪瘟病毒及鉴别是否为CD2V基因缺失，适宜于临床的鉴别检测
本发明的有益效果为：
(1)快速高效：本发明的方法省时、方便、快捷，检测周期短；
(2)高特异性：本发明与非猪猪瘟病毒CD2V基因以外的基因、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪蓝耳病病毒(PPRSV)等均无交叉反应；
(3)高灵敏度：检测灵敏度可达到101copies/μL；
(4)鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，避免核酸扩增产物开盖污染的风险。
附图说明
图1为本发明中涉及的4对引物PCR扩增曲线图。
图2为PCR检测方法对非洲猪瘟病毒CD2V基因的灵敏度实验图，从左到右依次为106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、100copies/μL7个的阳性质粒的扩增结果。
图3为PCR检测方法对非洲猪瘟病毒CD2V基因的特异性实验图。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若无特别指明，实施例中采用的方法为本领域通用技术，所有的设备和原料等均为本行业常用产品，可从市场中购得。
实施例1：非洲猪瘟病毒CD2V基因的荧光PCR检测引物探针组的设计
本实施例参考GenBank上已公布的非洲猪瘟病毒CD2V基因序列，使用DNAMAN 6.0软件对多序列进行比对。大量实验表明，不同的引物对PCR扩增的效果和灵敏度具有一定的影响。因此，本研究针对目的基因片段初步各设计了3组引物探针：CD2V-1、CD2V-2和CD2V-3(引物序列如表1所示)，3组引物探针序列可和非洲猪瘟病毒CD2V基因的相应序列特异性结合。其中，上述3组引物扩增目的片段的大小分别为145bp、106bp、164bp。
表1 CD2V-1、CD3V-2和CD2V-3序列信息
分别将CD2V基因的3组引物探针用阳性质粒进行引物探针筛选，3组引物探针的扩增曲线如图1所示。由图1结果可见，CD2V-2引物探针配对组的扩增曲线最优，出峰最早，荧光强度最高(纵坐标值)并且有明显的指数期和平台期，其它引物探针曲线上升峰高较低，出峰时间较晚，相对表现较差。说明CD2V-2引物探针组扩增反应效率更高。其中，该特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，具体为：5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团
实施例2：非洲猪瘟病毒CD2V基因的荧光PCR检测试剂盒及检测方法
本实施例提供了一种非洲猪瘟病毒CD2V基因的荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包括PCR反应混合液、阳性对照品和阴性对照品。
PCR反应混合液的成分及各成分的反应终浓度如下：1*PCR Buffer、1mmol/LdNTP、2.5mmol/L MgCl2、400nmol/L引物混合液、100nmol/L特异性荧光探针、3U DNA聚合酶、0.5U UNG酶。
本实施例所述的引物混合液中，所述的正向引物碱基序列如SEQ ID No.4所示，所述反向引物的碱基序列SEQ ID No.5所示，其中，正向引物和反向引物的摩尔配比为1:1。
本实施例提供的非洲猪瘟病毒CD2V基因的特异性探针碱基序列如SEQ ID No.6所示，探针的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团。
本实施例提供的阳性对照品为含有非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区序列的阳性质粒，阴性对照品为ddH2O。
含有非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区序列的阳性质粒的碱基序列如下：
ATGATAATACTTATTTTTTTAATATTTTCTAACATAGTTTTAAGTATTGATTATTGGGTTAGTTTTAATAAAACAATAATTTTAGATAGTAATATTACTAATGATAATAATGATATAAATGGAGTATCATGGAATTTTTTTAATAATTCTTTTAATACACTAGCTACATGTGGAAAAGCAGGTAACTTTTGTGAATGTTCTAATTATAGTACATCAATATATAATATAACAAATAATTGTAGCTTAACTATTTTTCCTCATAATGATGTATTTGATACAACATATCAAGTAGTATGGAATCAAATAATTAATTATACAATAAAATTATTAACACCTGCTACTCCCCCAAATATCACATATAATTGTACTAATTTTTTAATAACATGTAAAAAAAATAATGGAACAAACACTAATATATATTTAAATATAAATGATACTTTTGTTAAATATACTAATGAAAGTATACTTGAATATAACTGGAATAATAGTAACATTAACAATTTTACAGCTACATGTATAATTAATAATACAATTAGTACATCTAATGAAACAACACTTATAAATTGTACTTATTTAACATTGTCATCTAACTATTTTTATACTTTTTTTAAATTATATTATATTCCATTAAGCATCATAATTGGGATAACAATAAGTATTCTTCTTATATCCATCATAACTTTTTTATCTTTACGAAAAAGAAAAAAACATGTTGAAGAAATAGAAAGTCCACCACCTGAATCTAATGAAGAAGAACAATGTCAGCATGATGACACCACTTCCATACATGAACCATCTCCCAGAGAACCATTACTTCCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAGTATAATACACCTATTTACTACATGCGTCCCTCAACACAACCACTCAACCCATTTCCCTTACCTAAACCGTGTCCTCCACCCAAACCATGTCCGCCACCCAAACCATGTCCTCCACCTAAACCATGTCCTTCAGCTGAATCCTATTCTCCACCCAAACCACTACCTAGTATCCCGCTACTACCCAATATCCCGCCATTATCTACCCAAAATATTTCGCTTATTCATGTAGATAGAATTATTTAA(SEQ ID No.10)。
应用本实施例的试剂盒对样本中的非洲猪瘟病毒CD2V基因进行检测：
1、样品核酸的提取
1.1、核酸提取：采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)，按照说明步骤提取待测样本基因组DNA。
2、PCR反应体系的配置：每个检测样品对应一个PCR反应管，每个PCR反应管中各反应组分和所加入的体积如表2所示。
表2反应体系配置表:
| PCR反应体系组分 | 体积(μL) |
| PCR反应混合液 | 45 |
| DNA模板 | 5 |
| 总体积 | 50 |
进一步地，本发明建立的方法中为了避免所用试剂失效或受到污染，设置有阳性对照品及阴性对照品，其中，阴性对照品为ddH2O，阳性对照品为含有非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区序列的阳性质粒，该阳性质粒的碱基序列如SEQ ID No.10所示。阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证受用试剂的有效性，避免假阴性的发生。
3、将配置好反应体系的PCR反应管放置于ABI7500扩增仪中，按照下列程序进行PCR扩增：50℃，1min；95℃，5min；95℃15s，60℃30s(荧光采集)，共计45个循环。每个循环收集FAM和VIC通道的荧光。
4、扩增结束后根据荧光曲线判断和CT值判定待检样本结果。
待测样本FAM通道扩增曲线呈“S”型且CT值≤40，判断为非洲猪瘟病毒CD2V基因阳性结果，则当前样本为非洲猪瘟野毒株感染样本；当待测样本无明显扩增曲线且CT值≥45，判断为非洲猪瘟病毒CD2V基因阴性结果，则当前样本为非洲猪瘟CD2V疫苗猪或阴性猪只；当待测样本FAM通道扩增曲线呈“S”型且40＜CT值＜45，判为可疑，需要排除环境污染造成的不准确结果后，再次检测，若样本的结果仍然为40＜Ct值＜45，则该待测样本判为非洲猪瘟病毒CD2V基因阳性。
实施例3：应用本发明的试剂盒进行实际样本检测
为验证本发明所述引物、探针、试剂在实际情况下能正常使用，于是模拟实际情况，使用本发明的引物、探针、试剂对实际样本进行检测。实际样本由青岛农业大学动物健康检测与评价中心提供，共12份，其中4份为ASFV野毒株阳性猪血清、4份为CD2V基因缺失疫苗株阳性猪血清、4份为正常猪(野毒株和疫苗株均阴性)血清。检测结果与已知PCR检测结果一致，符合率100％。
本发明具有快速、实时、灵敏、准确、的鉴别ASFV野毒株和疫苗株的优点。
实施例4：本发明的试剂盒灵敏度试验
提取ASFV CD2V基因阳性质粒，并用NanoDrop测量阳性质粒的浓度，并分别按比例稀释到106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、100copies/μL 5个浓度梯度进行灵敏度试验。
检测结果如图2所示，从左到右依次为106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、100copies/μL的扩增结果，从中可以看出本发明的荧光PCR扩增试剂的检测灵敏度可达101copies/μL，表明本发明的荧光PCR检测试剂盒和检测方法对ASFV野毒株和CD2V基因缺失疫苗株的鉴别诊断具有高度的灵敏性。
实施例5：本发明的试剂盒的特异性试验
为了检测本发明试剂盒的特异性，分别对病毒样本进行检测，分析本试剂盒对非洲猪瘟病毒和近源病毒的检测情况。
检测结果表明：仅非洲猪瘟病毒样品(ASFV野毒株)出现正常扩增，阴性对照(ddH2O)及猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪蓝耳病病毒(PPRSV)样品均未出现扩增(如图3所示)。上述结果说明，本发明荧光PCR检测试剂盒能特异性扩增出ASFV中的靶序列，而不与其他病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性。
在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。
本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。
序列表
<110> 南宁众册生物科技有限公司
<120> 非洲猪瘟病毒CD2V基因的实时荧光PCR检测引物探针组、试剂盒及方法
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cctaaaccgt gtcctccacc caaaccatgt ccgccaccca aaccatgtcc tccacctaaa 960
ccatgtcctt cagctgaatc ctattctcca cccaaaccac tacctagtat cccgctacta 1020
cccaatatcc cgccattatc tacccaaaat atttcgctta ttcatgtaga tagaattatt 1080
taa 1083
Claims (6)
1.一种非洲猪瘟病毒CD2V基因的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下的用于扩增CD2V基因的引物探针组，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQID NO.4所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6，其中，所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种；所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述试剂盒还包括PCR缓冲液、PCR底物、MgCl2、DNA聚合酶和水解酶。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区序列的阳性质粒，所述阳性质粒的碱基序列如SEQ ID NO.10所示。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为ddH2O。
4.一种非洲猪瘟病毒CD2V基因的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述方法用于非疾病诊断用途，包括如下步骤：提取待测样本的DNA，以待测样本的DNA为模板，采用如权利要求1-3任一项所述的检测试剂盒进行实时荧光PCR反应，根据实时荧光PCR扩增曲线分析待测样本，确定待测样本中是否存在非洲猪瘟病毒CD2V基因。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光PCR反应程序为：50℃，1min；95℃，5min；95℃，15s，60℃，30s，共计45个循环。
6.根据权利要求1～3任一项所述的检测试剂盒在制备用于检测非洲猪瘟病毒CD2V基因的试剂中的应用。
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| A multiplex reverse transcription PCR and automated electronic microarray assay for detection and differentiation of seven viruses affecting swine;Erickson, A等;《TRANSBOUNDARY AND EMERGING DISEASES》;20180430;第65卷(第2期);第e272-e283页 * |
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| Pre-Clinical Evaluation of a Real-Time PCR Assay on a Portable Instrument as a Possible Field Diagnostic Tool: Experiences from the Testing of Clinical Samples for African and Classical Swine Fever Viruses;Liu, L等;《TRANSBOUNDARY AND EMERGING DISEASES》;20171031;第64卷(第5期);第E31-E35页 * |
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