CN108300808B - 一种非洲猪瘟病毒荧光pcr检测试剂盒、制备方法及使用方法 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒荧光pcr检测试剂盒、制备方法及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，包括ASFV‑反应液、DNA酶混合液、ASFV‑内标、ASFV‑阳性对照、ASFV‑阴性对照、核酸释放剂以及ASFV‑定量参考品，所述ASFV‑反应液包括：引物：ASF03F03和ASF03R03；内标引物：IPC05F01和IPC05R01；探针ASF03P和内标探针IPC05P；所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段。本发明还公开了一种制备上述非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的方法以及使用其的检测方法。

Description

一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒、制备方法及使用方法
技术领域
本发明涉及动物病原分子诊断技术领域，特别是指一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒、制备方法及使用方法。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是猪的一种高度接触性传染疾病，病死率可达100％，由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起与传播。该病发展非常迅速，不到1个世纪的时间内，从非洲开始席卷至近乎整个世界。ASF已是一种严重危害“世界经济”的动物疫病，也是世界动物卫生组织(OIE)规定的A类动物疫病。目前我国虽然不是ASF疫区，但周边国家却疫情不断，因此对于ASF的防控已被相关部门提上紧急日程。今年4月，农业部再一次颁布关于进一步加强非洲猪瘟风险防范工作的紧急通知，可见我国ASF的防控刻不容缓。
ASF通常表现急性病程，病猪往往在出现明显临床症状前就死亡。典型症状主要表现出血热、心跳与呼吸频率加速、呕吐腹泻、眼睑分泌物、远端肢体与胸腹部发红、厌食、精神萎靡等。感染动物会出现多器官病理损伤，主要包括淋巴结、肾、膀胱、脾脏、内脏黏膜出现出血点。上述ASF临床症状和病理同古典猪瘟CSF、猪皮炎与肾病综合征PDNS、蓝耳病PPRS比较类似，通过临川诊断和病理诊断很容易混淆，因此需要快速、可靠、特异、敏感的实验室检测技术辅助诊断。
目前为止，ASF尚无有效疫苗预防及治疗方法，短期内依靠早期诊断与区域化防控管理来进行防制。各国均采用严格的监测计划，一经发现采取大范围扑杀方式切断传染源。现有的检测方法存在操作复杂、易受环境影响、容易感染、不适于早期诊断且检测结果误差较大等缺点。因此，亟需一种快速而准确的诊断方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种能够快速而准确的用于非洲猪瘟病毒的早期检测的荧光PCR检测试剂盒、制备方法及使用方法。
基于上述目的本发明提供的一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，包括ASFV-反应液、DNA酶混合液、ASFV-内标、ASFV-阳性对照、ASFV-阴性对照、核酸释放剂以及ASFV-定量参考品；
其中，所述ASFV-反应液包括：
引物：ASF03F03：5’-GATGATGATTACCTTYGCYTTG-3’和ASF03R03：5’-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT-3’；
内标引物：IPC05F01：5’-CATAGTTGGACCGCTAGGA-3’和IPC05R01：5’-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT-3’；
探针：ASF03P：5’-Fam-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb-3’，Fam为报告荧光基团，Mgb为淬灭荧光基团；
内标探针：IPC05P：5’-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT-Bhq1-3’，Hex为报告荧光基团，Bhq1为淬灭荧光基团；所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段，所述非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段的扩增目标核苷酸序列为:GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG。
在其中一个实施例中，所述ASFV-反应液还包括缓冲液，所述缓冲液中，盐酸缓冲液的浓度为125～200mM。
在其中一个实施例中，所述ASFV-反应液还包括脱氧核糖核苷，包括dATP、dUTP、dGTP以及dCTP。
在其中一个实施例中，所述核酸释放剂包括25～100mM的氢氧化钠、1～5％的聚乙二醇和0.5～1mM的乙二胺四乙酸二钠。
在其中一个实施例中，所述DNA酶混合液包括酶稀释液、热启动Taq酶与尿嘧啶-N-糖基化酶。
在其中一个实施例中，所述ASFV-定量参考品包括4个浓度逐渐降低的重组质粒，所述重组质粒的核苷酸序列为:GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG。
在其中一个实施例中，所述检测试剂盒中，各组分的含量为：
Figure GDA0002439080730000021
Figure GDA0002439080730000031
一种如上所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的制备方法，包括：
选取ASFV基因组的p72基因中高度保守区域的序列，设计三组引物与探针，分别对所述三组引物与探针进行扩增，筛选扩增效率、探针信噪比以及扩增曲线形态最佳的一组，作为所述ASFV-反应液的引物与探针；
合成编号为pUC-p72的重组克隆质粒，所述重组克隆质粒含有所述ASFV-反应液中引物的扩增产物的目标核苷酸序列，并用蛋白核酸测定仪对所述重组克隆质粒的浓度进行定量，将定量后的所述重组克隆质粒通过TE缓冲溶液进行稀释，得到浓度不同的多组重组克隆质粒，分别作为所述ASFV-阳性对照和所述ASFV-定量参考品；
随机生成长度为455bp的核苷酸序列，连接至pUC57载体上，形成编号为pUC-ipc的重组质粒，并根据所述重组质粒的序列合成多套内标引物与探针，分别将所述多套内标引物与探针加入p72扩增体系中进行扩增，筛选对p72扩增体系的荧光曲线和Ct值无干扰的一套，作为所述ASFV-反应液的内标引物与内标探针；
提供多组不同浓度的氢氧化钠溶液、聚乙二醇溶液，分别筛选背景荧光值、平台荧光值、Ct值以及曲线形态为最佳的氢氧化钠浓度以及聚乙二醇浓度，并与EDTA溶液混合，作为所述核酸释放剂。
在其中一个实施例中，所述ASFV-反应液的引物与探针包括：引物ASF03F03-GATGATGATTACCTTYGCYTTG、引物ASF03R03-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGC TCT以及探针ASF03P-Fam-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb；所述编号为pUC-p72的重组克隆质粒的核苷酸序列为：GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG；所述ASFV-反应液的内标引物与内标探针包括：内标引物IPC05F-CACGG CTGAGAGAACATGGA、内标引物IPC05R-GAAAGGTCCCGCA AAGAGT以及内标探针IPC05P-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGA CCCT-Bhq1。
一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测方法，应用如上所述的试剂盒，检测方法包括：
提供待测样品，所述待测样品选自死猪的肺、脾、肝以及淋巴结中的任一组织；或选自活猪的血液或扁桃体；
对所述待测样品中的非血液成分进行预处理，研磨至匀浆并离心取上清液为待测样本；
将试剂盒中除DNA酶混合液外的各组分溶解混匀，再加入DNA酶混合液制成PCR混合液；
取PCR管或8联排管或96孔板作为试管，每支均加入核酸释放剂，再分别加入ASFV-阴性对照、ASFV-阳性对照以及待测样本，以及每支加入所述PCR混合液；
分别将上述试管放入PCR仪扩增，依次进行一次50℃下尿嘧啶-N-糖基化酶反应2min,一次95℃下Taq酶活化5分钟,95℃下变性15秒，60℃下退火延伸30秒，采集荧光信号，进行40个PCR循环；
根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果:待检测样品的检测结果的Ct值小于或等于40，为阳性，表示样品中存在非洲猪瘟病毒；待检测样品的检测结果的Ct值大于40或无报告Ct值，且内标检测结果的Ct值小于等于36时，为阳性，表示样品中不存在非洲猪瘟病毒；待检测样品的检测结果的Ct值大于40或无报告Ct值，且内标检测结果的Ct值大于36时，结果无效，需重复此样品的重复检测。
从上面所述可以看出，本发明提供的非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光PCR检测试剂盒、制备方法及使用方法中，引物ASF03F03和ASF03R03以及探针ASF03P具有优良的敏感性与特异性，极大地减少了可能出现的因引物探针错配导致的漏检。配合内标引物IPC05F01和IPC05R01以及内标探针IPC05P可以监测整个PCR反应体系是否正常，从而避免因使用不当造成的错误的判定结果。使用本发明的试剂盒进行检测，使用核酸释放剂直检，样品只需一次裂解操作即可作为模板扩增，无需反复离心、吸取等对核酸提取纯化等，可以有效地降低污染，且具有极佳地重复性，利于产业化生产，可以为我国当下严峻的ASF防控工作提供有效的手段与武器。
附图说明
图1为本发明实施例的ASF01组的引物与探针的线性扩增曲线图；
图2为本发明实施例的ASF02组的引物与探针的线性扩增曲线图；
图3为本发明实施例的ASF03组的引物与探针的线性扩增曲线图；
图4为本发明实施例的IPC01-p72-双重扩增体系的荧光扩增曲线图，曲线1为体系中p72的荧光扩增曲线，曲线2为体系中IPC01的荧光扩增曲线；
图5为本发明实施例的IPC03-p72-双重扩增体系的荧光扩增曲线图，曲线1为体系中p72的荧光扩增曲线，曲线2为体系中IPC01的荧光扩增曲线；
图6为本发明实施例的IPC05-p72-双重扩增体系的荧光扩增曲线图，曲线1为体系中p72的荧光扩增曲线，曲线2为体系中IPC01的荧光扩增曲线；
图7为本发明实施例p72单重扩增体系的荧光扩增曲线图，曲线1为p72的荧光扩增曲线；
图8为本发明实施例的非洲猪瘟病毒荧光PCR试剂盒的线性范围扩增图；
图9为本发明实施例的非洲猪瘟病毒荧光PCR试剂盒的标准曲线；
图10为本发明实施例的非洲猪瘟病毒荧光PCR试剂盒的精密度测试曲线图；
图11为本发明实施例的非洲猪瘟病毒荧光PCR试剂盒的最小检测限测定曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，本发明实施例中所有使用“第一”和“第二”的表述均是为了区分两个相同名称非相同的实体或者非相同的参量，可见“第一”“第二”仅为了表述的方便，不应理解为对本发明实施例的限定，后续实施例对此不再一一说明。
本发明实施例提供一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂，所述检测试剂以非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段为靶目标，包括:
引物：ASF03F03：5’-GATGATGATTACCTTYGCYTTG-3’和ASF03R03：5’-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT-3’；
内标引物：IPC05F01：5’-CATAGTTGGACCGCTAGGA-3’和IPC05R01：5’-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT-3’；
探针：ASF03P：5’-Fam-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb-3’，Fam为报告荧光基团，Mgb为淬灭荧光基团；
内标探针：IPC05P：5’-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT-Bhq1-3’，Hex为报告荧光基团，Bhq1为淬灭荧光基团；
所述非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段的扩增目标核苷酸序列为:GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG。
本发明实施例还提供一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，包括ASFV-反应液、DNA酶混合液、ASFV-内标、ASFV-阳性对照、ASFV-阴性对照、核酸释放剂以及ASFV-定量参考品；
其中，所述ASFV-反应液包括：
引物：ASF03F03：5’-GATGATGATTACCTTYGCYTTG-3’和ASF03R03：5’-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT-3’；
内标引物：IPC05F01：5’-CATAGTTGGACCGCTAGGA-3’和IPC05R01：5’-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT-3’；
探针：ASF03P：5’-Fam-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb-3’，Fam为报告荧光基团，Mgb为淬灭荧光基团；
内标探针：IPC05P：5’-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT-Bhq1-3’，Hex为报告荧光基团，Bhq1为淬灭荧光基团；
所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段，所述非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段的扩增目标核苷酸序列为:GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG。
本发明实施例的非洲猪瘟病毒(ASFV)试剂盒中的引物ASF03F03和ASF03R03以及探针ASF03P具有优良的敏感性与特异性，极大地减少了可能出现的因引物探针错配导致的漏检。配合内标引物IPC05F01和IPC05R01以及内标探针IPC05P可以监测整个PCR反应体系是否正常，从而避免因使用不当造成的错误的判定结果。使用本发明的试剂盒进行检测，使用核酸释放剂直检，样品只需一次裂解操作即可作为模板扩增，无需反复离心、吸取等对核酸提取纯化等，可以有效地降低污染，且具有极佳地重复性。
作为优选的实施例，所述检测试剂盒中，各组分的含量为：ASFV-反应液2150μL；DNA酶混合液100μL；ASFV-内标100μL；ASFV-阳性对照50μL；ASFV-阴性对照500μL；核酸释放剂250μL；ASFV-定量参考品50uL。
优选地，所述ASFV-反应液中，引物ASF03F03与ASF03R03的终浓度范围是200～300nM，探针ASF03P为100～200nM；内标引物IPC05F01与IPC05R01的是100～200nM，内标探针IPC05P的为100～200nM，以使检测效率更高。
所述ASFV-反应液中，还包括PCR-Buffer(缓冲液)，所述PCR-Buffer中，Tris-HCl(盐酸缓冲液)的浓度优选为125～200mM。可以使PCR反应时，不受碱性核酸释放剂的影响，从而无需对核酸提取纯化，实现直检。
进一步地，所述ASFV-反应液还包括dNTP(脱氧核糖核苷)，所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP以及dCTP。dUTP的存在，可以形成带有U碱基的DNA的扩增条带，很容易被水解，极大地减少扩增产物残留对PCR产生的污染。
所述DNA酶混合液包括酶稀释液、热启动Taq酶与UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)。UNG酶具有能选择性水解断裂含有U碱基的DNA中的尿嘧啶糖苷键的作用，其添加可以消除扩增产物残留以及气溶胶污染等，提高检测的准确率。同时，UNG酶还可以同热启动Taq酶协同作用，抑制假阳性。
ASFV-内标编号为pUC-ipc，浓度为1.0×103～2.0×103copies/μL，其核苷酸长度为455bp，核苷酸序列为CTGGAGACTGAGGGTTGACGCGCATTCGTCATTGAACGCAGACACGGCTGAGAGAACATGGAGCGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTGATTAGGAGTGGGGTTTATGCCCGCGGCTTATCCCCCTATCCTTGCGACACGGGAGAAGACAGATTGTCATCGATTTCGCAAGCCATGATATGTTTGGCCCGACCAACCGCGTTTTTCTCGCGCTTGGATAACGACCTATGGTGTGGACAGTGGCTTAGAGGACATGACACGACGGGCTGAAAGTATGTGGTGCTGGGGCCCTTAGATAGCTGCATAGTTGGACCGCTAGGAATTATATCAATTCGAGATCTCCAGCCGACAAAGTAGGCTCCTAACTAACAGGGTCCAAAGGTTTATCACCGGTCCTTACTCTTTGCGGGACCTTTCTACCCATACAATATCGTCCTCCGATGATGGATCACGGAG。ASFV-内标的使用可用于监测整个PCR反应体系是否正常，可避免因临床样品的复杂性、保存不当、试剂配制错误以及误加样等因素导致检测结果的“假阴性”，即能够极大地避免因操作不当造成的错误的判定结果。
ASFV-阳性对照为浓度为1.0×104～5.0×104copies/μL的重组质粒，编号为pUC-p72。所述重组质粒的核苷酸序列与非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段的扩增目标的序列相同，均为GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG。
ASFV-阴性对照为用depcH2O配制的TE缓冲溶液(Tris-EDTA buffer solution)。
所述核酸释放剂为碱性裂解液，优选包括25～100mM的氢氧化钠(NaOH)、1～5％的聚乙二醇(PEG6000)和0.5～1mM的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。NaOH可以有效的裂解待检测样品中的细胞或病毒，使其释放出内容物并变性失活，非离子型去垢剂PEG6000进一步分散蛋白与核酸，EDTA能有效的抑制核酸酶对DNA的水解。该核酸释放剂在室温下，就能直接用于血清、血浆、组织匀浆液等待检测样品的裂解处理，无需高温加热处理，可以简化操作。待检测样品经裂解后直接可用于后续荧光PCR扩增处理，可以很好地保证扩增结果的一致性，省去核酸提取纯化等过程，极大地提高临床一线的快速检测的效率。
所述ASFV-定量参考品包括4个浓度逐渐降低的重组质粒pUC-p72，优选地，该重组质粒包括1.0×106copies/μL、1.0×105copies/μL、1.0×104copies/μL、1.0×103copies/μL四个浓度。
本发明实施例还提供一种上述非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的制备方法，包括：
S110，选取ASFV基因组的p72基因中高度保守区域的序列，设计多组引物与探针，分别对所述多组引物与探针进行扩增，筛选扩增效率、探针信噪比以及扩增曲线形态为最佳的一组，作为所述ASFV-反应液的所述引物与所述探针；
S120，合成编号为pUC-p72的重组克隆质粒，所述重组克隆质粒含有所述ASFV-反应液中引物的扩增产物的目标核苷酸序列，并用蛋白核酸测定仪对所述重组克隆质粒的浓度进行定量，将定量后的所述重组克隆质粒通过TE缓冲溶液进行稀释，得到浓度不同的多组重组克隆质粒，分别作为所述ASFV-阳性对照和所述ASFV-定量参考品；
S130，随机生成长度为455bp的核苷酸序列，连接至pUC57载体上，形成编号为pUC-ipc的重组质粒，并根据所述重组质粒的序列合成多套内标引物与探针，分别将所述多套内标引物与探针加入p72扩增体系中进行扩增，筛选对p72扩增体系的荧光曲线和Ct值无干扰的一套，作为所述ASFV-反应液的内标引物与内标探针；
S140，提供多组不同浓度的氢氧化钠溶液、聚乙二醇溶液，分别筛选背景荧光值、平台荧光值、Ct值以及曲线形态为最佳的氢氧化钠浓度以及聚乙二醇浓度，并与EDTA溶液混合，作为所述核酸释放剂。
步骤S110中，所述多组引物与探针优选为设计3组。具体地，第一组编号及序列分别为：引物ASF01F-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA、引物ASF01R–GATACCACAAGATCRGCCGT以及探针ASF01P-Fam-CCACGGGAGGAATACCAACCCAG-Bhq1；第二组编号及序列分别为：引物ASF02F-CTTCCAGAYGCATGTTCATC、引物ASF02R-CATTGCCTCCGTAGTGRA以及探针ASF02P-Fam-CCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACC-Bhq1；第三组编号及序列分别为：引物ASF03F03-GATGATGATTACCTTYGCYTTG、引物ASF03R03-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT以及探针ASF03P-Fam-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb。
所述第一组的引物及探针的扩增长度均为250bp，所述第二组的引物及探针的扩增长度均为166bp，所述第三组的引物及探针的扩增长度均为93bp。
所述三组的扩增结果中，第三组的信噪比、扩增效率以及扩增曲线均达到最佳水平，筛选为ASFV-反应液的引物与探针。
步骤S120中，根据所述ASFV-反应液的引物的目的基因的扩增产物合成所述克隆质粒pUC-p72，其序列为GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCAC GGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGA ATTTTATATTAGTTG。
根据实际浓度测定值，将所述定量后的重组克隆质粒通过TE缓冲溶液分别稀释为1.0×104～5.0×104copies/μL、1.0×106copies/μL、1.0×105copies/μL、1.0×104copies/μL、1.0×103copies/μL。将1.0×104～5.0×104copies/μL浓度的作为阳性对照，剩余的4个浓度的为一组浓度梯度，作为定量参考品。
步骤S130中，使用随机序列的重组质粒pUC-ipc作为内标，不会对目的基因的扩增造成影响，因而具有较佳的监控假阴性的功能。具体地，所述重组质粒pUC-ipc的核苷酸序列为：CTGGAGACTGAGGGTTGACGCGCATTCGTCATTGAACGCAGACACGGCTGAGAGAACATGGAGCGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTGATTAGGAGTGGGGTTTATGCCCGCGGCTTATCCCCCTATCCTTGCGACACGGGAGAAGACAGATTGTCATCGATTTCGCAAGCCATGATATGTTTGGCCCGACCAACCGCGTTTTTCTCGCGCTTGGATAACGACCTATGGTGTGGACAGTGGCTTAGAGGACATGACACGACGGGCTGAAAGTATGTGGTGCTGGGGCCCTTAGATAGCTGCATAGTTGGACCGCTAGGAATTATATCAATTCGAGATCTCCAGCCGACAAAGTAGGCTCCTAACTAACAGGGTCCAAAGGTTTATCACCGGTCCTTACTCTTTGCGGGACCTTTCTACCCATACAATATCGTCCTCCGATGATGGATCACGGAG。
根据上述pUC-ipc的核苷酸序列，合成三套内标引物与探针。具体地，第一套内标引物与探针的编号及序列分别为：引物IPC01F-CACGGCTGAGAGAACATGGA、引物IPC01R-GGGCATAAACCCCACTCCTAA以及探针IPC01P-Hex-CGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTG-Bhq1；第二套内标引物与探针的编号及序列分别为：引物CGCTTGGATAACGACCTA、引物IPC03R-GGGCATAAACCCCACTCCTAA以及探针IPC03P-Hex-TCCTCTAAGCCACTGTCCACACC-Bhq1；第三套内标引物与探针的编号及序列分别为：内标引物IPC05F-CACGGCTGAGAGAACATGGA、内标引物IPC05R-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT以及内标探针IPC05P-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGA CCCT-Bhq1。
筛选时，分别将所述三套内标引物与探针体系加入p72扩增体系中组合成三组双重扩增体系。对所述三组双重扩增体系以及未加内标体系的p72单重扩增体系，加入模板进行扩增，并比较所得荧光曲线以及Ct值。筛选对p72体系无干扰的第三套作为所述ASFV-反应液的内标引物与内标探针。
步骤S140中，将氢氧化钠溶液设置为9组不同的当量浓度(N)(g/L)，通过试验比较，各不同浓度组对PCR的背景荧光值、平台荧光值、Ct值以及曲线形态的影响，并折合为50摩尔浓度(mM)作为核酸释放剂中氢氧化钠的浓度。
将聚乙二醇溶液(PEG6000)设置为9组不同的质量浓度(％)，通过试验比较，各不同浓度组对PCR的背景荧光值、平台荧光值、Ct值以及曲线形态的影响，并将2.5％作为核酸释放剂中聚乙二醇溶液的浓度。
优选地，步骤S140还可包括，将上述浓度的氢氧化钠与聚乙二醇溶液与乙二胺四乙酸二钠配置成核酸释放剂，测试对不同浓度的PRV K61疫苗的裂解能力，同时以Axygen提取纯化试剂盒为对照,验证核酸释放剂对病毒样本的裂解能力。
本发明实施例还提供一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测方法，包括：
S210，提供待测样品，所述待测样品选自死猪的肺、脾、肝以及淋巴结中的任一组织；或选自活猪的血液或扁桃体；
S220，对所述待测样品中的非血液成分进行预处理，研磨至匀浆并离心取上清液为待测样本；
S230，将试剂盒中除DNA酶混合液外的各组分溶解混匀，再加入DNA酶混合液制成PCR混合液；
S240，取PCR管或8联排管或96孔板作为试管，每孔均加入核酸释放剂，再分别加入ASFV-阴性对照、ASFV-阳性对照以及待测样本，混匀裂解10分钟后每孔加入所述PCR混合液；
S250，分别将上述PCR管放入PCR仪扩增，依次进行一次50℃下尿嘧啶-N-糖基化酶反应2min，一次95℃下Taq酶活化5分钟，95℃下变性15秒，60℃下退火延伸30秒，采集荧光信号，进行40个PCR循环；
S260，根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果：当内标检测结果的Ct值小于等于36时，结果有效；若内标检测结果的Ct值大于36时，结果无效，需重复此样品的检测。
步骤S230中，所得PCR混合液，每头每份样品中具体可以包括，ASFV-反应液38μL、DNA酶混合液2μL以及ASFV-内置参照0.5μL，以使检测结果更加准确。
优选地，步骤S260中，所述根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果的步骤中，所述判定结果包括定性判定结果：
待检测样品的检测结果的Ct值小于或等于40，为阳性，表示样品中存在非洲猪瘟病毒；
待检测样品的检测结果的Ct值大于40或无报告Ct值，且内标检测结果的Ct值小于等于36时，为阳性，表示样品中不存在非洲猪瘟病毒；
待检测样品的检测结果的Ct值大于40或无报告Ct值，且内标检测结果的Ct值大于36时，结果无效，需重复此样品的重复检测。
实施例1试剂盒的制备方法
分析比对NCBI中登陆的23株ASFV基因组p72基因序列信息，选取高度保守区域的序列设计三组特异性的引物与探针序列，各组的序列与标记信息请参阅表1。请参阅图1至图3，对以上三组引物与探针分别进行扩增试验，得到各组的扩增效率、探针信噪比与扩增曲线形态等指标。第三组的曲线形态与灵敏度最佳，且探针序列不存在与现行的某些ASFV毒株序列的错配，选为最佳引物与探针组。
根据上述筛选得到的ASFV的引物的目的基因的扩增产物合成克隆质粒pUC-p72，其序列为GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG。用蛋白核酸测定仪对pUC-p72的浓度进行定量，并使用TE溶液稀释，得到阳性对照浓度为1.0×104～5.0×104copies/μL；得到量参考品(A～D)：浓度梯度为1.0×106copies/μL、1.0×105copies/μL、1.0×104copies/μL以及1.0×103copies/μL。
随机生成长度为455bp的核苷酸序列，连接至pUC57载体上，形成编号为pUC-ipc的重组质粒，核苷酸序列为：CTGGAGACTGAGGGTTGACGCGCATTCGTCATTGAACGCAGACACGGCTGAGAGAACATGGAGCGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTGATTAGGAGTGGGGTTTATGCCCGCGGCTTATCCCCCTATCCTTGCGACACGGGAGAAGACAGATTGTCATCGATTTCGCAAGCCATGATATGTTTGGCCCGACCAACCGCGTTTTTCTCGCGCTTGGATAACGACCTATGGTGTGGACAGTGGCTTAGAGGACATGACACGACGGGCTGAAAGTATGTGGTGCTGGGGCCCTTAGATAGCTGCATAGTTGGACCGCTAGGAATTATATCAATTCGAGATCTCCAGCCGACAAAGTAGGCTCCTAACTAACAGGGTCCAAAGGTTTATCACCGGTCCTTACTCTTTGCGGGACCTTTCTACCCATACAATATCGTCCTCCGATGATGGATCACGGAG。
用蛋白核酸测定仪对pUC-ipc的浓度进行定量，并使用TE溶液稀释到浓度为1.0×103～2.0×103copies/μL，作为内标。
表1 ASFV-p72引物与探针序列信息
Figure GDA0002439080730000121
Figure GDA0002439080730000131
表2内标引物与探针序列信息表
Figure GDA0002439080730000132
请参阅表2，根据pUC-ipc的核苷酸序列设计3套内标引物与探针，并分别加入p72扩增体系中合成双重扩增体系。将双重扩增体系和未加内标体系的p72单重扩增体系分别加入模板进行扩增，荧光扩增曲线如图4至图7所示。第三套内标引物与探针对p72扩增体系的荧光曲线和Ct值几乎无干扰，选为最佳内标引物与探针。
请参阅表3，提供9组不同浓度(g/L)的氢氧化钠溶液，从背景荧光值、平台荧光值、Ct值以及曲线形态分析对荧光PCR的影响，得出氢氧化钠的最佳耐受浓度为0.25N。
表3不同浓度的氢氧化钠溶液对荧光PCR的影响
浓度N(g/L) 背景荧光值 平台荧光值 Ct值 曲线形态
1N 1290 1290 NoCt 无
0.5 265 265 NoCt 无
0.25 240 1533 16.93 正常
0.125 227 1500 16.31 正常
0.06 223 1436 16.20 正常
0.03 230 1547 16.08 正常
0.015 228 1601 16.04 正常
0.008 235 1626 16.00 正常
0 279 1858 15.80 正常
请参阅表4，提供9组不同质量浓度(％)的PEG6000溶液，从背景荧光值、平台荧光值、Ct值以及曲线形态分析对荧光PCR的影响，高至10％浓度的PEG6000基本不对荧光PCR造成影响。
请参阅表5，根据上述表3及表4的结果配制核酸释放剂(50mM NaOH，2.5％PEG6000,EDTA)，验证其对PRVK61疫苗的裂解能力，同时与Axygen提取纯化试剂盒为比较。可见，该核酸释放剂对病毒样本具有很好的裂解能力,基本与Axygen提取纯化试剂盒效果一致。
请参阅图8至图9，对定量的重组质粒pUC-p72进行10倍梯度连续稀释，使其拷贝数范围为107～1copies/μL。分别将各梯度作为模板对非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒进行实时荧光PCR，并根据扩增结果制作标准曲线。所得标准曲线的相关系数R2＝0.99；试剂盒的扩增效率为94％。说明，该试剂盒不仅可用于ASFV的定性测定，也符合定量测定的要求。
表4不同浓度的PEG6000溶液对荧光PCR的影响
浓度％ 背景荧光值 平台荧光值 Ct值 曲线形态
10 269 1588 16.20 正常
5 259 1596 16.18 正常
2.5 246 1618 16.05 正常
1.25 231 1527 16.05 正常
0.62 207 1430 16.03 正常
0.31 226 1466 16.04 正常
0.16 231 1543 16.05 正常
0.08 226 1546 16.06 正常
0 279 1858 15.80 正常
表5核酸释放剂及Axygen提取纯化试剂盒对不同浓度的病毒样本的裂解能力
Figure GDA0002439080730000141
Figure GDA0002439080730000151
请参阅表6，调整重组质粒pUC-p72浓度至10copies/μl，作为精密度测定的扩增模板。对此浓度模板重复扩增8个重复，计算Ct值的变异系数(CV)。精密度测试结果表明，该试剂盒对低浓度模板扩增精密度为0.79％，重复性很好，且扩增曲线形态重复性也较好(见图10)。
请参阅图11，调整重组质粒pUC-p72浓度至1copies/μl，作为检测限测定的扩增模板。对此浓度模板重复扩增8个重复，全部检出阳性。该ASFV试剂盒的最小检测为1000copies/mL。
表6 ASFV试剂盒的精密度测试结果
编号 目的基因Ct
1 33.77
2 33.44
3 33.40
4 33.99
5 33.46
6 33.93
7 33.44
8 33.30
CV(％) 0.79
将本发明的试剂盒检测常见猪病病原，包括猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征变异株、阴性血清样本、正常组织样本进行特异性试验，检验结果见表7，本发明的试剂盒仅对ASFV目的基因进行扩增，不与其它病原及正常阴性血液与组织样本的核酸发生交叉反应。可见，该试剂盒特异性良好。
表7 ASFV试剂盒特异性测试结果
检测项目 ASFV PCV2 PRV CSFV PRRSV 血清 组织
P72(Fam) 23.87 No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct
内标(hex) 28.97 29.11 29.00 29.14 29.04 29.19 29.21
实施例2试剂盒的使用方法
样品采集：剖杀病猪，采集肺、脾、肝、淋巴结等组织；或活体采集血液、扁桃体等。
样品预处理：血清、血浆样品无需处理，直接用于检测；其它组织样品需处理，取约1g于研磨器具中研磨，加入1.2mL生理盐水研磨至匀浆，转移至1.5mL离心管，8000g离心5分钟，取上清液以生理盐水稀释10倍后用于检测。
扩增试剂配制：取出包装盒中除DNA酶混合液外的各组分，室温放置，待其彻底溶解后，震荡混匀备用；按比例(ASFV-反应液38μL/头份+DNA酶混合液2μL/头份+ASFV-内置参照0.5μL/头份)取相应量的试剂，充分混匀成PCR-Mix，瞬时离心。
核酸释放与加样：取PCR管或8联排管或96孔板，向每个反应管中加入5μL核酸释放剂，再取5μL阴性对照/阳性对照/待测样本分别加入对应PCR反应孔，反复吹打3～5次，静置10min；向每个反应管中分别加入40μL PCR-Mix，盖上管盖，短暂离心，转移至扩增区。
上机扩增：将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称；选择FAM通道检测非洲猪瘟病毒核酸；选择HEX通道检测内标；设置反应体系为50μL；循环参数设定如表8所示。
表8扩增参数设置
Figure GDA0002439080730000161
结果分析与判定：待反应程序完成后，记录样品Ct值与扩增曲线。ASFV-阴性对照HEX通道Ct值≤36，FAM通道无报告Ct值，ASFV-阳性对照HEX通道Ct值≤36，FAM通道Ct值≤30；被检样品检测结果中FAM通道Ct值≤40，报告为非洲猪瘟病毒核酸阳性；被检样品检测结果中FAM通道Ct值>40或无报告Ct值，同时HEX通道(内标)Ct值≤36，报告为非洲猪瘟病毒核酸阴性；被检样品检测结果中FAM通道Ct值>40或无报告Ct值，同时HEX通道(内标)Ct值>36，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。
本发明实施例提供的非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光PCR检测试剂盒、制备方法及检测方法，以荧光PCR检测技术为基础，通过调整引物与探针序列、采用浓度为125～200mM的缓冲液优化试剂盒的反应体系、添加pUC-ipc内标体系与UNG防污染体系、结合NaOH与PEG6000以及EDTA构成的碱性核酸释放剂的协同作用，可使待检测样品在常温下裂解后直接检测，极大地减少扩增产物残留对PCR产生的污染，并有效避免假阳性和假阴性的结果出现，实现ASFV的快速可靠的检出与诊断，利于产业化生产，可以为我国当下严峻的ASF防控工作提供有效的手段与武器。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
尽管已经结合了本发明的具体实施例对本发明进行了描述，但是根据前面的描述，这些实施例的很多替换、修改和变型对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南国测生物科技有限公司
<120> 一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒、制备方法及使用方法
<130> 2018.1.9
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatgatgatt accttygcyt tg 22
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caactaatat aaaaytctct tgctct 26
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
catagttgga ccgctagga 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaaaggtccc gcaaagagt 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccacgggagg aataycaac 19
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccggtgataa acctttggac cct 23
<210> 7
<211> 93
<212> DNA
<213> p72基因
<400> 7
gatgatgatt acctttgctt tgaagccacg ggaggaatat caacccagtg gtcatattaa 60
cgtatccaga gcaagagaat tttatattag ttg 93
<210> 8
<211> 455
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctggagactg agggttgacg cgcattcgtc attgaacgca gacacggctg agagaacatg 60
gagcgactgc actgcacttg gtcgatctga ttaggagtgg ggtttatgcc cgcggcttat 120
ccccctatcc ttgcgacacg ggagaagaca gattgtcatc gatttcgcaa gccatgatat 180
gtttggcccg accaaccgcg tttttctcgc gcttggataa cgacctatgg tgtggacagt 240
ggcttagagg acatgacacg acgggctgaa agtatgtggt gctggggccc ttagatagct 300
gcatagttgg accgctagga attatatcaa ttcgagatct ccagccgaca aagtaggctc 360
ctaactaaca gggtccaaag gtttatcacc ggtccttact ctttgcggga cctttctacc 420
catacaatat cgtcctccga tgatggatca cggag 455
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctgctcatgg tatcaatctt atcga 25
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gataccacaa gatcrgccgt 20
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ccacgggagg aataccaacc cag 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cttccagayg catgttcatc 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cattgcctcc gtagtgra 18
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccatcaaagt tctgcagctc ttacatacc 29
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cacggctgag agaacatgga 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gggcataaac cccactccta a 21
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cgactgcact gcacttggtc gatctg 26
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgcttggata acgaccta 18
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cagcaccaca tactttcag 19
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tcctctaagc cactgtccac acc

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括ASFV-反应液、DNA酶混合液、ASFV-内标、ASFV-阳性对照、ASFV-阴性对照、核酸释放剂以及ASFV-定量参考品；
其中，所述ASFV-反应液包括：
引物：ASF03F03：5’-GATGATGATTACCTTYGCYTTG-3’和ASF03R03：5’-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT-3’；
内标引物：IPC05F01：5’-CATAGTTGGACCGCTAGGA-3’和IPC05R01：5’-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT-3’；
探针：ASF03P：5’-Fam-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb-3’，Fam为报告荧光基团，Mgb为淬灭荧光基团；
内标探针：IPC05P：5’-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT-Bhq1-3’，Hex为报告荧光基团，Bhq1为淬灭荧光基团；
所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段，所述非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段的扩增目标核苷酸序列为:GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG；
所述ASFV-内标的核苷酸序列为CTGGAGACTGAGGGTTGACGCGCATTCGTCATTGAACGCAGACACGGCTGAGAGAACATGGAGCGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTGATTAGGAGTGGGGTTTATGCCCGCGGCTTATCCCCCTATCCTTGCGACACGGGAGAAGACAGATTGTCATCGATTTCGCAAGCCATGATATGTTTGGCCCGACCAACCGCGTTTTTCTCGCGCTTGGATAACGACCTATGGTGTGGACAGTGGCTTAGAGGACATGACACGACGGGCTGAAAGTATGTGGTGCTGGGGCCCTTAGATAGCTGCATAGTTGGACCGCTAGGAATTATATCAATTCGAGATCTCCAGCCGACAAAGTAGGCTCCTAACTAACAGGGTCCAAAGGTTTATCACCGGTCCTTACTCTTTGCGGGACCTTTCTACCCATACAATATCGTCCTCCGATGATGGATCACGGAG。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述ASFV-反应液还包括缓冲液，所述缓冲液中，盐酸缓冲液的浓度为125～200mM。
3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述ASFV-反应液还包括脱氧核糖核苷，包括dATP、dUTP、dGTP以及dCTP。
4.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括25～100mM的氢氧化钠、1～5％的聚乙二醇和0.5～1mM的乙二胺四乙酸二钠。
5.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述DNA酶混合液包括酶稀释液、热启动Taq酶与尿嘧啶-N-糖基化酶。
6.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述ASFV-定量参考品包括4个浓度逐渐降低的重组质粒，所述重组质粒的核苷酸序列包括:GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG。
7.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中，各组分的含量为：
Figure FDA0002448832530000021
8.一种如权利要求1至7任一项所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
选取ASFV基因组的p72基因中高度保守区域的序列，设计三组引物与探针，分别对所述三组引物与探针进行扩增，筛选扩增效率、探针信噪比以及扩增曲线形态最佳的一组，作为所述ASFV-反应液的引物与探针；
所述p72基因中高度保守区域的序列为:GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG；
所述三组引物与探针为：ASF01F-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA、ASF01R–GATACCACAAGATCRGCCGT，以及探针ASF01P-Fam-CCACGGGAGGAATACCAACCCAG-Bhq1；
ASF02F-CTTCCAGAYGCATGTTCATC、ASF02R-CATTGCCTCCGTAGTGRA以及探针ASF02P-Fam-CCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACC-Bhq1；
ASF03F03-GATGATGATTACCTTYGCYTTG、ASF03R03-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT，以及探针ASF03P-Fam-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb；
合成编号为pUC-p72的重组质粒，所述重组质粒含有所述ASFV-反应液中引物的扩增产物的目标核苷酸序列，并用蛋白核酸测定仪对所述重组质粒的浓度进行定量，将定量后的所述重组质粒通过TE缓冲溶液进行稀释，得到浓度不同的多组重组质粒，分别作为所述ASFV-阳性对照和所述ASFV-定量参考品；
随机生成长度为455bp的核苷酸序列，连接至pUC57载体上，形成编号为pUC-ipc的重组质粒，并根据所述重组质粒的序列合成三套内标引物与探针，第一套内标引物与探针的编号及序列分别为：引物IPC01F-CACGGCTGAGAGAACATGGA、引物IPC01R-GGGCATAAACCCCACTCCTAA以及探针IPC01P-Hex-CGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTG-Bhq1；第二套内标引物与探针的编号及序列分别为：引物IPC03F-CGCTTGGATAACGACCTA、引物IPC03R-CAGCACCACATACTTTCAG以及探针IPC03P-Hex-TCCTCTAAGCCACTGTCCACACC-Bhq1；第三套内标引物与探针的编号及序列分别为：内标引物IPC05F-CATAGTTGGACCGCTAGGA、内标引物IPC05R-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT以及内标探针IPC05P-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT-Bhq1；分别将所述三套内标引物与探针加入p72扩增体系中进行扩增，筛选对p72扩增体系的荧光曲线和Ct值无干扰的一套，作为所述ASFV-反应液的内标引物与内标探针，所述随机生成长度为455bp的核苷酸序列为CTGGAGACTGAGGGTTGACGCGCATTCGTCATTGAACGCAGACACGGCTGAGAGAACATGGAGCGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTGATTAGGAGTGGGGTTTATGCCCGCGGCTTATCCCCCTATCCTTGCGACACGGGAGAAGACAGATTGTCATCGATTTCGCAAGCCATGATATGTTTGGCCCGACCAACCGCGTTTTTCTCGCGCTTGGATAACGACCTATGGTGTGGACAGTGGCTTAGAGGACATGACACGACGGGCTGAAAGTATGTGGTGCTGGGGCCCTTAGATAGCTGCATAGTTGGACCGCTAGGAATTATATCAATTCGAGATCTCCAGCCGACAAAGTAGGCTCCTAACTAACAGGGTCCAAAGGTTTATCACCGGTCCTTACTCTTTGCGGGACCTTTCTACCCATACAATATCGTCCTCCGATGATGGATCACGGAG；
提供多组不同浓度的氢氧化钠溶液、聚乙二醇溶液，分别筛选背景荧光值、平台荧光值、Ct值以及曲线形态为最佳的氢氧化钠浓度以及聚乙二醇浓度，并与EDTA溶液混合，作为所述核酸释放剂。
9.根据权利要求8所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述ASFV-反应液的引物与探针包括：引物ASF03F03-GATGATGATTACCTTYGCYTTG、引物ASF03R03-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT以及探针ASF03P-Fam-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb；
所述编号为pUC-p72的重组质粒的核苷酸序列包括：GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG；
所述ASFV-反应液的内标引物与内标探针包括：内标引物IPC05F-CACGGCTGAGAGAACATGGA、内标引物IPC05R-GAAAGGTCCCGCA AAGAGT以及内标探针IPC05P-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGA CCCT-Bhq1。
10.一种用于非治疗诊断的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，应用权利要求1-7任一项所述的试剂盒或权利要求8-9任一项所述的制备方法制备得到的试剂盒，检测方法包括：
提供待测样品，所述待测样品选自死猪的肺、脾、肝以及淋巴结中的任一组织；
对所述待测样品进行预处理，研磨至匀浆并离心取上清液为待测样本；
将试剂盒中除DNA酶混合液外的各组分分别进行溶解、震荡混匀备用；将ASFV-反应液、ASFV-内标和DNA酶混合液混匀制成PCR混合液；
取PCR管或8联排管或96孔板作为试管，每支均加入核酸释放剂，再分别加入ASFV-阴性对照、ASFV-阳性对照以及待测样本，以及每支加入所述PCR混合液；
分别将上述试管放入PCR仪扩增，依次进行一次50℃下尿嘧啶-N-糖基化酶反应2min,一次95℃下Taq酶活化5分钟,95℃下变性15秒，60℃下退火延伸30秒，采集荧光信号，进行40个PCR循环；
根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果:待检测样品的检测结果的Ct值小于或等于40，为阳性，表示样品中存在非洲猪瘟病毒；待检测样品的检测结果的Ct值大于40或无报告Ct值，且内标检测结果的Ct值小于等于36时，为阴性，表示样品中不存在非洲猪瘟病毒；待检测样品的检测结果的Ct值大于40或无报告Ct值，且内标检测结果的Ct值大于36时，结果无效，需重复此样品的重复检测。
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