CN111254220A

CN111254220A - 一种用于检测非洲猪瘟病毒dna的组合物及试剂盒

Info

Publication number: CN111254220A
Application number: CN202010081958.3A
Authority: CN
Inventors: 廖东升; 赵伟; 鞠青; 邱坤
Original assignee: Chengdu Daosheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chengdu Daosheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-02-06
Filing date: 2020-02-06
Publication date: 2020-06-09

Abstract

本申请公开了一种用于检测非洲猪瘟病毒DNA的组合物，可以包括一组或者多组引物对和探针具体如下所示：其中一组由引物对引物‑F：SEQ ID NO：1，引物‑R：SEQ ID NO：2和探针：SEQ ID NO：9组成；本发明还提供一种试剂盒，包括上述组合物和用于PCR的体系，本发明能够针对非洲猪瘟检测体现极高的特异性和灵敏度，对于精准检测非洲猪瘟病毒的存在具有效率高，准确性高，抗干扰能力强，对实现实时疫情检测和控制具有突出作用。

Description

一种用于检测非洲猪瘟病毒DNA的组合物及试剂盒

技术领域

本生物制剂或组合物、试剂盒领域，尤其涉及采用TaqMan法进行基因检测所需的组合物和试剂盒，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒DNA的组合物及试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，East African Swine fever,ASF)，是一种急性，发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪病，其特征是发病过程短，但死亡率高达100％，病猪临床表现为发热，皮肤发绀，淋巴结，肾，胃肠粘膜明显出血。本病自1909年在肯尼亚首次报道，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，但在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行。2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。

2018年8月，中国在辽宁沈阳、河南郑州、江苏连云港3个相隔很远的地区，接连发现多起非洲猪瘟疫情。11月23日，北京市房山区排查出非洲猪瘟疫情。2019年中国内陆地区，包括以重庆、四川为主的西南地区均大面积发现诸多病症，虽经疫情控制部门及时的进行消杀掩埋，但依然造成数量巨大的患病群体，并快速蔓延。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：通过采用本申请提供的试剂盒能够精准的判别被检测样品是否含有非洲猪瘟病毒，以为后续的疫情处置提供准确的、科学的判定依据，避免检测手段的误差导致可疑携带体被掩埋导致财产损失；亦可避免带病体出现漏检的可能。本申请人的研发团队经过反复研究和实验，旨在解决现有技术中的不足，避免出现阳性、弱阳、阴性的检测结果，由于非洲猪瘟的疫情传播迅速，需要及时的进行判断和隔离，现有技术中出现的弱阳状态则需要二次复检，以进一步确定携带体是否已经染病，那么在初检定论至复检结果过程中需要一定的处理时间周期，那么在该周期期间，可能发生疫情的进一步传播，不能实现即时的隔离问题。本申请人研发团队经过反复提取实验，通过分析非洲猪瘟的全基因组序列研发出一种精准检测的引物对和探针，通过本发明提供的组合物及试剂盒采用现有PCR扩增方式进行精准判断，以此完成本发明，并达到预期技术效果。

为了达到上述目的，本申请所采用的技术方案为：

一种用于检测非洲猪瘟病毒DNA的组合物，可以包括以下四组引物对和探针中的A组或B组或者C组或者D组，也可以包括A组在内的多组组合，也可以包括ABCD组。所述ABCD四组对应的引物对和探针具体如下所示：

所述A组由引物对引物-F：SEQ ID NO：1，引物-R：SEQ ID NO：2和探针：SEQ ID NO：9组成；

另一组B由引物对引物-F：SEQ ID NO：3，引物-R：SEQ ID NO：4和探针：SEQ ID NO：10组成；还包括

另一组C由引物对引物-F：SEQ ID NO：5，引物-R：SEQ ID NO：6和探针：SEQ ID NO：11组成；还包括

另一组D由引物对引物-F：SEQ ID NO：7，引物-R：SEQ ID NO：8和探针：SEQ ID NO：12组成。

所述探针A、探针B和探针C均包含荧光分子5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团，所述5’端采用FAM、HEX、CY3、CY5、VIC、ROX、JOE中任一一种，所述3’端对应的采用BHQ1、BHQ2、Dabcyl、TAMRA、eclipse中任一一种。

本发明申请另一个目的是还提供一种试剂盒，包含上述任一一种配比的组合物。

优选地，所述试剂盒，还包括扩增反应体系，具体由5ul的10X PCRmix溶液、4ul浓度为10mmol/l的dNTP mix溶液、1ul浓度为5U/mL的UNG酶、1ul2.5U/mL的TaqDNA聚合酶、浓度均为10umol/l的引物F和引物R各1ul，以及1ul的探针，5ul的模板和31ul的水组成。

作为优选的方式之一，所述10X PCRmix溶液具体由500mmol/l的KCl、100mmol/l且PH＝9.0的TRIS-HCl和1％Triton-X组成。

作为优选的方式之一，所述dNTP mix溶液具体由7.5mmol/l的dUTP、2.5mM/L的dTTP、10mM/L的dATP、dGTP和dCTP组成。

作为优选的方式之一，还包括内标引物和探针：

内标引物-F：SEQ ID NO：13；内标引物-R：SEQ ID NO：14；内标探针：SEQ ID NO：15，其中内标探针含荧光分子5’端的荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为Bhq1。

本发明的另一目的是提供所述试剂盒在非洲猪瘟病毒检测中的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1中A组引物对和探针检测非洲猪瘟病毒的PCR曲线，表征灵敏度；

图2是实施例2中A组引物对和探针检测健康样本的PCR曲线，表征特异性。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本申请实施例的含量可以以不同的参数进行设计，作为优选范围值中的任一符合条件的点值均可实现对应技术效果。

因此，以下对在附图中提供的本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

基于本发明的目的是要精准检测带病体或者可疑目标对象，判断是否存在非洲猪瘟病毒。基于上述目的，本发明通过采用组合物中含有的特定引物对和探针进行PCR扩增实验，旨在对非洲猪瘟病毒的特异性和灵敏度两个维度进行考究验证本发明的精准性。

作为本发明对非洲猪瘟病毒检测的灵敏度方面验证，即采用本发明提供的引物对及探针在本发明试剂盒提供的PCR扩增体系中，针对携带非洲猪瘟病毒样本检测为阳性的准确率；若检测为阳性的数量相对于被检测样品数量占比越高，说明组合物针对非洲猪瘟病毒检测的灵敏度高，反之，灵敏度低。为达到精准检测目的，灵敏度越高，实现精准隔离，实时隔离越及时，防止后续感染概率就越低；反之，灵敏度越低，则隔离的精准度就越低，后续感染概率就会越大。值得说明的是，PCR扩增体系亦可采用现有技术的试剂，只需满足常规PCR扩增条件即可，这并非本发明的关键之所在，在此不做赘述列举。

作为本发明对非洲猪瘟病毒检测的特异性方面验证，即采用发明提供的引物对及探针在本发明试剂盒提供的PCR扩增体系中或者常规现有技术的PCR扩增体系环境中进行PCR，针对非携带非洲猪瘟病毒样本监测为阴性的数量在总体被检测样本中的占比，若占比越高，说明特异性越好，反之，如果占比越低说明特异性越差，当占比率低于80％的特异性，通常可以认定为不能用于精准检测，本发明主要目的是对于非洲猪瘟病毒的定性检测。

实施例1：

本实施例是从灵敏度方面反映本发明提供的引物对和探针在非洲猪瘟病毒检测方面的准确性，本实施例的目的是验证A组组合物中的引物对和探针在非洲猪瘟病毒检测方面的灵敏度。具体地A组组合物中的引物对采用表1所示：

表1

探针如下表2所示：

名称	5’	探针碱基序列	3’	长度	标签
						ASFV-PROBE	FAM	ACATACCCTTCCACTACGGAGGC	MGB	23	SEQ ID NO：9
IC-PROBE	VIC	CCTTCATCGAGCCCATCA	Bhq1	18	SEQ ID NO：15

表2

扩增体系采用：5ul的10X PCRmix溶液、4ul浓度为10mmol/l的dNTP mix溶液、1ul浓度为5U/mL的UNG酶、1ul2.5U/mL的TaqDNA聚合酶、浓度均为10umol/l的引物F和引物R各1ul，以及1ul的探针A，5ul的模板和31ul的水组成。其中，所述10X PCRmix溶液具体由500mmol/l的KCl、100mmol/l且PH＝9.0的TRIS-HCl和1％Triton-X组成。所述dNTP mix溶液具体由7.5mmol/l的dUTP、2.5mM/L的dTTP、10mM/L的dATP、dGTP和dCTP组成。其中内标探针和内标模板均为2ul浓度为10umol/l，本实施例中加入内标的目的并非是定量，而是间接应证PCR环境的可靠性；由于具有阳性和阴性对照，内标亦并非必选项。值得说明的是内标的选择采用现有技术，优选采用对于目标模板不具有明显抑制性为宜，当然，由于本发明目的是用于定性检测，内标对目标模板具有一定一致性亦不导致检测结果的成败。

仪器：采用罗氏cobas z480全自动荧光定量PCR分析仪，96孔热循环模块。

反应的条件设定为50℃UNG酶处理上一次扩增产物的污染，其次摄氏95℃的温度条件下进行预变性10min，再次95℃变性10s，而后进行摄氏60°延伸30秒，并重复45个循环，每次延伸结束采集荧光信号。

模板：将分别来自于10头确定感染非洲猪瘟病例采集的唾液置于1ml生理盐水中，混合液均匀，再分别取80ul，分别并置于20ul预处理液中在85℃的环境下处理8分钟备用并分别记录为1-10组标签。

所述预处理液具体由以下组分混合而成：浓度为0.4-0.65mol/L的氯化镁，体积分数为1.5％-3.6％的十二烷基磺酸钠，体积分数为26％-32％的酒精，46-60mg的莎梵婷，体积分数为20％的tritonX-100配置为体积为10毫升的组织液。

本发明对于引物对和探针的研究是基于现有的非洲猪瘟全基因组序列而进行，非洲猪瘟病毒进行检测是基于非洲猪瘟病毒全基因组序列为公知，并在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,简称NCBI)中进行公开披露而获知，具体亦可参见NCBI官方网站披露信息。申请人的研发团队从P72基因的编码区域进行引物和探针的设计，107977到108591核酸具体如下：

测试步骤：

按照扩增体系中模板的含量(5ul)与本实施例中浓度均为10umol/l的引物F和引物R各1ul，以及1ul的探针A组组合物混合，用罗氏cobas z480全自动荧光定量PCR分析仪，96孔热循环模块按照反应条件进行PCR。如图1和表3示出内容：

表3 1-10组灵敏度检测反应表

由表1和图1可以看出，所有内标均正常扩增，说明按照本实施例的PCR的扩增环境并无任何异样，同理，采用10组来自定感染非洲猪瘟不同带病体模板均检测出为阳性，检出率达到100％，证明本实施例中的A组组合物中的引物对和探针在非洲猪瘟病毒检测方面的灵敏度是可靠的，并不存在弱阳的状态，能够精准的给予准确的诊断结论。现对于现有技术中因检测状态存在弱阳的情况，需要进行二次复检而言，在实际检疫过程中可以节省大量的判断时间，避免疫情的进一步扩大，为及时对带病体进行隔离争取宝贵时间。从图1的内标曲线和检测曲线亦可表现，并没有明显偏离的曲线，其中部分小组呈现峰值对应的循环周期存在差异，究其缘由，是由模板本身的浓度决定，模板浓度越大则峰值对应循环数将越小，故而该曲线呈现情况并不影响本实施例中A组组合物对带病体灵敏度的判断。基于上述实验情况，本实施例中A组组合物对应的引物对和探针具有明显优于现有技术中采用taqman方式检测中采用的引物对和探针的灵敏度，由于检出率达到100％，作为本领域普通技术人员，亦应当认定本实施例提供的所述A组组合物中的引物对和探针至少应符合与现有技术等同之技术效果。

实施例2：

本实施例是从特异性方面反映本发明提供的引物对和探针在非洲猪瘟病毒检测方面的准确性，本实施例的目的是验证A组组合物中的引物对和探针在非洲猪瘟病毒检测方面的特异性。具体地A组组合物中的引物对如表4所示：

表4

探针如下表5所示：

表5

其中，扩增产物序列具体见序列表所示。

扩增体系采用：5ul的10X PCRmix溶液、4ul浓度为10mmol/l的dNTP mix溶液、1ul浓度为5U/mL的UNG酶、1ul 2.5U/mL的TaqDNA聚合酶、浓度均为10umol/l的引物F和引物R各1ul，以及1ul的探针A，5ul的模板和31ul的水组成。其中，所述10X PCRmix溶液具体由500mmol/l的KCl、100mmol/l且PH＝9.0的TRIS-HCl和1％Triton-X组成。所述dNTP mix溶液具体由7.5mmol/l的dUTP、2.5mM/L的dTTP、10mM/L的dATP、dGTP和dCTP组成。

模板：将分别来自于10头确定感染非洲猪瘟病例采集的唾液置于1ml生理盐水中，混合液均匀，再分别取80ul，分别并置于20ul预处理液中在85℃的环境下处理8分钟备用并分别记录为11-20组标签。

同时，采用与实施例1相同的测试步骤对11-20组进行特异性测试，结果如图2和表6所示：

表6

本实施例在相同的PCR扩增体系和环境下，获得了与实施例1如出一辙的实验结论，所有内标100％扩增，所有非携带非洲猪瘟病毒样品检出率为0％，扩增产物单一，说明A组组合物的特异性极高，并未出现异常检出的情况，说明本实施例设计的探针对应非洲猪瘟基因的编码区具有特定性，受其他基因序列影响的概率极低。当然，值得说明的是，本实施例中选取的引物对是针对非洲猪瘟全基因序列中的P72基因编码区设定，经发明人团队反复实验论证，具有极高的特异性，完全满足精准检测的要求；诚然，不排除还具有其他与本发明相同灵敏度和特异性的引物对和探针存在，但这并不影响本发明对非洲猪瘟病毒检测在特异性和灵敏度方面的有效表征。

实施例3：

本实施例是在本发明的设计思路下，提供另三组组合物B、组合物C和组合物D，其包含的引物对和探针分别如表7所示：

表7

探针如下表8所示：

表8

其中，扩增产物序列具体见序列表所示。

将B组组合物引物对和探针,C组组合物引物对和探针，D组组合物引物对和探针分别按照实施例1和2的环境及测试方式进行单独的灵敏度和特异性实验，获得了如A组组合物相近的技术效果。经发明人团队的不懈努力反复实验验证，虽根据已知公开的非洲猪瘟病毒全基因序列可以研发设计出多种引物对和探针，但是上述4组引物对和探针为经过诸多实验获得其特异性和灵敏度明显高于其他引物对和探针的，在实现对非洲猪瘟病毒的精准、快速检测上具有突出的实质性特点，从检测的效果来看，效果亦为显著。

上述实施例中，涉及引物对扩增产物片段标记如下：

A组引物对扩增产物标记为SEQ ID NO：16；

B组引物对扩增产物标记为SEQ ID NO：17；

C组引物对扩增产物标记为SEQ ID NO：18；

D组引物对扩增产物标记为SEQ ID NO：19，详情见序列表所示。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 成都导胜生物技术有限公司

<120> 一种用于检测非洲猪瘟病毒DNA的组合物及试剂盒

<130> 2020-01-04

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 1

ttccatcaaa gttctgcagc 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 2

tattcctccc gtggcttca 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 3

gcctttccat attgttcaat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 4

ttgaagagga gacagaatcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 5

cattatcatt tttttcatga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 6

acgaccgcta taaaaacatt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 7

aaagtttaat gaccatgagt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 8

tgtgcaacat attgaacaat 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 9

acataccctt ccactacgga ggc 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 10

gggctcttgc tcaaacaatg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 11

cagaatcata ttccattctt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 12

aataaagtta tgtgctctaa 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 13

ttccatcaaa gttctgcagc 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 14

tattcctccc gtggcttca 19

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 15

ccttcatcga gcccatca 18

<210> 16

<211> 118

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 16

ttccatcaaa gttctgcagc tcttacatac ccttccacta cggaggcaat gcaattaaaa 60

cccccgatga tccgggtgcg atgatgatta cctttgcttt gaagccacgg gaggaata 118

<210> 17

<211> 190

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 17

gcctttccat attgttcaat atgttgcaca gtcttttgtg caagcatata cagcttggag 60

tctttaggtt cctctgatga gggctcttgc tcaaacaatg tttcaaagga ggatgtgcat 120

tcattggttt cattatcatt tttttcatga atgctttccg atgatgctga ggattctgtc 180

tcctcttcaa 190

<210> 18

<211> 190

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 18

cattatcatt tttttcatga atgctttccg atgatgctga ggattctgtc tcctcttcaa 60

acagcacatg cagaatcata ttccattctt cttgagcctg atgttcagta tacccttgcc 120

ctgcatatat atgagcagat ttcacaatat catacttaac agtactgagc aatgttttta 180

tagcggtcgt 190

<210> 19

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificeal Sequence)

<400> 19

aaagtttaat gaccatgagt cttaccacct ctttttcttc ttcctttaga ggggttccat 60

gaatggtttg aataaagtta tgtgctctaa taaccttgtt aaaatcaggt gcctttccat 120

attgttcaat atgttgcaca 140

Claims

1.一种用于检测非洲猪瘟病毒DNA的组合物，其特征在于：包含A组或者包含A组在内的多组引物对和探针；

另一组C由引物对引物-F：SEQ ID NO：5，引物-R：SEQ ID NO：6和探针C：SEQ ID NO：11组成；还包括

另一组D由引物对引物-F：SEQ ID NO：7，引物-R：SEQ ID NO：8和探针D：SEQ ID NO：12组成。

2.根据权利1所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒DNA的组合物，其特征在于：所述探针A、探针B和探针C均包含荧光分子5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团，所述5’端采用FAM、HEX、CY3、CY5、VIC、ROX中任一一种，所述3’端对应的采用BHQ1、BHQ2、Dabcyl、TAMRA、eclipse中任一一种。

3.根据权利1所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒DNA的组合物，其特征在于：还包括内标，内标引物-F：SEQ ID NO：13；内标引物-R：SEQ ID NO：14；内标探针：SEQ ID NO：15，其中内标探针含荧光分子5’端的荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为Bhq1。

4.一种试剂盒，其特征在于：包含权利要求1-3中任一项所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒DNA的组合物。

5.根据权利4所述的一种试剂盒，其特征在于：还包括扩增反应体系，具体由5ul的10XPCRmix溶液、4ul浓度为10mmol/l的dNTP mix溶液、1ul浓度为5U/mL的UNG酶、1ul2.5U/mL的TaqDNA聚合酶、浓度均为10umol/l的引物F和引物R各1ul，以及1ul的探针，1-5ul的模板和31-35ul的水组成50ul的扩增反应体系。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述10X PCRmix溶液具体由500mmol/l的KCl、100mmol/l且PH＝9.0的TRIS-HCl和1％Triton-X组成。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述dNTP mix溶液具体由7.5mmol/l的dUTP、2.5mM/L的dTTP、10mM/L的dATP、dGTP和dCTP组成。

8.根据权利要求4-7任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒在用于非洲猪瘟病毒检测中的应用。