KR101857684B1 - 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 검출방법 - Google Patents

중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중동호흡기증후군 코로나바이러스 MERS-CoV를 검출하기 위한 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 검출방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 뉴클레오캡시드 유전자를 타겟으로 하는 특정 염기서열로 이루어진 프라이머 및 프로브가 upE와 ORF1a 유전자를 타겟으로 한 기존에 사용되고 있는 MERS 실시간 PCR 키트 및 N2 유전자의 프라이머 및 프로브 세트보다 RT-PCR에 대한 민감도가 더 높아 MERS-CoV를 정확하게 검출할 수 있으므로, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 MERS-CoV의 검출 및 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 검출방법{PRIMERS AND PROBE FOR DETECTION OF MIDDLE EAST RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS AND DETECTING METHOD FOR MIDDLE EAST RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS USING THE SAME}
본 발명은 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 검출방법에 관한 것이다.
중동호흡기증후군(middle east respiratory syndrome, MERS)은 2012년 9월 중동 지역을 중심으로 처음 발생하였으며, WHO에서 발표한 바에 따르면, 2017년 6월 5일을 기준으로 26개국으로 확산되어, 전 세계적으로 1,980명의 확진환자와 693명의 사망자를 발생시킨 치사율이 35%에 이르는 고위험 질환이다.
MERS의 병원체인 중동호흡기증후군 코로나바이러스(middle east respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)는 2012년에 새로 발견된 베타코로나바이러스(βCoV)이며, 약 3만 kb의 (+)-센스 단일가닥 RNA 바이러스로 중증급성호흡기증후군(severe acute respiratory syndrome, SARS) 바이러스와 유사한 바이러스이다. MERS-CoV는 스파이크 단백질(S protein)을 이용해 사람의 DPP4(Dipeptidyl peptidase 4) 수용체에 결합하여 세포 내로 침투하여(Wang N, Shi X, Jiang LJ, Zhang S, Wang D, Tong P, Guo D, et al., Cell Research. 2013:23:986), 1주일 정도의 잠복기를 가지며, 고열, 기침, 호흡곤란 등 심한 호흡기 증상을 일으킨다.
현재 MERS-CoV 진단을 위한 진단검사의학적 검사로 PCR법을 이용한 MERS-CoV 유전자 검출법이 확진검사법으로 이용되고 있다. WHO 실험실 표준검사지침은 1차적으로 upE 유전자를 스크리닝하여 MERS에 감염되었는지 확인한 후, 양성 시료에 대하여 ORF1a 또는 ORF1b 유전자를 스크리닝하여 확진하는 것을 권고하고 있다. 그러나, ORF1b 유전자는 ORF1a에 비해 민감도에 대한 효율이 떨어지므로 2차 확진검사에서는 사용을 권고하고 있지 않다. 다만, 2차 확진검사에서도 불명확한 시료에 대해서만 ORF1b 유전자에 대한 염기서열 분석을 권장하고 있으나, 감염자가 많은 경우에는 상기와 같은 검사가 현실적으로 불가능하다.
또한, MERS_CoV는 하기도에서 증식하기 때문에 객담을 채취하여 검사해야하는데 객담 채취가 매우 고통스럽고 샘플간의 편차가 심하기 때문에 1 카피(copy)의 바이러스라도 검출할 수 있는 민감도가 높은 진단방법의 개발이 필요하다.
이와 관련하여, 대한민국 특허공개 제10-2017-0051884호에는 MERS-CoV의 nsp3 영역과 구조단백질 영역인 M 염기서열 부위를 탐지하는 MERS-CoV 검출용 분자비콘, 이를 이용한 MERS-CoV 감염 진단용 키트 및 MERS-CoV 검출방법이 개시되어 있다.
이에, 본 발명자들은 높은 민감도로 MERS-CoV를 검출하기 위한 방법을 개발하던 중, 뉴클레오캡시드 유전자를 타겟으로 하는 특정 염기서열로 이루어진 프라이머 및 프로브를 제작하고, 상기 프라이머 및 프로브를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하면 기존에 사용되고 있는 upE와 ORF1a 유전자를 타겟으로 한 MERS 실시간 PCR 키트 및 N2 유전자의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 것보다 Ct 값이 낮게 나타나 MERS-CoV의 검출 민감도가 더 높음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 사용하여 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 7 및 서열번호 8로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 9로 기재되는 염기서열로 이루어진 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 프로브를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 검체를 주형으로 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 것을 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 뉴클레오캡시드 유전자를 타겟으로 하고, 특정 염기서열로 이루어진 프라이머 및 프로브는 기존에 사용되고 있는 upE와 ORF1a 유전자를 타겟으로 한 MERS 실시간 PCR 키트 및 N2 유전자의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 MERS-CoV를 검출한 것보다 민감도가 더 우수하므로, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 MERS-CoV의 검출 및 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 N2 유전자(A) 또는 N3 유전자(B)의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행하여 이의 형광 증폭 곡선을 확인한 그래프이다.
도 2는 기존에 사용되고 있는 MERS(upE와 ORF1a) 실시간 PCR 키트(A), 기존에 알려진 N2 유전자의 프라이머 및 프로브 세트(B) 또는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트(C)를 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행하여 이의 민감도를 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 7 및 서열번호 8로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머는 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 상기 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 20 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머 쌍일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 7 및 서열번호 8로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 9로 기재되는 염기서열로 이루어진 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 프로브를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어“프로브”는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM일 수 있다.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 소광자는 BHQ1일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 7 및 서열번호 8로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 9로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머는 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트는 상기 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 20 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머 쌍일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 7 및 서열번호 8로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 프로브는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가, 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM, 상기 소광자는 BHQ1일 수 있다.
상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 및 프로브 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 N2 유전자의 서열을 기초로 서열번호 7 및 서열번호 8로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 9로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 제작하고(표 4 참조), 이를 이용하여 실시간 RT-PCR의 검출 민감도를 비교한 결과, 기존에 사용되고 있는 upE와 ORF1a 유전자를 타겟으로 한 MERS 실시간 PCR 키트 및 N2 유전자의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하는 것보다 Ct 값이 더 낮게 나타나 MERS-CoV의 검출 민감도가 더 높음을 확인하였다(표 5 및 도 2 참조).
또한, 본 발명은 본 발명의 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 조성물을 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 키트를 제공한다.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 7 및 서열번호 8로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 9로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 7 및 서열번호 8로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가, 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM, 상기 소광자는 BHQ1일 수 있다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 유전자인 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, 상보적인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Hot start Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 검체를 주형으로 서열번호 7 및 서열번호 8로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 9로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 것을 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 검출방법을 제공한다.
상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있다.
상기 프라이머 세트 및 프로브는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머는 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있으며, 상기 프라이머 세트는 상기 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 20 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머 쌍일 수 있다. 또한, 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가, 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
뉴클레오캡시드 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 제작
민감도가 높은 MERS 진단방법을 개발하기 위해 뉴클레오캡시드 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브를 하기와 같은 방법으로 제작하였다.
<1-1> 뉴클레오캡시드 참조 유전자 선별
참조(reference) 유전자를 선별하기 위해 기존에 알려진 뉴클레오캡시드 2(N2) 및 뉴클레오캡시드 3(N3) 유전자의 프라이머 및 프로브에 대한 실시간(Real-time) RT-PCR의 검출 민감도를 확인하였다. 구체적으로, 배양된 MERS-CoV로부터 RNA를 추출한 후, 3.7 X 104 TCID50/㎖로 희석한 시료를 이용하여 형광 증폭 곡선의 모양 및 Ct(cycle threshold)값을 확인하였다.
이때, 실시간 RT-PCR의 반응용액은 5 ㎕(1 ng/㎕)의 주형 RNA, 하기 표 1에 기재된 서열을 갖는 4 ㎕(10 pmol/㎕)의 0.25 μM 농도의 프라이머와 0.1 μM 농도의 프로브의 혼합물, 11 ㎕의 RT-MIX(ThermoFisher SCIENTIFIC, USA), RT-Enzyme(ThermoFisher SCIENTIFIC, USA) 및 멸균증류수를 혼합하여 총 부피가 20㎕가 되도록 하였다. 실시간 RT-PCR 반응은 ABI 7500 Fast(ABI, USA) 기기를 사용하였고, 프로브의 5'에는 리포터로서 FAM(6-carboxyfluorescein)을, 프로브의 3'에는 소광자(quencher)로서 BHQ1(black hole quencher 1)을 붙여 사용하였다. 실시간 RT-PCR 반응 조건은 하기 표 2와 같으며, 데이터는 검출 소프트웨어(ABI Version 2.3, USA)를 이용하여 분석하였다. 또한, Ct 값은 역치(threshold)를 0.2로, 기준선(baseline)을 3 내지 15로 하여 측정하였다.
N2 및 N3 유전자의 프라이머 및 프로브 서열
목적유전자 프라이머 또는 프로브 농도 서열(5'→3')
N2 Forward 0.25 μM GGCACTGAGGACCCACGT(서열번호 1)
Reverse 0.25 μM TTGCGACATACCCATAAAAGCA(서열번호 2)
Probe 0.1 μM CCCCAAATTGCTGAGCTTGCTCCTACA(서열번호 3)
N3 Forward 0.25 μM GGGTGTACCTGTTAATCGACCTTC(서열번호 4)
Reverse 0.25 μM TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT(서열번호 5)
Probe 0.1 μM ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG(서열번호 6)
실시간-RT PCR 반응조건
온도(℃) 시간 사이클
50 30분 1
95 10분 1
95 15초 40
60 1분
실시간 RT-PCR 결과로 얻은 Ct 값
Ct값
N2 유전자 N3 유전자
1 31.0 29.3
2 30.0 29.1
3 - 34.1
4 30.7 29.5
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, N3 유전자의 프라이머 및 프로브는 음성대조군에서 비특이적 밴드가 검출되었기 때문에 N2 유전자를 최종 참조 유전자(대조군)로 선별하였다(도 1).
<1-2> 뉴클레오캡시드(81B) 유전자의 프라이머 및 프로브 제작
민감도가 높은 MERS 진단방법을 개발하기 위해 뉴클레오캡시드(81B) 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브를 IDT 사(미국)에 의뢰하여 제작하였다. 프로브의 5'에는 리포터로 FAM을, 3'에는 소광자로 BHQ1을 붙였으며, 새로 제작된 프라이머 및 프로브 서열은 하기 표 4와 같다.
새로 제작된 유전자의 프라이머 및 프로브 서열
목적유전자 프라이머 또는 프로브 농도 서열(5'→3')
N(81B) 81B-Forward 0.25 μM GGTGATCTTCAATTGAATAAACTCGG(서열번호 7)
81B-Reverse 0.25 μM AGCACTGGCTGTAGGAGCAAG(서열번호 8)
81B-Probe 0.1 μM CCACGTTGGCCCCAAATTGCTG(서열번호 9)
<1-3> 뉴클레오캡시드 유전자의 프라이머 및 프로브 세트에 대한 실시간 RT-PCR의 검출 민감도 비교
실시예 <1-2>에서 새로 제작한 프라이머 및 프로브 세트와 upE와 ORF1a 유전자를 타겟으로 하여 기존에 사용되고 있는 MERS 실시간 PCR 키트(코젠바이오텍, 한국) 및 실시예 <1-1>의 N2 유전자의 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 실시간 RT-PCR의 검출 민감도를 비교하였다.
구체적으로, 배양된 MERS-CoV로부터 RNA를 추출한 후, 이를 1/1000, 1/10000, 1/100000 또는 1/1000000배로 희석하여 사용한 것을 제외하고는 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다.
실시간 RT-PCR 결과로 얻은 Ct 값
RNA 희석배수 MERS 실시간 PCR 키트 참조 유전자 새로 제작한 것
upE ORF1a N2 N 유전자(81B)
1/1,000 28.7 29.8 29.3 28.4
1/10,000 32.4 33.6 33.0 32.2
1/100,000 35.4 36.5 37.0 35.4
1/1,000,000 - - - -
그 결과, 표 5 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 참조 유전자 N2 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 것보다 실시예 <1-2>에서 새로 제작한 프라이머 및 프로브 세트를 이용하는 경우 Ct 값이 약 1 정도 낮게 나타났다. 이를 통해, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트가 종래에 사용되던 검출용 키트에 비해 MERS-CoV의 검출 민감도가 높음을 알 수 있었다(표 5 및 도 2).
<110> Korea Center for Disease Control and Prevention <120> PRIMERS AND PROBE FOR DETECTION OF MIDDLE EAST RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS AND DETECTING METHOD FOR MIDDLE EAST RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS USING THE SAME <130> 2017P-07-010 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N2 forward primer <400> 1 ggcactgagg acccacgt 18 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N2 reverse primer <400> 2 ttgcgacata cccataaaag ca 22 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N2 probe <400> 3 ccccaaattg ctgagcttgc tcctaca 27 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 forward primer <400> 4 gggtgtacct gttaatcgac cttc 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 reverse primer <400> 5 tctgtcctgt ctccgccaat 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 probe <400> 6 acccctgcgc aaaatgctgg g 21 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N(81B) forward primer <400> 7 ggtgatcttc aattgaataa actcgg 26 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N(81B) reverse primer <400> 8 agcactggct gtaggagcaa g 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N(81B) probe <400> 9 ccacgttggc cccaaattgc tg 22

Claims (10)

  1. 서열번호 7 및 서열번호 8로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트.
  2. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 서열번호 9로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 더 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합된, 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 조성물.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자(quencher)가 추가로 더 접합된, 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 조성물.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 리포터가 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 조성물.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 소광자가 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 조성물.
  8. 제 2항 또는 제 3항의 조성물을 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 키트.
  9. 검체를 주형으로 제 1항의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 검출방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 검체가 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는, 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 검출방법.
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