CN116024386B - 用于检测新型冠状病毒及区分Omicron不同突变株的引物探针组合和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于检测新型冠状病毒及区分Omicron不同突变株的引物探针组合和试剂盒。本发明提供的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合能够实现双管多重PCR检测新型冠状病毒并区分鉴别突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X；具有较高的灵敏度，能够满足临床实践中对于新型冠状病毒核酸检测灵敏度的要求，同时具有较高的特异性和准确性。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及用于检测新型冠状病毒及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合和试剂盒。
背景技术
目前新型冠状病毒(COVID-19，SARS-CoV-2)Omicron变异株仍是全球优势株。Omicron变异株主要包括BA.1、BA.2、BA.3、BA.4和BA.5。在全球范围内，从2022年8月19日至9月19日，通过GISAID共享了120617个SARS-CoV-2序列，其中，有119458条序列为Omicron关注变异(VOC)，占已报道序列的99.0％。既往研究显示Omicron BA.2的传染性大约是BA.1的1.4倍，BA.4和BA.5的传染性比BA.2高约36％。据相关研究显示，室数据表明疫苗免疫产生的中和抗体在阻断BA.4.X和BA.5.X效果方面不如阻断早期Omicron病毒株(包括BA.1.X和BA.2.X)有效。这可能使接种过疫苗和加强免疫的人也容易对多种Omicron变异株亚型易感。即使是因接种疫苗和先前感染Omicron BA.1.X而具有混合免疫力的人，也会产生难以使BA.4.X和BA.5.X丧失能力的抗体。南非的一项研究显示，相比于之前感染Omicron原始株BA.1的人，未接种疫苗的人感染BA.4或BA.5产生血液中和抗体下降了近8倍，而接种疫苗的人下降了约3倍。BA.4和BA.5传染性的增加使得这两个亚型可能会取代之前的BA.1、BA.2和BA.3亚型，并可能成为Omicron变异株新的主导亚型。
然而，目前尚无试剂盒可以检测新型冠状病毒并区分BA.4.X、BA.2.X、BA.5.X突变株，因此，亟需开发能够检测新型冠状病毒以及区分BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X突变株的引物探针组合及试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测新型冠状病毒及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合和试剂盒。
本发明对GISAID数据库收录的截止目前所有的BA.5.X、BA.2.X以及BA.4.X的新冠突变株的核苷酸序列进行序列对比，筛选确定了具有BA.5.X、BA.2.X、BA.4.X突变株区分意义的位点，包括S基因突变位点HV69/70del、L452R、F486V、Q493R，ORF1a基因突变位点L3201F，N基因突变位点P151S(各突变位点的序列比对示意图如图1、图2所示)；通过在S基因突变位点的基础上进一步引入ORF1a基因突变位点L3201F和N基因突变位点P151S进行突变株BA.4.X、BA.2.X、BA.5.X的区分，显著增加了特异性。针对上述位点设计多重特异性引物，利用多重PCR检测上述4个S基因突变位点、1个ORF1a基因突变位点和1个N基因突变位点，实现新型冠状病毒BA.2.X、BA.4.X、BA.5.X的突变株的区分鉴别。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合，所述引物探针组合包括：
第一引物探针组，用于检测S基因突变位点HV69/70del，其包括序列如SEQ IDNO.1-2所示的引物和序列如SEQ ID NO.3所示的探针；
第二引物探针组，用于检测S基因突变位点L452R、F486V、Q493R，其包括序列如SEQID NO.4-5所示的引物和序列如SEQ ID NO.6-8所示的探针；
第三引物探针组，用于检测ORF1a基因突变位点L3201F，其包括序列如SEQ IDNO.9-10所示的引物和序列如SEQ ID NO.11所示的探针；
第四引物探针组，用于检测N基因突变位点P151S，其包括序列如SEQ ID NO.12-13所示的引物和序列如SEQID NO.14所示的探针。
本发明中，BA.2.X代表BA.2以及除BA.2.75及其子世系以外的BA.2子世系，BA.4.X代表BA.4及其子世系，BA.5.X代表BA.5及其子世系。
经序列比对分析发现，BA.2.X含有ORF1a基因突变位点L3201F和S基因突变位点Q493R，但不含S基因突变位点HV69/70del、L452R、F486V和N基因突变位点P151S；BA.5.X含有S基因突变位点HV69/70del、L452R、F486V，但不含ORF1a基因突变位点L3201F、S基因突变位点Q493R以及N基因突变位点P151S；BA.4.X含有S基因突变位点HV69/70del、L452R、F486V和N基因突变位点P151S，但不含ORF1a基因突变位点L3201F和S基因突变位点Q493R。各突变株所含突变位点信息如表1所示。
表1突变位点信息
上述引物探针组中，序列如SEQ ID NO.1所示的引物为S基因HV69/70del突变位点的上游引物；序列如SEQ ID NO.2所示的引物为S基因HV69/70del突变位点的下游引物；S基因HV69/70del突变位点的探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
序列如SEQ ID NO.4所示的引物为S基因L452R突变位点、S基因F486V突变位点、S基因Q493R突变位点的上游引物；序列如SEQ ID NO.5所示的引物为S基因L452R突变位点、S基因F486V突变位点、S基因Q493R突变位点的下游引物；S基因L452R突变位点的探针的序列如SEQ ID NO.6所示；S基因F486V突变位点的探针的序列如SEQ ID NO.7所示；S基因Q493R突变位点的探针的序列如SEQ ID NO.8所示；
序列如SEQ ID NO.9所示的引物为ORF1a基因L3201F突变位点的上游引物；序列如SEQ ID NO.10所示的引物为ORF1a基因L3201F突变位点的下游引物；ORF1a基因L3201F突变位点的探针的序列如SEQ ID NO.11所示；
序列如SEQ ID NO.12所示的引物为N基因P151S突变位点的上游引物；序列如SEQID NO.13所示的引物为N基因P151S突变位点的下游引物；N基因P151S突变位点的探针的序列如SEQ ID NO.14所示。
为进一步降低检测的假阴性率，在以上所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合中进一步引入内参引物和探针。
具体地，所述用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合还包括内参引物探针组；
所述内参引物探针组用于扩增人内源性基因B2M RNA，包括序列如SEQ ID NO.21-22所示的引物和序列如SEQ ID NO.23所示的探针。
其中，序列如SEQ ID NO.21所示的引物为人内源性基因B2M RNA内参上游引物，序列如SEQ ID NO.22所示的引物为人内源性基因B2M RNA内参下游引物，人内源性基因B2MRNA内参的探针的序列如SEQ ID NO.23所示。
引入上述针对RNA检测的内参作为内控系统，能够更有效地监测样本采集、提取过程，避免假阴性结果。
本发明根据目标突变位点附近的突变情况设计了不同的扩增策略。其中，S基因突变位点F486V和Q493R附近含有S477N、T478K、E484A、Q498R、N501Y等突变，且F486V和Q493R两个位点较为相近，经筛选确定采用TaqMan-MGB探针法检测S基因突变位点L452R、F486V和Q493R；S基因突变位点HV69/70del、ORF1a基因突变位点L3201F、N基因突变位点P151S采用ARMS-PCR检测；而内参B2M RNA则采用普通TaqMan探针法检测。
优选地，序列如SEQ ID NO.3、11、14、23所示的探针为普通TaqMan探针，序列如SEQID NO.6-8所示的探针为TaqMan-MGB探针。
对于上述普通TaqMan探针，探针的5′端包含荧光基团标记，所述荧光基团标记可选自FAM、HEX、ROX、CY5中的一种；探针的3′端含有淬灭基团标记，所述淬灭基团标记可选自BHQ1、BHQ2中的一种。
对于TaqMan-MGB探针，探针的5′端包含荧光基团标记，所述荧光基团标记可选自FAM、HEX、ROX、CY5中的一种；探针的3′端包含MGB标记。
本发明中，各探针的荧光基团标记不限于同一波长的单个标记，也可包括不同标记组合的多重检测标记。
第二方面，进一步结合用于检测新型冠状病毒的引物探针，本发明提供用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合，所述引物探针组合包括用于检测新型冠状病毒的引物探针组合以及以上所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合。
本发明中，上述用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合可以与目前已有的用于检测新型冠状病毒的引物探针组合使用，首先确定是否存在新型冠状病毒，再进一步所含新型冠状病毒的突变株的类型进行鉴别。
或者，上述用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合可以与本发明提供的检测ORF1ab和N基因保守区域的引物探针组联合使用，进而实现利用双管多重PCR即可完成新型冠状病毒的检测以及BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X突变株的鉴别。
优选地，所述用于检测新型冠状病毒的引物探针组合包括：
第五引物探针组，用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因保守区域，其包括序列如SEQID NO.15-16所示的引物和序列如SEQ ID NO.17所示的探针；
第六引物探针组，用于检测新型冠状病毒N基因保守区域，其包括序列如SEQ IDNO.18-19所示的引物和序列如SEQ ID NO.20所示的探针。
其中，序列如SEQ ID NO.15所示的引物为ORF1ab基因保守序列的上游引物；序列如SEQ ID NO.16所示的引物为ORF1ab基因保守序列的下游引物；ORF1ab基因保守序列的探针的序列如SEQ ID NO:17所示；
序列如SEQ ID NO.18所示的引物为N基因保守序列的上游引物；序列如SEQ IDNO.19所示的引物为N基因保守序列的下游引物；N基因保守序列的探针的序列如SEQ IDNO:20所示。
优选地，ORF1ab、N基因保守序列采用普通TaqMan探针法检测。
上述序列如SEQ ID NO.17、20所示的探针为普通TaqMan探针。探针的5′端包含荧光基团标记，所述荧光基团标记可选自FAM、HEX、ROX、CY5中的一种；探针的3′端含有淬灭基团标记，所述淬灭基团标记可选自BHQ1、BHQ2中的一种。
基于上述引物探针组合，并结合ARMS-PCR、TaqMan-MGB探针和普通TaqMan探针技术，本发明实现了双管多重PCR检测新型冠状病毒ORF1ab和N基因保守序列以及4个S基因突变位点、1个ORF1a基因突变位点、1个N基因突变位点，进而实现了新型冠状病毒的检测以及突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的鉴别。
优选地，上述引物探针组合在进行新型冠状病毒的检测以及突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的区分时，分两管进行多重PCR扩增，其中一管使用序列如SEQ ID NO.1-8所示的引物和探针进行扩增，另一管使用序列如SEQ ID NO.9-23所示的引物和探针进行扩增。
第三方面，本发明提供以上所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合或所述用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合在制备用于检测新型冠状病毒和/或区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的试剂盒中的应用。
本发明提供所述用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合在制备用于区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的试剂盒中的应用。
本发明提供所述用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合在制备用于检测新型冠状病毒并区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的试剂盒中的应用
第四方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合，或者，所述试剂盒包含所述的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合。
优选地，所述试剂盒中，各引物的工作浓度为0.1-0.5μM；各探针的工作浓度为0.1-0.3μM。
所述试剂盒中，引物和探针可分别单独包装，也可以混合物的形式提供。单独包装时，各引物和探针可为干粉形式，或者以母液或工作液的形式提供，以母液提供时，对于各引物和探针的浓度没有特殊限制，只要能够稀释为上述工作浓度即可。以工作液提供时，各引物的浓度为0.1-0.5μM，各探针的浓度为0.1-0.3μM。在以混合物形式提供时，引物探针混合物可为干粉、母液或工作液的形式。母液中，配对使用的上游引物、下游引物和探针的浓度比为(0.1-0.5)：(0.1-0.5)：(0.1-0.3)。
进一步优选地，所述试剂盒还包含选自PCR酶系、PCR反应预混液、阳性质控品和阴性质控品中的一种或多种。
其中，所述PCR酶系包括DNA聚合酶、UDG酶和逆转录酶；
所述PCR反应预混液包括Tris-HCl、KCl、MgCl2、X-100、胆酸钠、dATP、dTTP、dUTP、dCTP和dGTP。
在PCR检测体系中引入UNG酶和dUTP防污染措施，将可能存在的PCR产物污染充分降解，以避免由此引起的假阳性结果。
优选地，所述试剂盒中，PCR反应预混液与所述引物探针组合混合，以混合物形式提供。
在本发明的一些实施方式中提供一种试剂盒，所述试剂盒包括：
第一容器，其包含第一PCR反应体系，所述第一PCR反应体系包括序列如SEQ IDNO.9-23所示的引物和探针；40-60mM Tris-HCl(pH8.9)、150-170mM KCl、3-5mM MgCl2、0.1-0.3％X-100、0.1-0.3％胆酸钠、0.5-0.7mMdATP、0.2-0.4mM dTTP、0.2-0.4mMdUTP、0.5-0.7mM dCTP、0.5-0.7mM dGTP；灭菌注射用水，
以及第二容器，其包含第二PCR反应体系，所述第二PCR反应体系包括序列如SEQID NO.1-8所示的引物和探针；40-60mM Tris-HCl(pH8.9)、150-170mM KCl、3-5mM MgCl2、0.1-0.3％X-100、0.1-0.3％胆酸钠、0.5-0.7mM dATP、0.2-0.4mM dTTP、0.2-0.4mMdUTP、0.5-0.7mM dCTP、0.5-0.7mM dGTP；灭菌注射用水。
优选地，所述试剂盒还包含第三容器，其包含PCR酶系，所述PCR酶系包含DNA聚合酶终浓度1U/μL、逆转录酶终浓度10U/μL、Heat-labile UDG终浓度0.5U/μL、RNA酶抑制剂终浓度10U/μL；
和/或，第四容器，其包含阳性质控品，所述阳性质控品为S基因HV69/70del假病毒、S基因L452R假病毒、S基因F486V假病毒、S基因Q493R假病毒、ORF1a基因L3201F假病毒、N基因P151S假病毒、ORF1ab和N基因保守片段假病毒和内参B2M假病毒。
和/或，第五容器，其包含阴性质控品，所述阴性质控品为灭菌生理盐水。
以上所述的试剂盒在用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X时，以待测样品的核酸为模板，采用所述用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合进行PCR扩增并检测荧光信号，根据荧光信号判断待测样品是否含有新型冠状病毒以及含有突变株的类型。
优选地，所述试剂盒进行新型冠状病毒检测以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的方法包括如下步骤：
1)提取待测样品的核酸；
2)以步骤1)的核酸为模板，采用所述用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合进行PCR扩增(RT-PCR)并检测荧光信号；
3)根据荧光信号判断待测样品是否含有新型冠状病毒，若含有新型冠状病毒，进一步判断所含突变株的类型。
上述步骤2)中，PCR扩增的反应体系中，除序列如SEQ ID NO.4和5所示的引物外，其余各引物的浓度为0.1-0.5μM，序列如SEQ ID NO.4和5所示的引物的浓度为0.3-1.5μM，各探针的浓度为0.1-0.3μM。
PCR扩增分两个反应体系进行，第一PCR反应体系包括：序列如SEQ ID NO.9-23所示的引物和探针，各引物的终浓度为0.1-0.5μM(优选为0.2μM)，各探针的终浓度为0.1-0.3μM(优选为0.1μM)；20-30mM Tris-HCl(pH8.9)、75-85mM KCl、1.5-2.5mM MgCl2、0.05-0.15％X-100、0.05-0.15％胆酸钠、0.25-0.35mM dATP、0.1-0.2mMdTTP、0.1-0.2mMdUTP、0.25-0.35mM dCTP、0.25-0.35mM dGTP，DNA Polymerase终浓度0.4-0.6U/μL、ReverseTranscriptase终浓度4-6U/μL、Heat-labile UDG终浓度0.2-0.3U/μL、MurineRNase inhibitor终浓度4-6U/μL以及灭菌注射用水。
第二PCR反应体系包括：序列如SEQ ID NO.1-8所示的引物和探针，各引物的终浓度为0.1-0.5μM，各探针的终浓度为0.1-0.3μM；20-30mM Tris-HCl(pH8.9)、75-85mM KCl、1.5-2.5mM MgCl2、0.05-0.15％X-100、0.05-0.15％胆酸钠、0.25-0.35mM dATP、0.1-0.2mM dTTP、0.1-0.2mM dUTP、0.25-0.35mM dCTP、0.25-0.35mMdGTP，DNA Polymerase终浓度0.4-0.6U/μL、Reverse Transcriptase终浓度4-6U/μL、Heat-labile UDG终浓度0.2-0.3U/μL、Murine RNase inhibitor终浓度4-6U/μL以及灭菌注射用水。
PCR扩增程序为：55℃逆转录15min，95℃热启动30sec，95℃变性10sec、60℃退火35sec，共45个循环。
上述步骤3)中，所述判断待测样品是否含有新型冠状病毒以及含有突变株的类型的方法为：若Ct值≤40，则判断其检测的对应突变位点或保守区域为阳性，若Ct值＞40，则判断其检测的对应突变位点或保守区域为阴性；
以及，1)若S基因Q493R突变位点阳性，S基因HV69/70del突变位点阴性，S基因L452R突变位点阴性；S基因F486V突变位点阴性，ORF1a基因L3201F突变位点阳性，N基因P151S突变位点阴性；ORF1ab和N基因保守区域阳性，则判断BA.2.X突变株的检测结果为阳性；
2)若S基因Q493R突变位点阴性，S基因HV69/70del突变位点阳性，S基因L452R突变位点阳性；S基因F486V突变位点阳性，ORF1a基因L3201F突变位点阴性，N基因P151S突变位点阳性，ORF1ab和N基因保守区域阳性，则判断BA.4.X突变株的检测结果为阳性；
3)若S基因Q493R突变位点阴性，S基因HV69/70del突变位点阳性，S基因L452R突变位点阳性；S基因F486V突变位点阳性，ORF1a基因L3201F突变位点阴性，N基因P151S突变位点阴性，ORF1ab和N基因保守区域阳性，则判断BA.5.X突变株的检测结果为阳性；
4)若ORF1ab和N基因保守区域阳性，且S基因Q493R突变位点、S基因HV69/70del突变位点、S基因L452R突变位点、S基因F486V突变位点、ORF1a基因L3201F突变位点以及N基因P151S突变位点不符合上述1)、2)、3)的情况，则为非BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的新型冠状病毒阳性；
5)若ORF1ab和N基因保守区域阴性，S基因Q493R突变位点阴性，S基因HV69/70del突变位点阴性，S基因L452R突变位点阴性；S基因F486V突变位点阴性，ORF1a基因L3201F突变位点阴性，N基因P151S突变位点阴性，且B2M RNA内参阳性，则为新型冠状病毒阴性。
具体的结果判读规则如下：
HV69/70del突变检测结果的判定：若HV69/70del突变位点检测的Ct值≤40，则判定结果为HV69/70del突变阳性；若HV69/70del突变位点检测的Ct值＞40，则判定结果为HV69/70del突变阴性；
L452R突变检测结果的判定：若L452R突变位点检测的Ct值≤40，则判定结果为L452R突变阳性；若L452R突变位点检测的Ct值＞40，则判定结果为L452R突变阴性；
F486V突变检测结果的判定：若F486V突变位点检测的Ct值≤40，则判定结果为F486V突变阳性；若F486V突变位点检测的Ct值＞40，则判定结果为F486V突变阴性；
Q493R突变检测结果的判定：若Q493R突变位点检测的Ct值≤40，则判定结果为Q493R突变阳性；若Q493R突变位点检测的Ct值＞40，则判定结果为Q493R突变阴性；
L3201F突变检测结果的判定：若L3201F突变位点检测的Ct值≤40，则判定结果为L3201F突变阳性；若L3201F突变位点检测的Ct值＞40，则判定结果为L3201F突变阴性；
P151S突变检测结果的判定：若P151S突变位点检测的Ct值≤40，则判定结果为P151S突变阳性；若P151S突变位点检测的Ct值＞40，则判定结果为P151S突变阴性；
ORF1ab和N基因保守区域检测结果的判定：若ORF1ab和N基因检测的Ct值≤40，则判定结果为ORF1ab和N基因阳性；若ORF1ab和N基因检测的Ct值＞40，则判定结果为ORF1ab和N基因阴性。
具体的结果分析方法如表2所示。
表2结果判读标准
第五方面，本发明提供一种非疾病诊断目的的检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的方法，所述方法包括：以待测样品的核酸为模板，采用以上所述的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合进行荧光定量PCR扩增并检测荧光信号，根据荧光信号判断待测样品是否含有新型冠状病毒以及含有突变株的类型。
优选地，所述判断待测样品是否含有新型冠状病毒以及含有突变株的类型的方法为：若Ct值≤40，则判断其检测的对应突变位点或保守区域为阳性，若Ct值＞40，则判断其检测的对应突变位点或保守区域为阴性；
以及，1)若S基因Q493R突变位点阳性，S基因HV69/70del突变位点阴性，S基因L452R突变位点阴性；S基因F486V突变位点阴性，ORF1a基因L3201F突变位点阳性，N基因P151S突变位点阴性；ORF1ab和N基因保守区域阳性，则判断BA.2.X突变株的检测结果为阳性；
2)若S基因Q493R突变位点阴性，S基因HV69/70del突变位点阳性，S基因L452R突变位点阳性；S基因F486V突变位点阳性，ORF1a基因L3201F突变位点阴性，N基因P151S突变位点阳性，ORF1ab和N基因保守区域阳性，则判断BA.4.X突变株的检测结果为阳性；
3)若S基因Q493R突变位点阴性，S基因HV69/70del突变位点阳性，S基因L452R突变位点阳性；S基因F486V突变位点阳性，ORF1a基因L3201F突变位点阴性，N基因P151S突变位点阴性，ORF1ab和N基因保守区域阳性，则判断BA.5.X突变株的检测结果为阳性；
4)若ORF1ab和N基因保守区域阳性，且S基因Q493R突变位点、S基因HV69/70del突变位点、S基因L452R突变位点、S基因F486V突变位点、ORF1a基因L3201F突变位点以及N基因P151S突变位点不符合上述1)、2)、3)的情况，则为非BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的新型冠状病毒阳性；
5)若ORF1ab和N基因保守区域阴性，S基因Q493R突变位点阴性，S基因HV69/70del突变位点阴性，S基因L452R突变位点阴性；S基因F486V突变位点阴性，ORF1a基因L3201F突变位点阴性，N基因P151S突变位点阴性，且B2M RNA内参阳性，则为新型冠状病毒阴性。
上述非疾病诊断目的的检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的方法可为针对环境样本等并非来自有生命的人或动物的样本进行检测。
本发明的有益效果在于：本发明提供的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合能够实现双管多重PCR检测新型冠状病毒并区分鉴别突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X；具有较高的灵敏度(检出限为500copies/mL)，能够满足临床实践中对于新型冠状病毒核酸检测灵敏度的要求，同时具有较高的特异性和准确性。
本发明通过进一步引入针对RNA检测的内控系统，能够更有效地监测样本采集、提取过程，避免假阴性结果；通过在PCR检测体系中引入UNG酶和dUTP防污染措施，将可能存在的PCR产物污染充分降解，避免引起的假阳性结果，进一步提高了检测的准确性和特异性。
本发明提供的引物探针组合和试剂盒为新型冠状病毒的检测以及Omicron株分支BA.2.X、BA.4.X、BA.5.X的鉴别提供了有效的工具和方法，有助于对突变株的传播流行趋势进行评估，进而根据不同突变株特征进行防控，做到最大限度早发现、早诊断、早隔离、早治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的发明内容部分中BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X在ORF1a基因和N基因的突变位点。
图2为本发明的发明内容部分中BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X在S基因的突变位点。
图3为本发明实施例4的第二容器中S基因F486V假病毒的检测结果，从上至下假病毒的浓度依次为1000、500、250copies/mL。
图4为本发明实施例4的第二容器中S基因Q493R假病毒的检测结果，从上至下假病毒的浓度依次为1000、500、250copies/mL。
图5为本发明实施例4的第二容器中S基因HV69/70del假病毒的检测结果，从上至下假病毒的浓度依次为1000、500、250copies/mL。
图6为本发明实施例4的第二容器中S基因L452R假病毒的检测结果，从上至下假病毒的浓度依次为1000、500、250copies/mL。
图7为本发明实施例4的第一容器中ORF1ab和N基因保守片段假病毒的检测结果，从上至下假病毒的浓度依次为1000、500、250copies/mL。
图8为本发明实施例4的第一容器中内参B2M假病毒的检测结果，从上至下假病毒的浓度依次为1000、500、250copies/mL。
图9为本发明实施例4的第一容器中ORF1a基因L3201F假病毒的检测结果，从上至下假病毒的浓度依次为1000、500、250copies/mL。
图10为本发明实施例4的第一容器中N基因P151S假病毒的检测结果，从上至下假病毒的浓度依次为1000、500、250copies/mL。
图11为本发明实施例5的准确度验证结果——BA.2.X突变株模拟样本检测结果，其中上图为第一容器的检测结果，下图为第二容器的检测结果。
图12为本发明实施例5的准确度验证结果——BA.4.X突变株模拟样本检测结果，其中上图为第一容器的检测结果，下图为第二容器的检测结果。
图13为本发明实施例5的准确度验证结果——BA.5.X突变株模拟样本检测结果，其中上图为第一容器的检测结果，下图为第二容器的检测结果。
图14为本发明实施例5的准确度验证结果——SARS-CoV-2野生型模拟样本检测结果，其中上图为第一容器的检测结果，下图为第二容器的检测结果。
图15为本发明实施例5的准确度验证结果——SARS-CoV-2阴性样本检测结果，其中上图为第一容器的检测结果，下图为第二容器的检测结果。
图3-图15中不同颜色的扩增曲线代表不同检测通道的检测结果；橙色的扩增曲线代表ROX通道的检测结果；蓝色的扩增曲线代表FAM通道的检测结果；红色的扩增曲线代表CY5通道的检测结果；绿色的扩增曲线代表HEX通道的检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合，其包括6对引物和8条特异性探针，其中，6对引物的核苷酸序列依次如SEQID NO.1-2、SEQ ID NO.4-5、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.12-13、SEQ ID NO.15-16、SEQ IDNO.18-19所示，8条特异性探针的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、7、8、SEQID NO.11、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.20所示。
上述引物对和探针组成了6个引物探针组：
第一引物探针组，用于检测S基因突变位点HV69/70del，由序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物和序列如SEQ ID NO.3所示的探针组成；
第二引物探针组，用于检测S基因突变位点L452R、F486V、Q493R，由序列如SEQ IDNO.4-5所示的引物和序列如SEQ ID NO.6-8所示的探针组成；
第三引物探针组，用于检测ORF1a基因突变位点L3201F，由序列如SEQ ID NO.9-10所示的引物和序列如SEQ ID NO.11所示的探针组成；
第四引物探针组，用于检测N基因突变位点P151S，由序列如SEQ ID NO.12-13所示的引物和序列如SEQ ID NO.14所示的探针组成。
第五引物探针组，用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因保守区域，由序列如SEQ IDNO.15-16所示的引物和序列如SEQ ID NO.17所示的探针组成；
第六引物探针组，用于检测新型冠状病毒N基因保守区域，由序列如SEQ IDNO.18-19所示的引物和序列如SEQ ID NO.20所示的探针组成。
进一步地，上述引物探针组合还包括序列如SEQ ID NO.21所示的内参上游引物、序列如SEQ ID NO.22所示的内参下游引物以及序列如SEQ ID NO.23所示的内参探针。
上述各探针的5’端包含有荧光报告基团FAM、HEX、ROX和Cy5中的一种，各探针的3’端包含有荧光淬灭基团BHQ1、BHQ2和MGB中的一种。
具体的引物和探针序列以及探针标记如表3所示。
表3引物探针序列
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实施例2
本实施例提供用于检测检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的试剂盒，该试剂盒包括实施例1中的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合、PCR酶系、PCR反应体系、阳性质控品以及阴性质控品。
试剂盒第一容器内包含第一PCR反应体系。第一PCR反应体系包括序列如SEQ IDNO.9-23所示的引物和探针的混合物；One Step U+Mix和灭菌注射用水；其中，One Step U+Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司，具体组成为25mM Tris-HCl(pH8.9)、80mM KCl、2mMMgCl2、0.1％X-100、0.1％胆酸钠、0.3mM dATP、0.15mM dTTP、0.15mM dUTP、0.3mMdCTP、0.3mM dGTP。
试剂盒第二容器内包含第二PCR反应体系。第二PCR反应体系包括序列如SEQ IDNO.1-8所示的引物和探针的混合物；One Step U+Mix和灭菌注射用水。One Step U+Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。具体组成为25mM Tris-HCl(pH8.9)、80mM KCl、2mMMgCl2、0.1％X-100、0.1％胆酸钠、0.3mM dATP、0.15mM dTTP、0.15mM dUTP、0.3mMdCTP、0.3mM dGTP。
试剂盒第三容器内包含PCR酶系One Step U+Enzyme Mix，One Step U+EnzymeMix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。具体成分为Champagne TaqTM DNA Polymerase终浓度1U/μL、II Reverse Transcriptase终浓度10U/μL、Heat-labile UDG终浓度0.5U/μL、Murine RNase inhibitor终浓度10U/μL；
试剂盒第四容器包含阳性质控品，阳性质控品为S基因HV69/70del假病毒、S基因L452R假病毒、S基因F486V假病毒、S基因Q493R假病毒、ORF1a基因L3201F假病毒、N基因P151S假病毒、ORF1ab和N基因保守片段假病毒和内参B2M假病毒。
试剂盒第五容器包含阴性质控品，阴性质控品为灭菌生理盐水。
在可选实施方式中，所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。
本实施例提供的引物探针组合或试剂盒的检测原理为：部分突变靶标(S基因突变位点HV69/70del、ORF1a基因突变位点L3201F、N基因突变位点P151S)通过ARMS-PCR进行扩增，即通过引入目的突变位点和人为错配碱基至上下游引物中的一条，使该条引物能够特异性地结合在该突变位点上，而不与野生模板结合，最终特异性扩增突变靶标片段。另外的突变靶标(S基因突变位点L452R、F486V和Q493R)通过TaqMan-MGB进行扩增，即通过引入目的突变位点至TaqMan-MGB探针中，使该条探针能够特异性地结合在该突变位点上，而不与野生模板结合，最终特异性扩增突变靶标片段。ORF1ab、N基因的保守区域和内参B2M基因则通过普通TaqMan探针法进行扩增。然后通过荧光PCR仪对结果进行判读以进行新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的鉴定。
实施例3
本实施例提供利用实施例2的试剂盒对待测样品进行检测的方法，包括如下步骤：
(1)待测样本核酸提取
本试剂盒搭配核酸提取或纯化试剂(产品备案号：粤潮械备20210003号)进行待测样本和质控品提取，获得核酸提取物。
(2)PCR扩增
采用实施例1中的引物探针组合对待测样品进行PCR扩增，PCR扩增分两管进行(第一容器和第二容器)，每人份PCR反应液27μL，每人份PCR酶系3μL，核酸加样量20μL，每人份总反应体积为50μL。PCR扩增的反应体系具体如表4和表5所示。
表4每人份PCR反应体系(第一容器)
| 试剂名称 | 终浓度 |
| 2×one step U+Mix | 1× |
| SEQ ID NO.9 | 0.2μM |
| SEQ ID NO.10 | 0.2μM |
| SEQ ID NO.12 | 0.2μM |
| SEQ ID NO.13 | 0.2μM |
| SEQ ID NO.15 | 0.2μM |
| SEQ ID NO.16 | 0.2μM |
| SEQ ID NO.18 | 0.2μM |
| SEQ ID NO.19 | 0.2μM |
| SEQ ID NO.21 | 0.2μM |
| SEQ ID NO.22 | 0.2μM |
| SEQ ID NO.11 | 0.1μM |
| SEQ ID NO.14 | 0.1μM |
| SEQ ID NO.17 | 0.1μM |
| SEQ ID NO.20 | 0.1μM |
| SEQ ID NO.23 | 0.1μM |
| One Step U+Enzyme Mix | 1.29U/μL |
表5每人份PCR反应体系(第二容器)
PCR扩增程序为：55℃逆转录15min，95℃热启动30sec，95℃变性10sec、60℃退火35sec，共45个循环。
(3)根据各检测靶标对应通道的Ct值进行结果判读，结果判读标准如表2所示。
实施例4试剂盒的检测限测试
以已定值的S基因HV69/70del假病毒、S基因L452R假病毒、S基因F486V假病毒、S基因Q493R假病毒、ORF1a基因L3201F假病毒、N基因P151S假病毒、ORF1ab和N基因保守片段假病毒和内参B2M假病毒作为初始样本分别稀释至浓度为1000copies/mL、500copies/mL、250copies/mL，搭配核酸提取或纯化试剂(产品备案号：粤潮械备20210003号)，验证实施例2的试剂盒的检测限(PCR扩增条件如实施例3的(2)、(3)中所示)。
结果表明，对不同浓度的假病毒进行检测，S基因HV69/70del假病毒、S基因L452R假病毒、S基因F486V假病毒、S基因Q493R假病毒、ORF1a基因L3201F假病毒、N基因P151S假病毒、ORF1ab和N基因保守片段假病毒和内参B2M假病毒可检测出的最低浓度均可达到500copies/mL(图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10)。
实施例5试剂盒的准确性测试
将已定值的假病毒用阴性口咽拭子样本稀释成1000copies/mL的BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X突变株弱阳性人工模拟样本、SARS-CoV-2野生型模拟样本以及SARS-CoV-2阴性样本。使用实施例2的试剂盒对上述样本进行检测。
BA.2.X突变株模拟样本：S基因Q493R假病毒、ORF1a基因L3201F假病毒、ORF1ab和N基因保守片段假病毒和内参B2M假病毒，检测结果见图11；
BA.4.X突变株模拟样本：S基因HV69/70del假病毒、S基因L452R假病毒、S基因F486V假病毒、N基因P151S假病毒、ORF1ab和N基因保守片段假病毒和内参B2M假病毒，检测结果见图12；
BA.5.X突变株模拟样本：S基因HV69/70del假病毒、S基因L452R假病毒、S基因F486V假病毒、ORF1ab和N基因保守片段假病毒和内参B2M假病毒，检测结果见图13；
SARS-CoV-2野生型模拟样本：ORF1ab和N基因保守片段假病毒和内参B2M假病毒，检测结果见图14；
SARS-CoV-2阴性样本：检测结果见图15。
结果表明，利用实施例2的试剂盒，BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X突变株弱阳性人工模拟样本、SARS-CoV-2野生型模拟样本以及SARS-CoV-2阴性样本均可以准确检测。
实施例6试剂盒的特异性性(交叉反应)测试
以与新型冠状病毒SARS-CoV-2种属相近或引起症状相似的地方性人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)、MERS冠状病毒；H1N1(新型甲型H1N1流感病毒(2009)、季节性H1N1流感病毒)、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C组，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，肠道病毒A、B、C、D组，人偏肺病毒(人间质肺病毒)、EB病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、轮状病毒、诺如病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒；肺炎支原体、肺炎衣原体；军团菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌；烟曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌等、人类基因组DNA、S基因突变位点T478K假病毒、ORF1a基因突变位点T3090I假病毒、N基因突变位点R203I假病毒为特异性参考品，测试实施例2的试剂盒的特异性。结果表明，对上述临床样本进行检测，阴性符合均为100％。
实施例7试剂盒的特异性性(抗干扰能力)测试
分别向500copies/ml的实施例5的BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X突变株弱阳性人工模拟样本、SARS-CoV-2野生型模拟样本以及SARS-CoV-2阴性样本中分别加入呼吸道病原体治疗药物，如2％(v/v)全血、2.5％(w/v)粘蛋白、苯福林、倍氯美松、氟尼缩松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松、利巴韦林、帕拉米韦、利托那韦、阿比多尔、阿奇霉素、美罗培南、妥布霉素、头孢曲松、达菲(奥司他韦)、羟甲唑啉、PHNY滴鼻剂、地塞米松、左氧氟沙星、盐酸组胺、生理盐水鼻喷雾剂、a-干扰素、洛匹那韦、扎那米韦作为干扰物质测试样本，以不含干扰物质的假病毒作为对照，搭配核酸提取或纯化试剂(产品备案号：粤潮械备20210003号)，使用实施例2的试剂盒对上述样本进行检测，测试干扰物质对结果判读的影响。结果表明，上述干扰物质对检测结果无明显干扰，阳性检出率均为100％。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (14)
1.用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括：
第一引物探针组，用于检测S基因突变位点HV69/70del，其包括序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物和序列如SEQ ID NO.3所示的探针；
第二引物探针组，用于检测S基因突变位点L452R、F486V、Q493R，其包括序列如SEQ IDNO.4-5所示的引物和序列如SEQ ID NO.6-8所示的探针；
第三引物探针组，用于检测ORF1a基因突变位点L3201F，其包括序列如SEQ ID NO.9-10所示的引物和序列如SEQ ID NO.11所示的探针；
第四引物探针组，用于检测N基因突变位点P151S，其包括序列如SEQ ID NO.12-13所示的引物和序列如SEQ ID NO.14所示的探针；
其中，序列如SEQ ID NO.6-8所示的探针为TaqMan-MGB探针；
所述新型冠状病毒突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X中，BA.2.X代表BA.2以及除BA.2.75及其子世系以外的BA.2子世系，BA.4.X代表BA.4及其子世系，BA.5.X代表BA.5及其子世系。
2.根据权利要求1所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包括内参引物探针组；
所述内参引物探针组用于扩增人内源性基因B2M RNA，包括序列如SEQ ID NO.21-22所示的引物和序列如SEQ ID NO.23所示的探针。
3.根据权利要求2所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的引物探针组合，其特征在于，序列如SEQ ID NO.3、11、14、23所示的探针为普通TaqMan探针。
4.用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括用于检测新型冠状病毒的引物探针组合以及权利要求1~3任一项所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的引物探针组合；
所述新型冠状病毒突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X中，BA.2.X代表BA.2以及除BA.2.75及其子世系以外的BA.2子世系，BA.4.X代表BA.4及其子世系，BA.5.X代表BA.5及其子世系。
5.根据权利要求4所述的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的引物探针组合，其特征在于，所述用于检测新型冠状病毒的引物探针组合包括：
第五引物探针组，用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因保守区域，其包括序列如SEQ IDNO.15-16所示的引物和序列如SEQ ID NO.17所示的探针；
第六引物探针组，用于检测新型冠状病毒N基因保守区域，其包括序列如SEQ IDNO.18-19所示的引物和序列如SEQ ID NO.20所示的探针。
6.根据权利要求5所述的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的引物探针组合，其特征在于，序列如SEQ ID NO.17、20所示的探针为普通TaqMan探针。
7.权利要求1~3任一项所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的引物探针组合或权利要求4~6任一项所述的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的引物探针组合在制备用于检测新型冠状病毒和/或区分突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的试剂盒中的应用；
所述新型冠状病毒突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X中，BA.2.X代表BA.2以及除BA.2.75及其子世系以外的BA.2子世系，BA.4.X代表BA.4及其子世系，BA.5.X代表BA.5及其子世系。
8.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1~3任一项所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的引物探针组合或包含权利要求4~6任一项所述的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的引物探针组合；
所述新型冠状病毒突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X中，BA.2.X代表BA.2以及除BA.2.75及其子世系以外的BA.2子世系，BA.4.X代表BA.4及其子世系，BA.5.X代表BA.5及其子世系。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，各引物的工作浓度为0.1-0.5μM；各探针的工作浓度为0.1-0.3μM。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含选自PCR酶系、PCR反应预混液、阳性质控品和阴性质控品中的一种或多种；
其中，所述PCR酶系包括DNA聚合酶、UDG酶和逆转录酶；
所述PCR反应预混液包括Tris-HCl、KCl、MgCl2、Triton X-100、 胆酸钠、dATP、dTTP、dUTP、dCTP和dGTP。
11.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X时，以待测样品的核酸为模板，采用权利要求4~6任一项所述的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的引物探针组合进行PCR扩增并检测荧光信号，根据荧光信号判断待测样品是否含有新型冠状病毒以及所含新型冠状病毒突变株是否为BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述判断待测样品是否含有新型冠状病毒以及含有突变株的类型的方法为：若Ct值≤40，则判断其检测的对应突变位点或保守区域为阳性，若Ct值＞40，则判断其检测的对应突变位点或保守区域为阴性；
以及，1）若S基因Q493R突变位点阳性，S基因HV69/70del突变位点阴性，S基因L452R突变位点阴性；S基因F486V突变位点阴性，ORF1a基因L3201F突变位点阳性，N基因P151S突变位点阴性；ORF1ab和N基因保守区域阳性，则判断BA.2.X突变株的检测结果为阳性；
2）若S基因Q493R突变位点阴性，S基因HV69/70del突变位点阳性，S基因L452R突变位点阳性；S基因F486V突变位点阳性，ORF1a基因L3201F突变位点阴性，N基因P151S突变位点阳性，ORF1ab和N基因保守区域阳性，则判断BA.4.X突变株的检测结果为阳性；
3）若S基因Q493R突变位点阴性，S基因HV69/70del突变位点阳性，S基因L452R突变位点阳性；S基因F486V突变位点阳性，ORF1a基因L3201F突变位点阴性，N基因P151S突变位点阴性，ORF1ab和N基因保守区域阳性，则判断BA.5.X突变株的检测结果为阳性；
4）若ORF1ab和N基因保守区域阳性，且S基因Q493R突变位点、S基因HV69/70del突变位点、S基因L452R突变位点、S基因F486V突变位点、ORF1a基因L3201F突变位点以及N基因P151S突变位点不符合上述1）、2）和3）的情况，则为非BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的新型冠状病毒阳性；
5）若ORF1ab和N基因保守区域阴性，S基因Q493R突变位点阴性，S基因HV69/70del突变位点阴性，S基因L452R突变位点阴性；S基因F486V突变位点阴性，ORF1a基因L3201F突变位点阴性，N基因P151S突变位点阴性，且B2M RNA内参阳性，则为新型冠状病毒阴性。
13.一种非疾病诊断目的的检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的方法，其特征在于，所述方法包括：以待测样品的核酸为模板，采用权利要求4~6任一项所述的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的引物探针组合进行PCR扩增并检测荧光信号，根据荧光信号判断待测样品是否含有新型冠状病毒以及所含新型冠状病毒突变株是否为BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X；
所述突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X中，BA.2.X代表BA.2以及除BA.2.75及其子世系以外的BA.2子世系，BA.4.X代表BA.4及其子世系，BA.5.X代表BA.5及其子世系。
14.根据权利要求13所述的非疾病诊断目的的检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的方法，其特征在于，所述判断待测样品是否含有新型冠状病毒以及含有突变株的类型的方法为：若Ct值≤40，则判断其检测的对应突变位点或保守区域为阳性，若Ct值＞40，则判断其检测的对应突变位点或保守区域为阴性；
以及，1）若S基因Q493R突变位点阳性，S基因HV69/70del突变位点阴性，S基因L452R突变位点阴性；S基因F486V突变位点阴性，ORF1a基因L3201F突变位点阳性，N基因P151S突变位点阴性；ORF1ab和N基因保守区域阳性，则判断BA.2.X突变株的检测结果为阳性；
2）若S基因Q493R突变位点阴性，S基因HV69/70del突变位点阳性，S基因L452R突变位点阳性；S基因F486V突变位点阳性，ORF1a基因L3201F突变位点阴性，N基因P151S突变位点阳性，ORF1ab和N基因保守区域阳性，则判断BA.4.X突变株的检测结果为阳性；
3）若S基因Q493R突变位点阴性，S基因HV69/70del突变位点阳性，S基因L452R突变位点阳性；S基因F486V突变位点阳性，ORF1a基因L3201F突变位点阴性，N基因P151S突变位点阴性，ORF1ab和N基因保守区域阳性，则判断BA.5.X突变株的检测结果为阳性；
4）若ORF1ab和N基因保守区域阳性，且S基因Q493R突变位点、S基因HV69/70del突变位点、S基因L452R突变位点、S基因F486V突变位点、ORF1a基因L3201F突变位点以及N基因P151S突变位点不符合上述1）、2）和3）的情况，则为非BA.2.X、BA.4.X和BA.5.X的新型冠状病毒阳性；
5）若ORF1ab和N基因保守区域阴性，S基因Q493R突变位点阴性，S基因HV69/70del突变位点阴性，S基因L452R突变位点阴性；S基因F486V突变位点阴性，ORF1a基因L3201F突变位点阴性，N基因P151S突变位点阴性，且B2M RNA内参阳性，则为新型冠状病毒阴性。
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