CN111719016A - 检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物及应用 - Google Patents

检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物及应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及分子生物学检测技术领域，提供了一种检测新冠病毒2019‑nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物；该组合物能够同时检测上述三种不同的病毒，检测灵敏度高、重复性好、假阴性及假阳性低，能够有效鉴别新冠病毒感染和普通病毒性感冒引起的呼吸道感染，同时针对新冠病毒2019‑nCoV的特异性区域设计了双检测靶点，降低了单一靶点对新冠病毒2019‑nCoV的漏检情况，从而实现对患者的精准诊断及后续的精准治疗。

Description

检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物及 应用
技术领域
本申请属于分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种检测新冠病毒 2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物、一种检测新冠病毒2019-nCoV 以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒及一种利用所述的检测新冠病毒2019-nCoV 以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒进行检测的方法。
背景技术
2019年12月以来，经过持续开展流感及相关疾病监测，发现多起病毒性肺炎病例，均诊断为病毒性肺炎/肺部感染。随后研究发现，此前的肺炎/肺部感染均是由一种新型的冠状病毒感染引起。2020年1月12日被世界卫生组织命名为2019新型冠状病毒(2019-nCoV)。另外，当下正是各种甲型流感病毒、乙型流感病毒相关病毒感染致病高发期，其临床表现与新型冠状病毒肺炎相似，难以通过临床表现、胸部影像学鉴别。而且目前研究显示，新冠病毒感染者和非感染者，均有合并感染的现象。如果发热病例不能得到及时的快速精准诊断，流感病例很有可能被视同新型冠状病毒感染对待、患者合并感染多、交叉感染隐患大、给新型冠状病毒的防控带来极为不利影响。因此，临床诊断手段需要改进，应高度重视除新冠病毒外的其他呼吸道常见病原体筛查。在收诊新冠肺炎患者或疑似患者过程中，需要评估其他感染的可能性，以便及时进行临床分类、隔离和治疗。
目前，国内外对病毒感染的诊断方法，主要是血清学试验、病毒培养和PCR。其中，血清学试验、组织培养，具有灵敏度低、免疫交叉反应以及周期长等缺点；常规的多重实时荧光PCR技术是将PCR技术和多色荧光标记探针相结合的技术，可以在同一个PCR反应管中对多个病毒同时进行快速扩增，大大提高了检测效率；另外各色荧光的增长信号与相应PCR产物的增长量成等比关系，并被自动化荧光检测仪收集，最后可通过分析荧光增长曲线达到检测病原体类型的目的，具有极高的灵敏度和特异性，能够快速、准确的得到检测结果。
针对新型冠状病毒和甲型流感病毒、乙型流感病毒的检测，一方面，目前采用单指标检测，需要进行多次检测才能完成病原体的检测，在面对大规模样本检测时，无疑会耗费大量的人力物力，延长诊断时间；另一方面，新型冠状病毒归属为新型的SARS变异病毒，目前基于RT-qPCR检测技术的新型冠状病毒核酸检测试剂盒其引物探针均是针对单一的病原核酸序靶位点都设计的。众所周知，病毒的核酸序列变异程度高，其单碱基突变的频率远高于其他病原体。因此，针对新型冠状病毒的核酸检测，单一靶位点容易产生由于突变导致假阴性检测结果，造成漏检，导致检测不及时，影响后续的治疗情况。
发明内容
本申请的目的在于提供一种检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物及应用，旨在解决现有技术中无法同时、准确检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒的组合物且检测假阳性率较高的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物，所述组合物包括：
用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的第一上游引物SEQ ID No.1、第一下游引物SEQ ID No.2和第一探针序列SEQ ID No.3；
用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的第二上游引物SEQ ID No.4、第二下游引物SEQ ID No.5和第二探针序列SEQ ID No.6；
用于检测甲型流感病毒的第三上游引物SEQ ID No.7、第三下游引物SEQ ID No.8和第三探针序列SEQ ID No.9；
用于检测乙型流感病毒的第四上游引物SEQ ID No.10、第四下游引物SEQ IDNo.11和第四探针序列SEQ ID No.12。
第二方面，本申请提供一种检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物。
第三方面，本申请提供一种利用所述的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒进行检测的方法，该方法包括如下步骤：
获取含有新型冠状病毒2019-nCoV、甲型流感病毒、乙型流感病毒和内参目的基因的RNA提取物作为待测样品；
依据所述试剂盒提供的RT-qPCR反应液、RT-PCR酶、阳性质控品、阴性质控品、检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物以及所述待测样品，配制反应混合液；
将所述反应混合液进行荧光PCR扩增反应，根据荧光曲线判断分析检测结果。
本申请第一方面提供的一种检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物，所述组合物包括用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的两对不同的特异性引物和两对不同的探针序列，用于检测甲型流感病毒的一对特异性引物和探针序列，用于检测乙型流感病毒的一对特异性引物和探针序列；其中，用于检测新冠病毒2019-nCoVORF1ab靶基因的两对特异性引物是根据 2019-nCoV ORF1ab靶基因的特异性保守区序列进行设计的，两对特异性引物均以2019-nCoV ORF1ab靶基因为检测靶标，且两个靶标区域相隔为2000bp以上，保证用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的两对特异性引物可以分别作用、不会相互干扰，针对ORF1ab基因设计双靶点进行检测，可极大的降低单一靶点对变异病毒的漏检情况，从而提高对新冠病毒2019-nCoV的检测灵敏度；还提供了用于检测甲型流感病毒的一对特异性引物用于检测乙型流感病毒的一对特异性引物，保证能够同时对新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒进行检测分型，此外，针对每对不同的特异性引物还包括一特异性的探针序列，通过特异性探针序列，在同时检测时可快速分辨出三种不同的病毒，检测速率较高。该组合物的检测灵敏度高、重复性好、假阴性及假阳性低，能够有效、快速鉴别新冠病毒感染和甲型、乙型流感病毒引起的呼吸道感染。
本申请第二方面提供的一种检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物。该试剂盒采用所述的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物的同时对新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒进行检测，检测灵敏度高、重复性好、假阴性及假阳性低，能够有效鉴别新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒，从而实现对患者的精准诊断及后续的精准治疗，为临床一线快速鉴别新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒提供精准检测，利于选择合理的治疗方案，具有重要的应用价值。
本申请第三方面提供的一种利用所述的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒进行检测的方法，该检测方法可依靠一份样本进行一次检测即可鉴别3种病毒的感染情况，检测时间1.5小时，相比于一个样本进行多次检测，提高了检测效率；并且能够有效鉴别新冠病毒感染和普通病毒性感冒引起的呼吸道感染，克服现有关于新冠病毒和流感病毒等其他呼吸道病毒区别检测诊断技术的不足，从而实现对患者的精准诊断及后续的精准治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的阳性质控品扩增曲线图。
图2是本申请实施例提供的阴性质控品扩增曲线图。
图3是本申请实施例提供的新型冠状病毒2019-nCoV样本的扩增曲线。
图4是本申请实施例提供的甲型流感病毒样本的扩增曲线。
图5是本申请实施例提供的乙型流感病毒样本的扩增曲线。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B 的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个) 或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b, 和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请实施例第一方面提供一种检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物，组合物包括：
用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的第一上游引物SEQ ID No.1、第一下游引物SEQ ID No.2和第一探针序列SEQ ID No.3；
用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的第二上游引物SEQ ID No.4、第二下游引物SEQ ID No.5和第二探针序列SEQ ID No.6；
用于检测甲型流感病毒的第三上游引物SEQ ID No.7、第三下游引物SEQ ID No.8和第三探针序列SEQ ID No.9；
用于检测乙型流感病毒的第四上游引物SEQ ID No.10、第四下游引物SEQ IDNo.11和第四探针序列SEQ ID No.12。
本申请第一方面提供组合物包括用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的两对不同的特异性引物和两对不同的探针序列，用于检测甲型流感病毒的一对特异性引物和探针序列，用于检测乙型流感病毒的一对特异性引物和探针序列，可同时检测并快速分辨出三种不同的病毒，检测速率较高、灵敏度高、重复性好、假阴性及假阳性低，能够有效、快速鉴别新冠病毒感染和甲型、乙型流感病毒引起的呼吸道感染。
具体的，检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物包括用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的两对特异性引物，该两对特异性引物是根据2019-nCoV ORF1ab靶基因的特异性保守区序列进行设计得到的，两对特异性引物均以2019-nCoVORF1ab靶基因为检测靶标，且两个靶标区域相隔为2000bp以上，保证用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的两对特异性引物可以分别作用、不会相互干扰，采用双靶点的检测方法，可对ORF1ab基因同时进行“双重”检验，提供ORF1ab基因的双靶点检测可极大的降低单一靶点对变异病毒的漏检情况，从而提高对新冠病毒2019-nCoV的检测灵敏度。
优选的，以新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因为目的基因进行引物设计。在本发明优选实施例中，从NCBI上下载所有已知的新型冠状病毒2019-nCoV 的全基因组序列，使用Clone Manager软件进行序列比对，寻找各型别序列的特异性保守区、然后使用PrimerExpress 3.0软件设计新型冠状病毒2019-nCoV的 ORF1ab基因双靶标特异性引物序列及探针序列。
在一些实施例中，用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因包括第一上游引物SEQ ID No.1、第一下游引物SEQ ID No.2和第一探针序列SEQ ID No.3；其中，第一上游引物SEQ ID No.1的核苷酸序列如下： CTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTG；第一下游引物SEQ IDNo.2的核苷酸序列如下：TCAACAATTGTTTGAATAGTAGTTG；第一探针序列SEQ ID No.3 的核苷酸序列如下：FAM-TCACTGCCGTCTTGTTGACCAACA-BHQ1。
优选的，第一探针序列包括FAM荧光报告基团，根据第一上游引物序列和第一下游引物序列的特异性选择特定的荧光报告基团FAM，保证在反应过程中可对新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因进行区分，提高检测效率。
在一些实施例中，用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因包括第二上游引物SEQ ID No.4、第二下游引物SEQ ID No.5和第二探针序列SEQ ID No.6，其中，第二上游引物SEQ ID No.4的核苷酸序列如下： TAGCCAAGAAACCAACTGAAAC；第二下游引物SEQ ID No.5的核苷酸序列如下：TCTCCAATTAATGTGACTCCATTA；第二探针序列SEQ ID No.6的核苷酸序列如下：FAM-AGTGTTAAAGGTTTACAACCATCTGTAGGT-BHQ1。
优选的，第二探针序列包括FAM荧光报告基团，根据第二上游引物序列和第二下游引物序列的特异性选择特定的荧光报告基团FAM，保证在反应过程中可对新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因进行区分，提高检测效率。
具体的，检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物包括用于检测甲型流感病毒的引物序列和探针序列。
优选的，以甲型流感病毒M基因为目的基因进行引物设计。在本发明优选实施例中，从NCBI上下载所有已知的甲型流感病毒M基因的全基因组序列，使用Clone Manager软件进行序列比对，寻找序列的特异性保守区、然后使用 Primer Express 3.0软件设计甲型流感病毒M基因特异性引物序列及探针序列。
具体的，用于检测甲型流感病毒的引物序列和探针序列包括第三上游引物 SEQID No.7、第三下游引物SEQ ID No.8和第三探针序列SEQ ID No.9；其中，第三上游引物SEQID No.7的核苷酸序列如下： GACAAGACCRATCCTGTCACCT；第三下游引物SEQ ID No.8的核苷酸序列如下：TTTAGGGCATTYTGGACAAAKCG；第三探针序列SEQ ID No.9的核苷酸序列如下：ROX-TCCTCGCTCACTGGGCACGGTGAGCG-BHQ2。
优选的，第三探针序列包括ROX荧光报告基团，根据第三上游引物序列和第三下游引物序列的特异性选择特定的荧光报告基团ROX，保证在反应过程中可对甲型流感病毒进行区分，提高检测效率。
具体的，检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物包括用于检测乙型流感病毒的引物序列和探针序列。
优选的，以乙型流感病毒HA基因为目的基因进行引物设计。在本发明优选实施例中，从NCBI上下载所有已知的乙型流感病毒HA基因的全基因组序列，使用Clone Manager软件进行序列比对，寻找序列的特异性保守区、然后使用 Primer Express 3.0软件设计乙型流感病毒HA基因特异性引物序列及探针序列。
具体的，用于检测乙型流感病毒的引物序列和探针序列包括第四上游引物 SEQID No.10、第四下游引物SEQ ID No.11和第四探针序列SEQ ID No.12；其中，第四上游引物SEQ ID No.10的核苷酸序列如下： ATGAAAAATACGGTGGATTAAACAAAA；第四下游引物SEQ IDNo.11的核苷酸序列如下：GAAACCAGCAATGGCTCCGAA；第四探针序列SEQ ID No.12的核苷酸序列如下：CY5-GCCCAATATGGGTGAAAACACCCTTG-BHQ2。
优选的，第四探针序列包括CY5荧光报告基团，根据第四上游引物序列和第四下游引物序列的特异性选择特定的荧光报告基团CY5，保证在反应过程中可对乙型流感病毒进行区分，提高检测效率。
优选的，检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物还包括用于监控的内参基因β-actin的第五上游引物SEQ ID No.13、第五下游引物SEQ ID No.14和第五探针序列SEQ ID No.15，内参基因β-actin是针对人源保守基因设计的引物探针，可以用于监控整个扩增体系是否进行正常扩增，同时还可用于药检测样本的采集、核酸提取等方面。
优选的，第五上游引物SEQ ID No.13的核苷酸序列如下：TTCTACAATGAGCTGCGTGT；第五下游引物SEQ ID No.14的核苷酸序列如下： GGGTGTTGAAGGTCTCAAA；第五探针序列SEQID No.15的核苷酸序列如下： VIC-CCCTGAACCCCAAGGCCAACC-BHQ1。
优选的，第五探针序列包括VIC荧光报告基团，根据第五上游引物序列和第五下游引物序列的特异性选择特定的荧光报告基团VIC，保证在反应过程中可对内参基因β-actin进行区分，提高检测效率。
本申请实施例第二方面提供一种检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒，试剂盒包括的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物。
试剂盒包括的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物，能够对新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒同时进行检测，检测灵敏度高、重复性好、假阴性及假阳性低，能够有效鉴别新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒，从而实现对患者的精准诊断及后续的精准治疗，为临床一线快速鉴别新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒提供精准检测，利于选择合理的治疗方案，具有重要的应用价值。
优选的，试剂盒包括的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物，组合物包括：用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的第一上游引物SEQ IDNo.1、第一下游引物SEQ ID No.2和第一探针序列SEQ ID No.3。优选的，第一上游引物SEQID No.1的使用浓度为0.10μM、第一下游引物SEQ ID No.2的使用浓度为0.10μM和第一探针序列SEQ ID No.3的使用浓度为0.05 μM。进一步优选的，第一上游引物SEQ ID No.1的添加量为0.06μL、第一下游引物SEQ ID No.2的添加量为0.06μL和第一探针序列SEQ ID No.3的添加量为 0.06μL。第一上游引物和第一下游引物进行扩增的序列片段的长度为109bp，同时结合第一上游引物序列和第一下游引物序列中四种不同碱基的个数，准确控制第一上游引物、第一下游引物及第一探针序列的使用浓度及添加量，保证进行四重荧光反应的过程中，能够完整扩增得到序列片段长度为109bp的新冠病毒 2019-nCoV ORF1ab靶基因序列，特异性良好，减少非特异性扩增。
优选的，试剂盒包括的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物，组合物包括：用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的第二上游引物SEQ IDNo.4、第二下游引物SEQ ID No.5和第二探针序列SEQ ID No.6。优选的，第二上游引物SEQID No.4的使用浓度为0.12μM、第二下游引物SEQ ID No.5的使用浓度为0.12μM和第二探针序列SEQ ID No.6的使用浓度为0.05 μM。进一步优选的，第二上游引物SEQ ID No.4的添加量为0.07μL、第二下游引物SEQ ID No.5的添加量为0.07μL和第二探针序列SEQ ID No.6的添加量为 0.07μL。第二上游引物和第二下游引物进行扩增的序列片段的长度为190bp，同时结合第二上游引物序列和第二下游引物序列中四种不同碱基的个数，随着扩增的序列片段的碱基数较多，采用的第二上游引物、第二下游引物和第二探针序列的浓度及添加量较高，保证能够准确扩增得到碱基数为190bp的新冠病毒 2019-nCoV ORF1ab靶基因序列片段，若引物及探针的浓度过低或添加量较少，则难以在相同的反应程序内扩增得到碱基数为190bp的新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因序列片段，提高了反应的准确性，确保扩增性能最佳。
优选的，试剂盒包括的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物，组合物包括：用于检测甲型流感病毒的第三上游引物SEQ ID No.7、第三下游引物SEQID No.8和第三探针序列SEQ ID No.9。优选的，第三上游引物SEQ ID No.7的使用浓度为0.20μM、第三下游引物SEQ ID No.8的使用浓度为0.20μM和第三探针序列SEQ ID No.9的使用浓度为0.10μM。进一步优选的，第三上游引物SEQ ID No.7的添加量为0.12μL、第三下游引物SEQ ID No.8的添加量为0.12μL和第三探针序列SEQ ID No.9的添加量为0.12μL。控制第三上游引物、第三下游引物和第三探针序列的使用浓度和添加量，进一步保证在四重荧光反应的过程中，对甲型流感病毒的靶点序列扩增完整、准确，扩增性能较好，能够同时进行荧光分析，提高了检测的特异性。优选的，试剂盒包括的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物，组合物包括：用于检测乙型流感病毒的第四上游引物SEQ IDNo.10、第四下游引物SEQ ID No.11和第四探针序列SEQ ID No.12。优选的，第四上游引物SEQ ID No.10的使用浓度为0.40 μM、第四下游引物SEQ ID No.11的使用浓度为0.40μM和第四探针序列SEQ ID No.12的使用浓度为0.20μM。进一步优选的，第四上游引物SEQ IDNo.10的添加量为0.24μL、第四下游引物SEQ ID No.11的添加量为0.24μL和第四探针序列SEQ ID No.12的添加量为0.24μL。控制第四上游引物、第四下游引物和第四探针序列的使用浓度和添加量，进一步保证在四重荧光反应的过程中，对乙型流感病毒的靶点序列扩增完整、准确，扩增性能较好，能够同时进行荧光分析，提高了检测的特异性。
优选的，试剂盒包括的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物，组合物包括：用于监控的内参基因β-actin的第五上游引物SEQ ID No.13、第五下游引物SEQ ID No.14和第五探针序列SEQ ID No.15。优选的，第五上游引物SEQ ID No.13的使用浓度为0.08μM、第五下游引物SEQ ID No.14 的使用浓度为0.08μM和第五探针序列SEQID No.15的使用浓度为0.12μM。进一步优选的，第五上游引物SEQ ID No.13的添加量为0.05μL、第五下游引物 SEQ ID No.14的添加量为0.05μL和第五探针序列SEQ ID No.15的添加量为0.14 μL。扩增内参基因目的是为了监控整个扩增体系是否正常扩增，根据扩增的内参基因的长度，进一步保证四重荧光反应各靶点序列扩增效果较好，提高检测灵敏度。
优选的，试剂盒还包括如下试剂：RT-qPCR反应液，RT-PCR酶，阳性质控品，阴性质控品。
优选的，RT-qPCR反应液包括如下组分：Tris-HCl溶液、(NH4)2SO4溶液、 KCl溶液、DTT溶液、MgCl2溶液、脱氧核糖核苷三磷酸溶液。其中，RT-qPCR 反应液包括(NH4)2SO4，能够提供NH4 +，NH4 +在高温条件下可以生成NH3和H+， NH3有生成氢键的条件，可以破坏非特异退火的引物和模板间的不稳定氢键，提高了退火的特异性。进一步的，RT-qPCR反应液还包括DTT溶液，DTT溶液是还原剂，可延缓蛋白质的氧化，保护反应液中酶的不饱和二硫键，从而防止延缓酶的失活，进一步保护热启动Taq DNA聚合酶和逆转录酶的活性。
优选的，在RT-qPCR反应液中，Tris-HCl溶液的物质的量浓度为100～110 mmol/L，且Tris-HCl溶液的pH值为8.35～8.4；(NH4)2SO4溶液的物质的量浓度为20～25mmol/L；KCl溶液的物质的量浓度为50～55mmol/L；DTT溶液的物质的量浓度为2～4mmol/L；MgCl2溶液的物质的量浓度为3～4mmol/L；脱氧核糖核苷三磷酸溶液的物质的量浓度为0.4～0.6mmol/L。由于本实施例提供的是单管四重反应体系，单管的反应重数越多，其引物探针间的干扰就越大，对RT-qPCR 反应液的要求就更高，因此，在现有组分上，保证各组分的添加浓度如上，确保反应过程较佳，提高扩增性能。在本发明优选实施例中，RT-qPCR反应液中， Tris-HCl溶液的物质的量浓度为110mmol/L，且Tris-HCl溶液的pH值为8.35； (NH4)2SO4溶液的物质的量浓度为20mmol/L；KCl溶液的物质的量浓度为50 mmol/L；DTT溶液的物质的量浓度为2mmol/L；MgCl2溶液的物质的量浓度为 3mmol/L；脱氧核糖核苷三磷酸溶液的物质的量浓度为0.4mmol/L。在本发明优选实施例中，RT-qPCR反应液的添加量为15μL。由于本申请是四重反应体系，单管的反应重数越多，其引物探针间的干扰就越大，对反应液的要求就更高，因此，保证反应液各组分的浓度如上所述，确保各引物的扩增性能最佳。
优选的，RT-PCR酶还包括：RNA酶抑制剂、热启动Taq DNA聚合酶和逆转录酶。进一步优选的，RNA酶抑制剂选自焦碳酸二乙酯(DEPC)、异硫氰酸胍、氧钒核糖核苷复合物、RNA酶的蛋白质抑制剂(RNasin)的至少一种。在本发明优选实施例中，RNA酶抑制剂选自RNA酶的蛋白质抑制剂的混合物，且 RNA酶与蛋白质抑制剂的质量比为1:1。
进一步优选的，热启动Taq DNA聚合酶的添加量为5U/人份，逆转录酶的添加量为8U/人份。在本发明优选实施例中，RT-PCR酶的添加量为1.5μL。
优选的，阳性质控品为含有新型冠状病毒2019-nCoV、甲型流感病毒、乙型流感病毒和内参目的基因片段的合成质粒混合物。进一步优选的，采用病毒RNA 提取试剂盒QIAamp Viral RNA Kit，按照试剂说明书进行样本核酸提取。在本发明优选实施例中，阳性质控品的添加量为10μL。
优选的，阴性质控品为DEPC水。DEPC水是用焦碳酸二乙酯处理过并经高温高压灭菌的纯水，无色液体。经检测不含杂质RNA、DNA和蛋白质。优选的，当阴性质控品为DEPC水，DEPC水的添加量为10μL。
第三方面，本发明实施例还提供了一种利用上述检测新冠病毒2019-nCoV 以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒进行检测的方法，该方法包括如下步骤：
S01.获取含有新型冠状病毒2019-nCoV、甲型流感病毒、乙型流感病毒和内参目的基因的RNA提取物作为待测样品；
S02.依据所述试剂盒提供的RT-qPCR反应液、RT-PCR酶、阳性质控品、阴性质控品、检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物以及所述待测样品，配制反应混合液；
S03.将所述反应混合液进行荧光PCR扩增反应，根据荧光曲线判断分析检测结果。
本检测方法除了检测溶于人体样本之外，还可以用于检测脱离人体的样本，如用于待输血的血液、待检测的食品或者其他代用的物品等。
在步骤S01中，优选的，质粒混合物采用病毒RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNAKit，德国Qiagen公司产品，按照试剂说明书进行样本核酸提取得到。
在步骤S02中，RT-qPCR反应液、RT-PCR酶、阳性质控品、阴性质控品、检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物的选择种类及添加量如上文所示，此处不再进行赘述。
优选的，配制得到的反应混合物为30μL反应体系，具体配制体系如下表1 所示，
表1
Figure RE-GDA0002616586830000121
Figure RE-GDA0002616586830000131
在上述步骤S03中，将所述反应混合液进行荧光PCR扩增反应，优选的，设置反应程序，其中，荧光信号设置为：荧光报告基团为：FAM、VIC、ROX、 CY5通道，Passive Reference：NONE；荧光PCR扩增，设置反应总体积为30μL，荧光PCR扩增程序的设置如下表2，
表2
Figure RE-GDA0002616586830000132
进一步的，根据荧光曲线判断分析检测结果。优选的，PCR扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染相应病毒。仅当阳性质控品在四个荧光通道中信号均成阳性，阴性质控品在四个荧光通道中均成阴性时，待检标本的检测结果才有效，对结果进行判读分析如下：
(1)在满足扩增有效的前提下，FAM通道检测新型冠状病毒2019-nCoV ORF1ab基因，判定依据如下：
阳性：如果待测样本FAM通道扩增曲线呈S型曲线，且Ct≤38，则判定为阳性。
可疑：如果待测样本FAM检测通道38＜Ct≤40，且扩增曲线呈S型曲线，需重新检测。如果重新检测FAM通道Ct≤40且仍有S型曲线，则判定为阳性；若重新检测FAM通道Ct＝40或无Ct，同时内参(VIC)检测通道Ct≤35且扩增曲线呈S型曲线，则判定为阴性。
阴性：如果待测样本FAM检测通道Ct＝40或无Ct值；内参(VIC)检测通道Ct≤35且扩增曲线呈S型曲线，则判定为阴性。
重测：如果待测样本FAM检测通Ct＝40或无Ct；内参(VIC)检测通道Ct>35 或无Ct时，需重新检测。
(2)在满足扩增有效的前提下，ROX通道检测甲型流感病毒M基因，判定依据如下：
阳性：如果待测样本ROX通道扩增曲线呈S型曲线，且Ct≤38，则判定为阳性。
可疑：如果待测样本ROX检测通道38＜Ct≤40，且扩增曲线呈S型曲线，需重新检测。如果重新检测ROX通道Ct≤40且仍有S型曲线，则判定为阳性；若重新检测ROX通道Ct＝40或无Ct，同时内参(VIC)检测通道Ct≤35且扩增曲线呈S型曲线，则判定为阴性。
阴性：如果待测样本ROX检测通道Ct＝40或无Ct；内参(VIC)检测通道 Ct≤35且扩增曲线呈S型曲线，则判定为阴性。
重测：如果待测样本ROX检测通道Ct＝40或无Ct；内参(VIC)检测通道 Ct>35或无Ct时，需重新检测。
(3)在满足扩增有效的前提下，CY5通道检测乙型流感病毒HA基因，判定依据如下：
阳性：如果待测样本CY5通道扩增曲线呈S型曲线，且Ct≤38，则判定为阳性。
可疑：如果待测样本CY5检测通道38＜Ct≤40，且扩增曲线呈S型曲线，需重新检测。如果重新检测CY5通道Ct≤40且仍有S型曲线，则判定为阳性；若重新检测CY5通道Ct＝40或无Ct，同时内参(VIC)检测通道Ct≤35且扩增曲线呈S型曲线，则判定为阴性。
阴性：如果待测样本CY5检测通道Ct＝40或无Ct；内参(VIC)检测通道 Ct≤35且扩增曲线呈S型曲线，则判定为阴性。
重测：如果待测样本CY5检测通道Ct＝40或无Ct；内参(VIC)检测通道 Ct>35或无Ct时，需重新检测。
上述方法是利用检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒进行检测的方法，基于四重荧光PCR技术，对样本进行新冠病毒2019-nCoV 以及甲型、乙型流感病毒，试剂盒设有内参，以人β-actin基因作为内参基因，内参探针用VIC标记、可有效监测采样和检测体系，检测时间1.5小时，检测灵敏度高、重复性好、假阴性及假阳性低。
本发明与现有技术相比优点为：(1)一份样本一次检测即可鉴别3种病毒的感染情况，检测时间1.5小时，相比于一个样本进行多次检测，提高了检测效率；并且能够有效鉴别新冠病毒感染和普通病毒性感冒引起的呼吸道感染，克服现有关于新冠病毒和流感病毒等其他呼吸道病毒区别检测诊断技术的不足；(2) 同时针对新冠病毒核酸变异性高的特点，通过双靶位点的设计可极大的降低单一靶点对变异病毒的漏检情况，从而实现对患者的精准诊断及后续的精准治疗。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
利用检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒进行检测，包括如下步骤：
S01.收集新型冠状病毒2019-nCoV、甲型流感病毒、乙型流感病毒样本各10株，人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)、呼吸道合胞病毒A、B 型，副流感病毒1、2、3型各2株，SARS冠状病毒和MERS冠状病毒假病毒各 1株；采用病毒RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNAKit方法对样本进行核酸提取得到含有新型冠状病毒2019-nCoV、甲型流感病毒、乙型流感病毒和内参目的基因的RNA提取物作为待测样品；
S02.获取检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物；组合物包括：
用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的第一上游引物SEQ ID No.1、第一下游引物SEQ ID No.2和第一探针序列SEQ ID No.3；
用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的第二上游引物SEQ ID No.4、第二下游引物SEQ ID No.5和第二探针序列SEQ ID No.6；
用于检测甲型流感病毒的第三上游引物SEQ ID No.7、第三下游引物SEQ ID No.8和第三探针序列SEQ ID No.9；
用于检测乙型流感病毒的第四上游引物SEQ ID No.10、第四下游引物SEQ IDNo.11和第四探针序列SEQ ID No.12；
用于监控的内参基因β-actin的第五上游引物SEQ ID No.13、第五下游引物 SEQID No.14和第五探针序列SEQ ID No.15。
S03.依据检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒提供的RT-qPCR反应液、RT-PCR酶、阳性质控品、阴性质控品、检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物、待测样品，配制30μL反应体系 (如下表1)；
表1
Figure RE-GDA0002616586830000161
Figure RE-GDA0002616586830000171
S04.设置反应程序，其中，荧光信号设置为：荧光报告基团为：FAM、VIC、 ROX、CY5通道，Passive Reference：NONE；荧光PCR扩增，设置反应总体积为30μL，荧光PCR扩增程序的设置如下表2；
表2
Figure RE-GDA0002616586830000172
S05.PCR扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染相应病毒。仅当阳性质控品在四个荧光通道中信号均成阳性，阴性质控品在四个荧光通道中均成阴性时，待检标本的检测结果才有效。
结果分析：
(1)阳性样本验证
通过对新型冠状病毒2019-nCoV、甲型流感病毒、乙型流感病毒样本核酸进行检测，结果目标病原体检测均为阳性，阳性样本检出率100％。
样本验证如附图1～附图5，其中，附图1为阳性质控品的扩增曲线，图2 为阴性质控品的扩增曲线，图3为新型冠状病毒2019-nCoV样本的扩增曲线，图4为甲型流感病毒样本的扩增曲线，图5为乙型流感病毒样本的扩增曲线。
(2)特异性验证
通过特异性实验检测组样本的系统检测，目标病原体检测均为阳性，其余 11种非目标病原体检测均为阴性，结果表明该方法具有良好的特异性，特异性为100％。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市联合医学科技有限公司
<120> 检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物及应用
<130> 2020/05/22
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ctgaagaaga gcaagaagaa gattg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tcaacaattg tttgaatagt agttg 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tcactgccgt cttgttgacc aaca 24
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tagccaagaa accaactgaa ac 22
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tctccaatta atgtgactcc atta 24
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
agtgttaaag gtttacaacc atctgtaggt 30
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gacaagaccr atcctgtcac ct 22
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<212> DNA
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<400> 8
tttagggcat tytggacaaa kcg 23
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<212> DNA
<213> 人工合成
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tcctcgctca ctgggcacgg tgagcg 26
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<212> DNA
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<400> 10
atgaaaaata cggtggatta aacaaaa 27
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<212> DNA
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<400> 11
gaaaccagca atggctccga a 21
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<212> DNA
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gcccaatatg ggtgaaaaca cccttg 26
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<212> DNA
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
ccctgaaccc caaggccaac c 21

Claims (10)

1.一种检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物，其特征在于，所述组合物包括：
用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的第一上游引物SEQ ID No.1、第一下游引物SEQ ID No.2和第一探针序列SEQ ID No.3；
用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab靶基因的第二上游引物SEQ ID No.4、第二下游引物SEQ ID No.5和第二探针序列SEQ ID No.6；
用于检测甲型流感病毒的第三上游引物SEQ ID No.7、第三下游引物SEQ ID No.8和第三探针序列SEQ ID No.9；
用于检测乙型流感病毒的第四上游引物SEQ ID No.10、第四下游引物SEQ ID No.11和第四探针序列SEQ ID No.12。
2.根据权利要求1所述的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物，其特征在于，
所述组合物还包括用于监控的内参基因β-actin的第五上游引物SEQ ID No.13、第五下游引物SEQ ID No.14和第五探针序列SEQ ID No.15。
3.根据权利要求2所述的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物，其特征在于，
所述第一探针序列包括FAM荧光报告基团；和/或，
所述第二探针序列包括FAM荧光报告基团；和/或，
所述第三探针序列包括ROX荧光报告基团；和/或，
所述第四探针序列包括CY5荧光报告基团；和/或，
所述第五探针序列包括VIC荧光报告基团。
4.一种检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一所述的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物。
5.根据权利要求4所述的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下试剂：RT-qPCR反应液，RT-PCR酶，阳性质控品，阴性质控品。
6.根据权利要求5所述的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述RT-qPCR反应液包括如下组分：Tris-HCl溶液、(NH4)2SO4溶液、KCl溶液、DTT溶液、MgCl2溶液、脱氧核糖核苷三磷酸溶液。
7.根据权利要求6所述的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，在所述RT-qPCR反应液中，
所述Tris-HCl溶液的物质的量浓度为100～110mmol/L；和/或，
所述(NH4)2SO4溶液的物质的量浓度为20～25mmol/L，和/或；
所述KCl溶液的物质的量浓度为50～55mmol/L，和/或；
所述DTT溶液的物质的量浓度为2～4mmol/L，和/或；
所述MgCl2溶液的物质的量浓度为3～4mmol/L，和/或；
所述脱氧核糖核苷三磷酸溶液的物质的量浓度为0.4～0.6mmol/L。
8.根据权利要求5所述的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR酶包括：RNA酶抑制剂、热启动Taq DNA聚合酶和逆转录酶。
9.根据权利要求4～8任一所述的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，
所述第一上游引物SEQ ID No.1的使用浓度为0.10μM、所述第一下游引物SEQ ID No.2的使用浓度为0.10μM和所述第一探针序列SEQ ID No.3的使用浓度为0.05μM；和/或，
所述第二上游引物SEQ ID No.4的使用浓度为0.12μM、所述第二下游引物SEQ ID No.5的使用浓度为0.12μM和所述第二探针序列SEQ ID No.6的使用浓度为0.05μM；和/或，
所述第三上游引物SEQ ID No.7的使用浓度为0.20μM、所述第三下游引物SEQ ID No.8的使用浓度为0.20μM和所述第三探针序列SEQ ID No.9的使用浓度为0.10μM；和/或，
所述第四上游引物SEQ ID No.10的使用浓度为0.40μM、所述第四下游引物SEQ IDNo.11的使用浓度为0.40μM和所述第四探针序列SEQ ID No.12的使用浓度为0.20μM；和/或，
所述第五上游引物SEQ ID No.13的使用浓度为0.08μM、所述第五下游引物SEQ IDNo.14的使用浓度为0.08μM和所述第五探针序列SEQ ID No.15的使用浓度为0.12μM。
10.一种利用权利要求4～9任一所述的检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的试剂盒进行检测的方法，该方法包括如下步骤：
获取含有新型冠状病毒2019-nCoV、甲型流感病毒、乙型流感病毒和内参目的基因的RNA提取物作为待测样品；
依据所述试剂盒提供的RT-qPCR反应液、RT-PCR酶、阳性质控品、阴性质控品、检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物以及所述待测样品，配制反应混合液；
将所述反应混合液进行荧光PCR扩增反应，根据荧光曲线判断分析检测结果。
CN202010450960.3A 2020-05-25 2020-05-25 检测新冠病毒2019-nCoV以及甲型、乙型流感病毒的组合物及应用 Pending CN111719016A (zh)

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