CN111534514A - 一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒 - Google Patents

一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于Crisper的新型冠状病毒检测试剂盒，所述crRNA包括：靶向C端部分序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.3‑4中任一所示；靶向N端部分序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.5‑6中任一所示。本发明涉及与新型冠状病毒C端部分序列和N端部分序列相关的crRNA，运用此crRNA结合CRISPR‑LwaCas13a系统进行突变检测的方法，此方法具有成本低、可多次重复检测、方法简单、不依赖专门的荧光定量PCR仪、检测速度快、灵敏度高(最低检测极限达到10‑2拷贝/uL)、特异性强，可在短时间内通过荧光信号的变化检测到是否含有目标核酸。

Description

一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒。
背景技术
目前市面上大多采用RT-PCR方法的检测试剂盒，该检测试剂盒所需时间较长、对特殊设备的依赖程度较高、特异性不够且灵敏度不够出现假阴性等情况。因此，急需开发一种快速，特异性强，灵敏度高的病毒学检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种新型冠状病毒的检测试剂盒，特异性强，灵敏度高，最低检测极限达到10-2拷贝/uL以下。
本发明是这样实现的：
本发明的目的之一在于提供一种用于检测新型冠状病毒的crRNA，所述 crRNA包括：
靶向C端部分序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.3-4中任一所示；
靶向N端部分序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.5-6中任一所示。
本发明的目的之二在于提供一种新型冠状病毒的检测试剂盒，含有所述crRNA。
优选地，所述试剂盒还包括LwaCas13a蛋白和荧光探针。
优选地，所述分子信标可以采用购买于赛默飞的通用分子信标，所述荧光探针选用的序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团。所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、Bio/BHQ-1、BHQ-2和 BHQ-3中的一种。具体地，所述分子信标可以为5'-/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/-3'，该荧光探针的序列的5’端标记选用FAM基团，3’端标记选用Bio基团。
优选地，所述试剂盒还包括RNase抑制剂、T7聚合酶、核糖核酸溶液、氯化镁溶液。
优选地，所述新冠病毒检测试剂盒还可包括扩增体系，所述扩增体系包括等温扩增引物对，其中C端部分序列的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.7-8 所示；N端部分序列的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.9-10所示。
所述扩增体系还包括逆转录酶(单链变双链)，引物、重组酶，DNA聚合酶，ssDNA结合蛋白等，RAP相关试剂需要magnesium acetate，2mM DTT， 5％Carbowax20M，200lMdNTPs，3mM ATP，50mM phosphocreatine，100 ng/ll creatine kinase等：以上组分可直接采用重组酶聚合酶扩增(RPA)试剂盒
Figure BDA0002405179000000021
Basic；TABAS03KIT。
优选地，所述检测试剂盒可以制备成试纸条形式的检测试剂盒或液体形式的试剂盒。
本发明的目的之三在于提供所述的crRNA、以及所述的试剂盒在用于检测新型冠状病毒上的用途。所述检测试剂盒的使用方法为：
S1、核酸提取，采用现有的技术或者产品对样本中的病毒核酸进行提取；
S2、病毒RNA逆转录及RPA等温扩增体系扩增得到所需DNA扩增产物；
S3、将所述的扩增产物、crRNA、LwaCas13a蛋白、荧光探针、RNase抑制剂、T7聚合酶、核糖核酸溶液、氯化镁溶液构成的检测体系(如表5和表6 所示)进行检测。
优选地，将所述检测体系孵育后荧光检测仪测定荧光值。也可以做成便携式检测仪比如胶体金检测试剂盒可以随时随地及时检测，这些应用和方法为后续试剂盒的开发，临床诊断的应用提供了平台，适用于大规模临床样本检测。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
本发明提供的用于检测新型冠状病毒的crRNA、试剂盒及检测方法，设计与新型冠状病毒C端部分序列和N端部分序列相关的crRNA，运用此crRNA 结合CRISPR-LwaCas13a系统进行突变检测的方法，此方法具有成本低、可多次重复检测、方法简单、检测速度快、灵敏(最低检测极限达到10-2拷贝/uL)、特异，可在短时间内通过荧光信号的变化检测到是否含有目标核酸：
在对新型冠状病毒C端部分序列的检测中，反应进行到20-30分钟时，阳性样本的荧光信号明显高于阴性样本，灵敏度可达到10-2拷贝/uL。
在对新型冠状病毒N端部分序列的检测中，反应进行到20-30分钟时，阳性样本的荧光信号明显高于阴性样本，灵敏度可达到10-2拷贝/uL。
附图说明
图1为特异性检测结果；
图2为灵敏性结果。
具体实施方式
实施例1靶向病毒特异位点crRNA的设计及获得
1、基于CRISPR-LwaCas13a系统的新型冠状病毒检测位点的发现
本发明人根据CDC最新出具的《RT-PCR检测指南》，获得新型冠状病毒特异性区域。针对这些不同区域设计crRNA并构建CRISPR/LwaCas13a系统进行研究。结果表明，以SEQ IDNO.1-2所示区域序列为基于CRISPR/LwaCas13a 系统的检测位点，具有很好的检测效果。
表1
Figure BDA0002405179000000041
2、靶向特异性区域crRNA的设计
由于CRISPR-Cas13a系统是一种靶向DNA基因编辑系统，其中Cas13a与 crRNA结合形成监测复合物，所述crRNA设计要求：crRNA包括蛋白锚定序列和向导序列，序列格式为：5`-与Cas13a蛋白结合的锚定序列-crRNA向导序列-3`，向导序列则与靶向DNA中的片段匹配。
本发明人发现针对上述两个靶标涉及如下的CrRNA具有很好的检测效果。
靶向C端部分序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.3-4中任一所示。
靶向N端部分序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.5-6中任一所示。
表2
Figure BDA0002405179000000042
实施例2新型冠状病毒的检测试剂盒及检测方法
1、新冠病毒检测试剂盒的组成
本试剂盒包括：
(1)靶向C端部分序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.3-4中任一所示。
(2)靶向N端部分序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.5-6中任一所示。
(3)一条特异性荧光探针(采用购买于赛默飞公司的通用分子信标比如 5'-/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/-3')；
(4)LwaCas13a蛋白；
(5)RNase抑制剂、T7聚合酶、核糖核酸溶液和氯化镁溶液。
优选地，为了做出高敏，高特异性检测微量2019-nCov病毒，需要预扩增病毒的核酸，提高丰度，因此优选采用RPA扩增方法，所述新冠病毒检测试剂盒还可包括扩增体系，所述扩增体系包括等温扩增引物对，其中C端部分序列的等温扩增引物对序列如SEQ IDNO.7-8所示；N端部分序列的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.9-10所示。所述扩增体系还包括逆转录酶(单链变双链)，引物、重组酶，DNA聚合酶，ssDNA结合蛋白等，RAP相关试剂需要magnesium acetate，2mM DTT，5％Carbowax20M，200lM dNTPs，3mM ATP，50mMphosphocreatine，100ng/ll creatine kinase等。
需要说明的是，所述扩增体系的RPA引物由本发明人设计，并于赛默飞公司合成得到；扩增体系所需的其他组分采用购买逆转录等温扩增试剂盒
Figure BDA0002405179000000051
Basic；TABAS03KIT。
3、新型冠状病毒的检测方法
采用现有的技术或者产品对样本中的病毒核酸进行提取，作为样本的 RNA。
(一)步骤1：病毒RNA逆转录及RPA等温扩增体系扩增得到所需DNA 扩增产物得到DNA目的片段。
为了测试每个样品，设置两个RPA反应，分别检测C端部分序列靶标和N 端部分序列靶标。同时使用合成病毒片段建立C端部分序列和N端部分序列的阳性对照。还应建立不添加测试样品的阴性对照。
(1)对于C端部分序列的靶标，设置每个反应，取待测样本的RNA，加入逆转录等温扩增体系中。扩增体系如表3所示，重组酶聚合酶扩增(RPA) 试剂盒(
Figure BDA0002405179000000061
Basic；TABAS03KIT)；
Figure BDA0002405179000000062
II逆转录酶(M0368L)。
表3
Figure BDA0002405179000000063
(2)对于N端部分序列的靶标，设置如下反应：
表4
Figure BDA0002405179000000064
上述表3和表4的体系充分混合后，在预热的水浴中于42℃孵育25分钟。孵育结束后，立即将EP管放回冰上，用于进行下一步的反应。
(二)步骤2、使用Cas13检测病毒RNA序列
将步骤“T7转录酶体外转录步骤1扩增得到的DNA目的片段生成RNA”与步骤“crRNA引物和分子信标检测体系”所需的组分一起混匀；即将步骤1 得到的表3的扩增产物与T7转录酶、crRNA、LwaCas13a蛋白、荧光探针一起制成检测体系。取一份LwaCas13a储备蛋白的等分试样(2mg/mL，4ul)，使用122.5uL的存储缓冲液重悬；对于靶向C端部分序列按以下步骤建立Cas13 检测反应，如表5所示。
表5
Figure BDA0002405179000000071
对于靶向N端部分序列对于靶向C端部分序列按以下步骤建立Cas13检测反应，如表6所示。
表6
Figure BDA0002405179000000072
Figure BDA0002405179000000081
将表5的检测体系和表6的检测体系分别涡旋充分混合，并使用台式离心机离心，接下来在预热的37℃水浴锅中于孵育30分钟。孵育后，将反应管放回冰上。同时设立空白对照组。
步骤3、使用荧光定量PCR仪或荧光分光光度计(λex:485nm；λem:535 nm)检测仪测定荧光值，完成对荧光信号的激发和收集过程。反应结束后统计分析荧光值变化情况。与空白对照组相比，待检测样本的随着时间的延长荧光值不断增加，表明存在新冠病毒。
对比例1对照试验方法
1、采用实时荧光RT-PCR的方法，选用针对新型冠状病毒的核壳蛋白(nucleoprotein，N)基因区域的引物和探针。
正向引物(F)：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；
反向引物(R)：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；
荧光探针(P)：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'可以核酸提取和实时荧光RT-PCR反应体系参考相关厂家试剂盒说明。
3、结果判断
阴性：无Ct值或Ct为40。
阳性：Ct值<37，可报告为阳性。
可疑：Ct值在37-40之间，建议重复实验，若重做结果Ct值<40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
试验例1检测试剂盒的特异性
交叉反应实验，确定两种方法检测结果的特异性。采用本发明的反应体系和对照实验例分别对带有特定N基因的各冠状病毒阳性质粒进行检测，判断交叉反应的结果，具体涉及人类冠状病毒(HKU1)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒。
检测结果如下图1所示，由图1可知，采用对照的方法学，反应体系会导致SARS检测结果的假阳性，一定程度的干扰医生的误判，影响后续的疾病治疗方案的制定。
试验例2检测试剂盒的灵敏性试验
本发明与对照实验检测限的比较：采用本发明的方法与对照实验方法分别对构建好的带有新型冠状病毒N基因的阳性质粒进行检测，并判断两种方法学的检测限，为了确定本方法的最小检出量，将合成的质粒标准品稀释成105、103、 102、101拷贝/μL等4个浓度梯度后作为模板进行检测，结果如图2和表7所示。
表7
Figure BDA0002405179000000091
结果可知，在同样的检测条件，本发明的检测荧光信号高于对照实验，且在10-2稀释条件下，仍然能检测到荧光信号，说明本方法的检测下限更低，可以对单拷贝的基因实现很好的检测。表面本发明的检测试剂盒具有较广的检测范围，其最低检测限为10-2拷贝/μL。
应用例
用本发明的实验方法与对照实验方法分别用标本进行验证，以对本发明的检测效果做进一步的确认。实验选取经过CT以及临床确诊新冠病人的标本分别用两种方法进行检测，判断两种检测方法的检出率。实验还选取了50例正常标本分别用两种方法进行检测，判断方法的检测特异性。结果如表8所示。
表8
本发明实验方法 对照实验方法
检测灵敏度 100％ 83.33％
检测特异性 100％ 100％
由表8可知，灵敏性结果中，在选取的12例病例中，采用本发明的方法可以对12例病例全部进行识别并检出，而采用对照实验方法仅能检出10例，存在2例漏检的问题。特异性结果中，在选取的50例标本中，采用本发明的方法和对照实验方法阴性结果率为100％，说明联众检测方法均不存在假阳性的问题。
所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护。
序列表
<110> 宿迁市第一人民医院
<120> 一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 172
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcacaagtag atgtagttaa ctttaatctc acatagcaat ctttaatcag tgtgtaacat 60
tagggaggac ttgaaagagc caccacattt tcaccgaggc cacgcggagt acgatcgagt 120
gtacagtgaa caatgctagg gagagctgcc tatatggaag agccctaatg tg 172
<210> 2
<211> 164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caacagagcc taaaaaggac aaaaagaaga aggctgatga aactcaagcc ttaccgcaga 60
gacagaagaa acagcaaact gtgactcttc ttcctgctgc agatttggat gatttctcca 120
aacaattgca acaatccatg agcagtgctg actcaactca ggcc 164
<210> 3
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uaguuaacuu uaaucucaca 60
uagcaau 67
<210> 4
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guacgaucga guguacagug 60
aacaaug 67
<210> 5
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu gaugaaacuc aagccuuacc 60
gcagaga 67
<210> 6
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca ugauuucucc aaacaauugc 60
aacaauc 67
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcacaagtag atgtagttaa cttta 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cacattaggg ctcttccata taggc 25
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caacagagcc taaaaaggac aaaaag 26
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcctgagtt gagtcagcac tgctc 25

Claims (7)

1.一种用于检测新型冠状病毒的crRNA，其特征在于，所述crRNA包括：
靶向C端部分序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.3-4中任一所示；
靶向N端部分序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.5-6中任一所示。
2.一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括有权利要求1所述的crRNA。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括LwaCas13a蛋白和荧光探针。
4.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNase抑制剂、T7聚合酶、核糖核酸溶液、氯化镁溶液。
5.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括等温扩增引物对，其中C端部分序列的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.7-8所示；N端部分序列的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.9-10所示。
6.权利要求1所述的crRNA在用于检测新型冠状病毒上的用途。
7.权利要求2-5任一所述的试剂盒在用于检测新型冠状病毒上的用途。
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