CN110241264B - 一种乙型肝炎病毒(hbv)dna定量检测试剂盒 - Google Patents

一种乙型肝炎病毒(hbv)dna定量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检测试剂盒。本发明利用数字聚合酶链式反应(dPCR)技术对生物样本中HBV DNA进行定量检测，可用于监测乙型肝炎患者的HBV DNA基线水平和变化情况、评估抗病毒治疗的应答和治疗效果。

Description

一种乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检测试剂盒。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一种可导致病毒性肝炎的病原体。据世界卫生组织统计，全球约有20亿人有HBV感染史，其中2.4亿人患有慢性乙型肝炎；每年约65万人死于有慢性乙型肝炎导致的肝脏衰竭、肝硬化、肝细胞癌。全球30％的肝硬化和45％的肝细胞癌的病因是HBV感染；在中国，60％的肝硬化和80％的肝细胞癌的病因是HBV感染。
血清学检测通常作为HBV感染的诊断、治疗和预后评估的重要指标，如：HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe、anti-HBc和anti-HBc-免疫球蛋白M。但最直接、最可靠的病毒复制检测方法是血清或血浆HBV DNA定量测定。HBV DNA检测阳性提示HBV复制、有传染性，HBV DNA定量检测指标越高表示病毒复制越活跃、传染性越强。DNA定量检测和监测可帮助了解机体内病毒的数量、复制水平、传染性、药物治疗效果和制定治疗策略。作为评估指标，HBV DNA定量检测也是唯一能够帮助确诊隐匿性HBV感染的实验室检测指标。因此，HBV DNA定量检测是一种有着重要临床意义的技术手段，可与血清学检测联合应用于对HBV感染者的管理。
HBV DNA定量检测的常用方法是核酸扩增技术。目前有很多公司研发出通过实时荧光PCR(qPCR)定量检测血清或血浆中HBV病毒载量的试剂盒。受qPCR定量检测技术原理的限制，这一技术对核酸的定量检测依赖一组定量标准品的平行检测和比对。同时，qPCR定量检测低浓度样本时的准确性和精密度不高。另外，由于qPCR定量检测受到许多影响扩增效率的因素所影响，因而其准确性、一致性均不理想，检测结果难于标准化。这些影响扩增效率的因素包括：HBV DNA样本中的PCR抑制剂、用于扩增的PCR引物序列、HBV的基因型和变异株等。
数字PCR(dPCR)是一种绝对定量技术，其定量检测不依赖于定量标准品；同时，dPCR对PCR抑制剂的耐受性更高。此外，由于其定量检测对扩增效率的依赖性低，dPCR对HBV不同基因型和变异株的检测具有更高的准确性、一致性。因此，HBV DNA的dPCR定量检测是qPCR定量检测的技术升级，并在未来有希望替代HBV DNA的qPCR定量检测。目前商用试剂盒均为在qPCR仪上应用的产品，无法直接应用于数字PCR，因此，需要一种经优化的、适用于dPCR的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检测试剂盒，所述试剂盒在数字PCR法中使用。
具体地，本发明涉及如下内容：
1.一组用于特异性扩增乙型肝炎病毒(HBV)DNA的数字PCR(dPCR)引物，其特征在于，所述引物包括正向引物，其中所述正向引物包括：SEQ ID NO.:1和/或和SEQ ID NO.:2所示的引物。
2.根据第1项所述的一组数字PCR(dPCR)引物，其特征在于，所述引物还包括反向引物，其中所述反向引物包括：SEQ ID NO.:3所示的引物。
3.一组用于特异性检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的数字PCR(dPCR)探针，其特征在于，所述探针包括：SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:5所示的探针。
4.一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的数字PCR(dPCR)反应预混物，其特征在于，所述数字PCR(dPCR)反应预混物包括正向引物、反向引物和探针，其中，
所述正向引物包括：SEQ ID NO.:1和/或SEQ ID NO.:2所示的引物，
所述反向引物包括：SEQ ID NO.:3所示的引物，
所述探针包括：SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:5所示的探针。
5.根据第4项所述的数字PCR(dPCR)反应预混物，其还包括选自以下的一种或多种组分：热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs和Mg2+离子。
6.根据第4项所述的数字PCR(dPCR)反应预混物，其还包括一组用于扩增外参质控品的引物，其中，所述引物包括：SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:7所示的引物。
7.根据第4项所述的反应预混物，其还包括用于检测外参质控品的探针，其中，所述探针包括：SEQ ID NO.:8所示的探针。
8.一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括数字PCR(dPCR)反应预混物，所述数字PCR(dPCR)反应预混物包括正向引物和反向引物，其中，
所述正向引物包括：SEQ ID NO.:1和/或SEQ ID NO.:2所示的引物，
所述反向引物包括：SEQ ID NO.:3所示的引物。
9.根据第8项所述的试剂盒，其特征在于，所述数字PCR(dPCR)反应预混物还包括探针，其中，所述探针包括：SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:5所示的探针。
10.根据第8项所述的试剂盒，其特征在于，所述数字PCR(dPCR)反应预混物还包括一组用于扩增外参质控品的引物，其中，所述引物包括：SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:7所示的引物。
11.根据第8项所述的试剂盒，其特征在于，所述数字PCR(dPCR)反应预混物还包括用于检测外参质控品的探针，其中，所述探针包括：SEQ ID NO.:8所示的探针。
12.根据第8项所述的试剂盒，其特征在于，所述数字PCR(dPCR)反应预混物还包括选自以下的一种或多种组分：热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs和Mg2+离子。
13.根据第8项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括HBV阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV弱阳性质控品；和/或外参质控品。
14.一种检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测样本，所述样本中含有乙型肝炎病毒(HBV)DNA；
(2)制备数字PCR(dPCR)反应体系，进行dPCR反应，摄取数字PCR(dPCR)终反应的图像，通过图像分析统计乙型肝炎病毒(HBV)DNA阴性和阳性液滴的数量，利用泊松分布计算所述数字PCR(dPCR)反应体系中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的拷贝数，进而计算起始待检测样本中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的浓度；
其中，所述数字PCR(dPCR)反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本和根据第4项所述的数字PCR(dPCR)反应预混物。
15.根据第1或2项所述的一组数字PCR(dPCR)引物和根据第3项所述的一组探针在制备用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA的定量检测的试剂盒中的用途。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和下文中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅不再累述。
发明效果
由于qPCR定量检测技术的局限性，并且目前仅有适用于qPCR的商用试剂盒，因此需要开发适用于dPCR检测的试剂盒。而本发明的试剂盒基于dPCR检测，不需要依赖定量标准品和标准曲线，灵敏度、准确度和精密度更高，由于检测结果不受扩增效率的影响，因此重复性和一致性更高，更易标准化。
本发明的试剂盒包含的引物和探针设计简单，两条正向引物和两条探针针对不同HBV亚型，反向引物适用于所有亚型，因此覆盖率高，保证HBV的高检出率，降低假阳性检测结果。
具体实施方式
定义
除非在本文的其他地方具体限定，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是指引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体，属嗜肝DNA病毒科。
DNA是指脱氧核糖核酸，其是分子结构复杂的有机化合物。作为染色体的一个成分而存在于细胞核内。功能为储藏遗传信息。DNA分子由核苷酸组成。核苷酸的含氮碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶；戊糖为脱氧核糖。
数字PCR(dPCR)是指一种结合了微流控领域中的微液滴制备技术和荧光PCR技术的核酸绝对定量检测技术。该技术具有灵敏、特异、准确、精密等特点，适合微量核酸的定量检测。该技术通过微液滴制备技术将dPCR反应体系分割成数以万计的独立反应单元；在每个反应单元中，目标基因的存在与否决定了该反应单元是否生成PCR产物；生成PCR产物的反应单元在光源激发后能够发出特定频率的荧光信号，而不生成PCR产物的反应单元在光源激发后不能发出荧光信号；通过相机对dPCR反应的终产物拍照后，利用图像分析统计出HBV DNA阴性和阳性液滴数量；最后，利用泊松分布计算所述dPCR反应体系中目标基因的拷贝数，并得到样本中HBV DNA的定量检测结果。dPCR是一种绝对定量的检测方法，与qPCR技术相比，dPCR定量检测不需要定量标准品，因此使用更方便；同时，dPCR对PCR抑制剂的耐受性更高；此外，由于其定量检测对扩增效率的要求很低，因此dPCR对HBV不同基因型和变异株的检测具有更高的准确性、重复性、一致性。
引物是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3’端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。
正向引物是指处于DNA双链上游的引物，是沿着负链进行不间断延长的。负链即无义链，也称非编码连，和正链互补，与该链结合的引物为正向引物。
反向引物是指处于DNA双链下游的引物，是沿着正链进行不间断延长的。正链即有义链，也称编码链，一般位于双链DNA上端，方向从左到右为5‘——3’。
探针为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA，用特殊示踪剂(如同位素、酶或有色基团)进行标记；在适当的pH值、温度和离子强度下，DNA探针利用分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，能与待测样本中互补的非标记单链DNA或RNA以氢键结合(杂交)，形成双链复合物(杂交体)。将未配对结合的探针洗去后，可用放射自显影或酶联反应等检测系统检测杂交反应结果。
热启动Taq酶是指一般在95度加热5-10分钟活性中心才会暴露，会产生聚合作用的酶，与普通的Taq DNA聚合酶(最适温度是72℃)不同，其经过修饰，因此能有效避免低温下的模板错配，避免二聚体和非特异扩增，因而热启动TAQ酶对扩增的特异性非常重要。
UDG酶是指尿嘧啶-DNA糖基化酶，通过大肠杆菌表达纯化的重组酶，可催化含尿嘧啶的单链和双链DNA释放游离尿嘧啶，并且对RNA无活性，主要应用于防止PCR扩增产物的污染。在PCR反应中以dUTP代替dTTP，扩增产物片段中的T全部被U取代，形成了含dU碱基的PCR扩增产物。UNG酶能选择性断裂单链和双链DNA中U碱基的糖苷键，降解反应体系中含U的DNA，有效消除PCR产物的残留污染，大大降低扩增产物污染导致的假阳性，从而保证扩增的特异性和准确性。
dNTPs是指三磷酸碱基脱氧核苷酸，是四种核苷酸A、U、G、C的混合物，主要作用在于PCR在第三步延伸的过程中，需要这几种核苷酸，以碱基互补原则，在酶的作用下与需要扩增的模板链进行连接，从而达到复制模板链的目的。
外参质控品是指使用HBV DNA阴性的健康人血浆将阳性对照样品稀释到工作浓度，以保证实验室的检测质量。
HBV阴性质控品：为HBV DNA阴性的健康人血浆，HBV浓度为0IU/mL。
HBV强阳性质控品：为临床检测HBsAg阳性的样本经国家标准品定值后，使用HBVDNA阴性的健康人血浆稀释到工作浓度。HBV浓度为5.0×104IU/mL。
HBV弱阳性质控品：为临床检测HBsAg阳性的样本经国家标准品定值后，使用HBVDNA阴性的健康人血浆稀释到工作浓度。HBV浓度为50IU/mL。
泊松分布是一种统计与概率学里常见到的离散概率分布。泊松分布适合于描述单位时间(或空间)内随机事件发生的次数。当一个随机事件，以固定的平均瞬时速率λ(或称密度)随机且独立地出现时，那么这个事件在单位时间(面积或体积)内出现的次数或个数就近似地服从泊松分布P(λ)。
本发明属于病原体分子检测领域，涉及一组用于特异性扩增乙型肝炎病毒(HBV)DNA的数字PCR(dPCR)引物。在本发明中，利用上述引物来检测数字PCR(dPCR)反应体系中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的拷贝数，进而计算起始待检测样本中HBV DNA的浓度。从而对HBVDNA进行定量检测。
在本发明的一个具体的实施方案中，一组数字PCR(dPCR)引物包括：SEQ ID NO.:1所示的正向引物，和SEQ ID NO.:3所示的反向引物。
在本发明的一个具体的实施方案中，一组数字PCR(dPCR)引物包括：SEQ ID NO.:2所示的正向引物，和SEQ ID NO.:3所示的反向引物。
在本发明的一个具体的实施方案中，一组数字PCR(dPCR)引物包括：SEQ ID NO.:1所示的正向引物和SEQ ID NO.:2所示的正向引物，以及SEQ ID NO.:3所示的反向引物。
上述引物的具体序列如下所示：5’-CCCTGCTCGTGTTACAGG-3’(SEQ ID NO.:1)；5’-CCCCTTCTCGTGTTACAGG-3’(SEQ ID NO.:2)；5’-GAGAAGTCCACCACGAGTCTAG-3’(SEQ ID NO.:3)。
在本发明中，上述引物为通过对HBV 8个亚型的156个分离株DNA序列的分析、选择高保守序列而设计的引物，该引物的设计简单。使用上述两条正向引物可以同时针对不同HBV亚型进行检测，而上述一条反向引物为通用反向引物，适用于所有HBV亚型，因此同时使用两条正向引物和一条反向引物使检测的覆盖率高，保证HBV的高检出率，能够降低假阳性检测结果。
本发明还涉及一组用于特异性检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的数字PCR(dPCR)探针。
在本发明的一个具体的实施方案中，数字PCR(dPCR)探针包括SEQ ID NO.:4和SEQID NO.:5所示的探针。
上述探针的具体序列如下所示：5’-GTTGACAAGAATCCTCACAATACC-3’(SEQ ID NO.:4)；5’-GTTGACAAGAATCCTCACAATACC-3’(SEQ ID NO.:5)。
在本发明中，探针的第12个核苷酸(下划线标出的T)以锁核酸(Locked NucleicAcid，LNA)代替常用的脱氧核糖核酸，以提高探针的退火温度；探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1。
在本发明中，上述探针为同样通过对HBV 8个亚型的156个分离株DNA序列的分析、选择高保守序列而设计的探针，该探针的设计简单。将上述两条探针与上述两条正向引物同时使用可以针对不同HBV亚型进行检测，使检测的覆盖率高，保证HBV的高检出率，能够降低假阳性检测结果。
本发明还涉及一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的数字PCR(dPCR)反应预混物。
在本发明的一个具体的实施方案中，数字PCR(dPCR)反应预混物包括SEQ ID NO.:1所示的正向引物、SEQ ID NO.:3所示的反向引物和SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:5所示的探针。
在本发明的一个具体的实施方案中，数字PCR(dPCR)反应预混物包括SEQ ID NO.:2所示的正向引物、SEQ ID NO.:3所示的反向引物和SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:5所示的探针。
在本发明的一个具体的实施方案中，数字PCR(dPCR)反应预混物包括SEQ ID NO.:1所示的正向引物、SEQ ID NO.:2所示的正向引物和SEQ ID NO.:3所示的反向引物，以及SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:5所示的探针。
在本发明的一个具体的实施方案中，数字PCR(dPCR)反应预混物包括上述用于特异性检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的引物和探针，以及选自以下的一种或多种组分：热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs和Mg2+离子。
在本发明的一个具体的实施方案中，数字PCR(dPCR)反应预混物包括上述用于特异性检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的引物和探针；选自以下的一种或多种组分：热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs和Mg2+离子；以及SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:7所示的一组用于扩增外参质控品的引物。
在本发明中，用于扩增外参质控品的引物的具体序列如下：5’-TGGATTGGTGCTTGTCAGAA-3’(SEQ ID NO.:6)；5’-GCCGTGGTTGATACTGAA-3’(SEQ ID NO.:7)。外参质控品为含有外参目标基因片段的重组质粒。
在本发明的一个具体的实施方案中，数字PCR(dPCR)反应预混物包括上述用于特异性检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的引物和探针；选自以下的一种或多种组分：热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs和Mg2+离子；一组用于扩增外参质控品的引物；以及SEQ ID NO.:8所示的用于扩增外参质控品的探针。
在本发明中，用于扩增外参质控品的探针的具体序列如下：5’-TGGCGAGACTATCATCATCTGG-3’(SEQ ID NO.:8)所示的探针。
本发明的数字PCR(dPCR)反应预混物由于包括上述引物和探针，因此可以针对不同HBV亚型进行检测，使检测的覆盖率高，保证HBV的高检出率，能够降低假阳性检测结果。
本发明还涉及一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的试剂盒。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述试剂盒包括上述数字PCR(dPCR)反应预混物，以及HBV阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV弱阳性质控品。
在本发明中，HBV阴性质控品为HBV DNA阴性的健康人血浆；HBV强阳性质控品和HBV弱阳性质控品为临床检测HBsAg阳性的样本经国家标准品定值后，使用HBV DNA阴性的健康人血浆稀释到工作浓度。在包含所述反应预混物的试剂盒中选择5.0×104IU/mL为强阳性质控品HBV浓度，选择50IU/mL为弱阳性质控品HBV浓度。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述试剂盒包括上述数字PCR(dPCR)反应预混物，以及外参质控品。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述试剂盒包括上述数字PCR(dPCR)反应预混物，以及HBV阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV弱阳性质控品，和外参质控品。
在本发明中，所述试剂盒还包括包装这些组成部分的包装盒。
在本发明中，本发明的试剂盒对待检样本的扩增由dPCR仪自动完成，检测结果可用于HBV DNA的定量检测。
本发明的试剂盒是基于dPCR检测的试剂盒，其不同于商用的PCR试剂盒。商用的PCR试剂盒依赖定量标准品和标准曲线获得待检测样品的结果，并且待检测样品的结果受扩增效率的影响。而本发明的试剂盒不需要依赖定量标准品和标准曲线，因此灵敏度、准确度和精密度比商用的PCR试剂盒更高，并且由于其检测结果不受扩增效率的影响，因此重复性和一致性更高，更易标准化。
本发明还涉及一种检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的方法。
在本发明的一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)提供待检测样本，所述样本中含有乙型肝炎病毒(HBV)DNA；
(2)制备数字PCR(dPCR)反应体系，进行dPCR反应，摄取数字PCR(dPCR)终反应的图像，通过图像分析统计乙型肝炎病毒(HBV)DNA阴性和阳性液滴的数量，利用泊松分布计算所述数字PCR(dPCR)反应体系中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的拷贝数，进而计算起始待检测样本中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的浓度。
在本发明的一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)分析HBV八种基因型(A-H)的共156个病毒分离株系的全基因组序列，针对高度保守区设计特异性的引物和探针，避免漏检；
(2)通过dPCR仪进行样本自动化检测；
(3)通过dPCR反应，特异性扩增HBV的目标序列；
(4)通过图像分析HBV DNA阴性和阳性液滴数量，利用泊松分布计算所述反应体系中HBV DNA的拷贝数，并得到样本HBV DNA的定量检测结果。
(5)通过HBV DNA阳性质控品、阴性质控品、和外参质控品的质量控制，确保检测结果的有效性。
在本发明的一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)分析NCBI的基因组数据库中HBV八种基因型(A-H)的共156个病毒分离株系的全基因组序列，针对S区高度保守区设计特异性的引物和探针，避免漏检；
(2)提供待检测样本，所述样本中含有乙型肝炎病毒(HBV)DNA；
(3)制备数字PCR(dPCR)反应体系，进行dPCR反应；
(4)上述引物和探针在含有热启动Taq酶、尿嘧啶DNA糖基酶(UDG)、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)和Mg2+离子等成份的dPCR反应预混物溶液中，通过dPCR反应实现体外HBVDNA的目标序列的特异性循环扩增。
(5)摄取数字PCR(dPCR)终反应的图像，通过图像分析统计乙型肝炎病毒(HBV)DNA阴性和阳性液滴的数量，利用泊松分布计算所述数字PCR(dPCR)反应体系中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的拷贝数，进而计算起始待检测样本中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的浓度，得到样本HBV DNA的定量检测结果；
(6)通过HBV DNA阳性质控品、阴性质控品，和外参质控品的质量控制，确保检测结果的有效性。
在本发明中，所述数字PCR(dPCR)反应体系(即反应液)包括上述待检测样本和上述数字PCR(dPCR)反应预混物。单人份的dPCR反应液由10μl dPCR预混物溶液和10μl待测样本的核酸溶液混合而成，反应液总体积为20μl。dPCR反应液中，引物的浓度均为400-800nM，探针的浓度为200-400nM；优选地，引物的浓度均为600nM，探针的浓度为250nM。dPCR反应液还包含40mM Tris-HCl(pH 8.8)、1～10mM MgCl2、10～50mM KCl、5～10mM(NH4)2SO4。dPCR反应液还包括1-10U热启动Taq酶，0.5～1U UDG酶，6～12mM dUTPs；优选地，dPCR反应液包括5U热启动Taq酶；0.8U UDG酶，10mM dUTPs。制备dPCR反应液后，进行dPCR反应。dPCR扩增的条件为：1)37℃5分钟，2)95℃ 15分钟；3)94℃ 30秒，随后62℃ 45秒，45个循环。
使用本发明的试剂盒检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的方法，灵敏度、准确度和精密度高，并且重复性、一致性也更高，更易于标准化。
本发明还涉及上述用于特异性扩增乙型肝炎病毒(HBV)DNA的数字PCR(dPCR)引物和探针在制备上述用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA的定量检测的试剂盒中的用途。
在对利用本申请涉及的引物和方法的检测灵敏度进行评估中，对20个检测限参考品的检测中19个为阳性检测结果(>1IU/mL)，符合检测限的要求，而在使用备选引物和探针组合1进行检测中，样本2、11、12、16、19、20的检测结果为0IU/mL，在使用备选引物和探针组合2进行检测中，样本2、9、11、12、16、19、20的检测结果为0IU/mL，不符合检测限的要求，因此，利用本申请涉及的引物和方法检测的灵敏度优于使用备选引物。在102-105IU/mL的检测范围内，利用本申请涉及的引物和方法检测的偏差均小于20％，而使用备选引物和探针组合1时，在以HBV阴性血浆分别稀释为1.0×104IU/ml、1.0×103IU/ml和1.0×102IU/ml的HBVDNA样本中，检测的偏差分别为22％、27％和33％，在使用备选引物和探针组合2时，在以HBV阴性血浆分别稀释为1.0×102IU/ml的HBV DNA样本中，检测的偏差为21％，均大于20％，因此，利用本申请涉及的引物和方法检测的准确度优于备选引物，并且在上述检测范围内，利用本申请涉及的引物和方法检测的CV均小于等于3％，而使用备选引物和探针组合1时，在以HBV阴性血浆稀释为1.0×102IU/ml的HBV DNA样本中为3.8％，大于3％，因此，利用本申请涉及的引物和方法检测的CV优于备选引物。
以下，结合具体实施例，进一步描述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例
实施例1：用于定量测定人血清或血浆中HBV DNA的试剂盒
本试剂盒用于定量测定人血清或血浆中HBV DNA。试剂盒中包含的试剂组分如下：
试剂盒组分 主要成分
dPCR反应预混液 HBV特异性引物、探针、热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs和MgCl<sub>2</sub>
外参质控品 已标定的含有外参基因片段的重组质粒
HBV阴性质控品 已标定灭活的HBV阳性血清或血浆
HBV强阳性质控品 已标定灭活的HBV阳性血清或血浆
HBV弱阳性质控品 已标定灭活的HBV阳性血清或血浆
首先，进行样本处理和核酸提取。所述样本为血清或血浆；样本体积为0.5-2mL，优选样本体积为1mL。本试剂盒中的外参质控品参与核酸提取和dPCR全过程，用于对样本检测的操作全流程进行质控；按照样本体积：外参质控品体积＝50:1的比例在样本中加入外参质控品溶液后进行核酸提取。本试剂盒中的质控品需要提取，用于对dPCR检测试剂进行质控。HBV DNA提取是通过使用Qiagen公司的QIAamp游离核酸提取试剂盒(Cat No./ID:55114)完成。DNA洗脱液体积为20μl。
然后，制备dPCR反应液。从试剂盒中取出dPCR反应预混液，室温融化后振荡混匀，短暂离心后使用。20个样本每个样本(包括：待测样本、阴性质控品、强阳性质控品、弱阳性质控品)的dPCR反应液由等体积(10μl)的DNA洗脱液和dPCR反应预混液混合、振荡混匀、短暂离心后制备完成。
dPCR扩增和产物分析是通过北京达微生物科技有限公司的GO1型全自动dPCR仪完成。dPCR的液滴制备设置参数采用设备默认模式，即：每个样本生成20，000个1nL的液滴。数字PCR循环条件如下：37℃5分钟，1个循环；95℃15分钟，1个循环；94℃ 30秒，60℃ 60秒，45个循环。
结果分析是GO1型全自动dPCR仪的图像分析软件完成，通过识别和统计HBV DNA和外参基因的阴、阳性液滴数目，然后通过泊松分布计算dPCR反应液中的HBV和外参基因DNA浓度：
-ln(1-NP/NT)/VP
其中，NP是HBV或外参基因阳性液滴的数目、NT是HBV或外参基因液滴总数(即：阳性和阴性液滴之和)、Vp是液滴的体积(即：1nL)。
样本中HBV或外参基因的检测浓度为：
【-ln(1-NP/NT)*N】*(Ve/Vt)/Vs
其中，N是微液滴的总数(即：20000)、Ve是DNA洗脱液的总体积(即：20μl)、Vt是dPCR反应液中加入的DNA溶液的体积(即：10μl)、Vs是血清或血浆样本的体积(即：1mL)。
然后，需要对HBV DNA的检测浓度进行DNA回收率修正，DNA回收率为：
(外参质控品的检测浓度/外参质控品标定浓度)*50
样本中HBV DNA的实际浓度为：
HBV DNA的检测浓度/DNA回收率。
检测过程的质量控制是通过质控品的检测完成的，只有质控品检测结果满足以下条件，该次检测才为有效检测：
1)HBV DNA阴性质控品：0IU/mL；
2)HBV DNA弱阳性质控品：>1IU/mL
3)HBV DNA强阳性质控品：>2*104IU/mL
无效检测需要复检。
最后，由于dPCR的动态检测区间由制备的微液滴总数决定，在每个样本dPCR反应液制备形成20000个液滴的情况下，dPCR的动态检测区间的上限为2*105IU/mL,因此如果发现样本的HBV DNA浓度超过105IU/mL，则需要对样本DNA洗脱液稀释1000倍后复检。
实施例2：灵敏度
检测限参考品为经国家参考品定值的临床HBV DNA样本，使用HBV阴性血清稀释至本试剂盒灵敏度10IU/mL作为检测限参考品(20次重复)。根据实施例1中的步骤，对本申请涉及的检测灵敏度进行评估。实际测得的结果如下表1：
Figure BDA0002145462760000141
上表中本申请的引物和探针如下：
正向引物包括：SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示的引物，
反向引物包括：SEQ ID NO.:3所示的引物，
探针包括：SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:5所示的探针。
备选的引物和探针为针对乙型肝炎病毒(HBV)DNA的同一位点设计的不同于本申请的引物和探针，其具体序列如下：
备选的引物和探针组合1
正向引物包括：5’-GCTCGTGTTACAGGCGG-3’(SEQ ID NO.:9)和5’-CTTCTCGTGTTACAGGCGG-3’(SEQ ID NO.:10)
反向引物包括：5’-GAGAAGTCCACCACGAGTCTAG-3’(SEQ ID NO.:3)
探针包括：5’-GTTGACAAGAATCCTCACAATACC-3’(SEQ ID NO.:4)；5’-GTTGACAAGAATCCTCACAATACC-3’(SEQ ID NO.:5)
备选的引物和探针组合2
正向引物包括：5’-CTGCTCGTGTTACAGGCG-3’(SEQ ID NO.:11)和5’-CCTTCTCGTGTTACAGGCG-3’(SEQ ID NO.:12)
反向引物包括：5’-GAGAAGTCCACCACGAGTCTAG-3’(SEQ ID NO.:3)
探针包括：5’-GTTGACAAGAATCCTCACAATACC-3’(SEQ ID NO.:4)；5’-GTTGACAAGAATCCTCACAATACC-3’(SEQ ID NO.:5)。
检测结果显示：对20个检测限参考品的检测中19个为阳性检测结果(>1IU/mL)，符合检测限的要求，因此，利用本申请的方法的检测限为10IU/mL。在使用备选引物和探针组合1进行检测中，样本2、11、12、16、19、20的检测结果为0IU/mL，在使用备选引物和探针组合2进行检测中，样本2、9、11、12、16、19、20的检测结果为0IU/mL，不符合检测限的要求，检测限高于10IU/mL。
实施例3：准确度
准确度参考品为经国家参考品定值的临床HBV DNA样本，以HBV阴性血浆分别稀释为1.0×105IU/ml、1.0×104IU/ml、1.0×103IU/ml和1.0×102IU/ml，作为准确度参考品，共4个。将准确度参考品与HBV DNA阴性质控品、HBV DNA强阳性质控品和HBV弱阳性质控品进行核酸提取。根据实例1中的步骤，对本申请涉及的检测准确度进行评估。实际测得的结果如下表2：
Figure BDA0002145462760000161
检测结果显示：对4个准确度参考品的检测中，在102-105IU/mL的检测范围内，利用本申请涉及的引物和方法检测的偏差均小于20％，准确度高。
实施例4：精密度
精密度参考品为与实施例3中的准确度参考品相同，每个精密度参考品重复检测10次。根据实例1中的步骤，对本申请涉及的检测精密度进行评估。实际测得的结果如下表3：
Figure BDA0002145462760000162
检测结果显示：对4个精密度参考品的检测中，在102-105IU/mL的检测范围内，利用本申请涉及的引物和方法检测的CV均小于等于3％，精密度高。
序列表
<110> 北京达微生物科技有限公司
<120> 一种乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检测试剂盒
<130> TPC00571
<141> 2019-07-26
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccctgctcgt gttacagg 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ccccttctcg tgttacagg 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gagaagtcca ccacgagtct ag 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gttgacaaga atcctcacaa tacc 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gttgacaaga atcctcacaa tacc 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tggattggtg cttgtcagaa 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gccgtggttg atactgaa 18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tggcgagact atcatcatct gg 22
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gctcgtgtta caggcgg 17
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
cttctcgtgt tacaggcgg 19
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ctgctcgtgt tacaggcg 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ccttctcgtg ttacaggcg 19

Claims (10)

1.一种用于检测乙型肝炎病毒DNA的数字PCR反应预混物，其特征在于，所述数字PCR反应预混物包括正向引物、反向引物和探针，其中，
所述正向引物为：SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的引物，
所述反向引物为：SEQ ID NO. 3所示的引物，
所述探针为：SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示的探针。
2.根据权利要求1所述的数字PCR反应预混物，其还包括选自以下的一种或多种组分：热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs和Mg2+离子。
3. 根据权利要求1所述的数字PCR反应预混物，其还包括一组用于扩增外参质控品的引物，其中，所述引物为：SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7所示的引物。
4. 根据权利要求1所述的反应预混物，其还包括用于检测外参质控品的探针，其中，所述探针为：SEQ ID NO. 8所示的探针。
5.一种用于检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括数字PCR反应预混物，所述数字PCR反应预混物包括正向引物和反向引物，其中，
所述正向引物为：SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的引物，
所述反向引物为：SEQ ID NO. 3所示的引物；
所述数字PCR反应预混物还包括探针，其中，所述探针为：SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO.5所示的探针。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应预混物还包括一组用于扩增外参质控品的引物，其中，所述引物为：SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7所示的引物。
7. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应预混物还包括用于检测外参质控品的探针，其中，所述探针为：SEQ ID NO. 8所示的探针。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应预混物还包括选自以下的一种或多种组分：热启动Taq酶、UDG酶、dNTPs和Mg2+离子。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括HBV阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV弱阳性质控品；和/或外参质控品。
10.一种检测乙型肝炎病毒DNA的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1) 提供待检测样本，所述样本中含有乙型肝炎病毒DNA；
(2) 制备数字PCR反应体系，进行dPCR反应，摄取数字PCR终反应的图像，通过图像分析统计乙型肝炎病毒DNA阴性和阳性液滴的数量，利用泊松分布计算所述数字PCR反应体系中乙型肝炎病毒DNA的拷贝数，进而计算起始待检测样本中乙型肝炎病毒DNA的浓度；
其中，所述数字PCR反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本和权利要求1所述的数字PCR反应预混物。
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