CN110592289A - 一种高灵敏度hbv dna数字pcr定量检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种高灵敏度hbv dna数字pcr定量检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括上游引物容器、下游引物容器、探针容器、数字PCR反应缓冲液容器、阳性对照容器和阴性对照容器；本发明利用数字PCR对样品中目标核酸的含量进行绝对定量的方法，精确的测定HBV DNA的量，使其可以广泛的应用于生物、农业、医药等领域，特别是在人乙肝病毒检测方面具有良好的发展前景。

Description

一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于病毒核苷酸检测领域，具体涉及种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用。
技术背景
乙肝病毒是一种双链DNA病毒。体内检测到乙肝病毒DNA，此人就可以确定为乙肝病毒感染者。乙肝病毒DNA数量是判断乙肝病毒复制活跃程度的最可靠的方法。血液中乙肝病毒DNA较少，说明乙肝病毒复制得到抑制，传染性较弱；血液中乙肝病毒DNA较多，说明乙肝病毒复制活跃，传染性较强。其定量检测对于治疗方案的制定以及治疗效果的判断有着重要的意义。
近几年发展起来的定量核酸检测方法可以对病毒核酸进行相对的定量检测，对于药物治疗效果的评价和病毒复制活性的判定很有意义。目前为止，定量检测HBV DNA的方法很多，但还没有统一的检测标准，常用的定量检测方法主要是荧光定量PCR法，但是荧光定量PCR法的数据处理复杂，需要参考物或标准品，且易受PCR抑制剂影响，同时光定量PCR法在测定低滴度的乙肝病毒时，误差较大，灵敏度不高。
发明内容
针对上述情况，本发明公开了一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用，可以不需要标准品，简化了操作，灵敏度高，并且实现了对病毒核酸的绝对定量。
为了实现上述发明的目的，本发明公开了一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，包括上游引物容器、下游引物容器、探针容器、数字PCR反应缓冲液容器、阳性对照容器和阴性对照容器；
所述上游引物容器内具有上游引物，所述上游引物具有如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列；
所述下游引物容器内具有下游引物，所述下游引物具有如SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列；
所述探针容器内具有荧光探针，所述荧光探针具有如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
上下游引物为NCBI数据库中现有引物对中产物长度适当的，根据上下游引物及目标DNA序列设计探针引物。
进一步的，上述高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，当上游引物的核酸序列为SEQ ID NO.1时，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5；当上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2时，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，所述荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
进一步的，上述高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，所述3’端标记有荧光淬灭基团。
进一步的，上述高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为TAMRA。当待测样品中不存在目标DNA分子时FAM的荧光被TAMRA淬灭，不发出荧光；当待测样品中存在目标DNA分子时，探针与目标DNA分子结合，随后靠Taq酶的5'→3‘双链外切酶活性降解探针而释放荧光基团FAM，发出荧光。
进一步的，上述高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，所述数字PCR反应缓冲液包括Taq酶、dNTP和镁离子。
进一步的，上述高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，所述阳性对照为乙肝病毒DNA片段PCR扩增产物，所述阴性对照为超纯水、去离子水或不含乙肝病毒的血清。
进一步的，上述高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒在HBV DNA检测中的应用，包括以下步骤：
(1)提取人血浆样本中的DNA，包括HBV DNA与游离的人基因组DNA，为待测样品；
(2)采用试剂盒中的引物与探针，配置PCR预备液，再分别加入等体积的待测样品，阳性对照和阴性对照，通过微滴发生器生成微滴后用于PCR反应；
(3)扩增完成后检测荧光信号，利用软件对PCR阳性和PCR阴性液滴进行计数，并进行数据分析。
进一步的，上述高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒在HBV DNA检测中的应用，所述步骤(3)中，当阳性对照测定结果大于100copies/μl，阴性结果小于1copies/μl，则所述待测样品的检测结果可用于判定待测样品中原始HBV DNA拷贝数。
进一步的，上述高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒在HBV DNA检测中的应用，所述所述PCR预备液为：
2X数字PCR反应缓冲液包括Taq酶、dNTP和镁离子 10ul
10X引物，探针组合 1ul
去离子水 9ul。
进一步的，上述高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒在HBV DNA检测中的应用所述PCR扩增的反应条件为：
95℃下保持10分钟；
94℃反应30s，60℃反应1min，循环40次；
98℃下10分钟，并冷却至4℃，升降温速度为2℃/s。
所述核苷酸序列如表1所示:
表1核苷酸序列
本发明具有如下的有益效果：
(1)本发明提供了一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，具有检测快速、准确、灵敏度较高以及对抑制剂有较高耐受度等优点，
(2)本发明所述的检测试剂盒的使用简单方便，无需对照品，操作简单，可以广泛的应用于生物、农业、医药等领域，特别是在人乙肝病毒检测方面具有良好的发展前景。
(3)本发明所述的检测试剂盒的在检测HBV DNA方面具有较高的灵敏度，检测限低至20copies/μl，对于乙型肝炎的防治具有重要意义。
附图说明
图1为最佳实施例1的数字PCR测定结果图示。
图2为最佳实施例1的方法验证中的回收率的回归曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；本发明所涉及的抗体的氨基酸和核酸序见序列表，本发明所用的数字PCR系统为Bio-Rad’s QX200 ddPCR System(Bio-Rad,Hercules,CA)，引物合成公司为生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例1
一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，包括上游引物容器、下游引物容器、探针容器、数字PCR反应缓冲液容器、阳性对照容器和阴性对照容器；
其中上游引物序列为SEQ ID NO.1＝5’-ATGTTGCCCGTTTGTCCTCT-3’，
下游下游引物序列为SEQ ID NO.3＝5’-GCCCTACGAACCACTGAACA-3’
探针引物序列为SEQ ID NO.5＝5’-FAM-CCGGACCTGCATGACTACTG-TAMRA-3’。
以下为检测步骤：
(1)用1mM pH7.4的TE缓冲液，将分别上游引物、下游引物、探针引物溶解，得到20μM的溶液，4℃保存。
(2)将上游引物、下游引物、探针引物按照一定比例混合。取1μl探针混合物，10μl不含dUTP的2×ddPCR Supermix，1μl样品，加入一定量的水配置为20μl PCR反应液。
(3)阳性对照采用乙肝病毒DNA片段PCR扩增产物，设置3个阴性对照，1为不含乙肝病毒的血清，2为去离子水，3为超纯水；待测样品为病毒总DNA提取物。
(4)将样品、阳性对照、3个阴性对照的PCR各20μl加入反应孔，通过微滴发生器生成微滴后用于PCR反应。
(5)95℃下保持10分钟；94℃反应30s，60℃反应1min，循环40次；98℃下10分钟，并冷却至4℃。升降温速度为2℃/s。
(6)随后采集荧光信号，利用软件对PCR阳性和PCR阴性液滴进行计数，并进行数据分析。测定结果如图1所示，所述横轴为微滴数量，纵轴为单点绝对荧光值，采用严格阈值线(取值3291)，可以看到阳性结果(0-20000)中部分微滴含模板DNA，与阴性对照1(20000-40000)，阴性对照2(40000-60000)和阴性对照3(60000-80000)的信号有明显区别，而与阳性对照(80000-)相近。
(7)检出限的计算：阈值采用严格阈值线，空白检出限(Limit of blank，LOB)为1copies/μl，用Grubbs剔除检验异常值，样品检出限(Limit of detection，LOD)根据公式LOD＝LOB±3×RD计算LOD为22.3copies/μl。
(8)回收率的测定：采用标准加入法进行回收率的测定，结果如图2所示，当样品加入量分别为200copies/μl，250copies/μl，300copies/μl时，回收率在95.8％-99.7％之间。加入量与测得值之间有良好的线性关系，R2为0.9934。
实施例2
一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，包括上游引物容器、下游引物容器、探针容器、数字PCR反应缓冲液容器、阳性对照容器和阴性对照容器；
其中上游引物序列为SEQ ID NO.2＝5’-TGGAACCTTTTCGGCTCCTC-3’，
下游下游引物序列为SEQ ID NO.4＝5’-GGGAGTCCGCGTAAAGAGAG-3’
探针引物序列为SEQ ID NO.6＝5’-FAM-TCGTTTCCATGGCTGCTAGG-TAMRA-3’；
以下为检测步骤：
(1)用1mM pH7.4的TE缓冲液，将分别上游引物、下游引物、探针引物溶解，得到20μM的溶液，4℃保存。
(2)将上游引物、下游引物、探针引物按照一定比例混合。取1μl探针混合物，10μl不含dUTP的2×ddPCR Supermix，1μl样品，加入一定量的水配置为20μl PCR反应液。
(3)阳性对照采用乙肝病毒DNA片段PCR扩增产物，去离子水为阴性对照；待测样品为病毒总DNA提取物。
(4)将样品、阳性对照、阴性对照的PCR各20μl加入反应孔，通过微滴发生器生成微滴后用于PCR反应。
(5)95℃下保持10分钟；94℃反应30s，60℃反应1min，循环40次；98℃下10分钟，并冷却至4℃。升降温速度为2℃/s。
(6)随后采集荧光信号，利用软件对PCR阳性和PCR阴性液滴进行计数，并进行数据分析。阳性对照测定结果大于100copies/μl，阴性结果小于1copies/μl，实验结果成立，阴性对照中测定值加上三倍标准偏差为检测限，样品结果大于检测限，判定检出。
(7)检出限的计算。阈值采用严格阈值线，空白检出限(Limit of blank，LOB)为1copies/μl，用Grubbs剔除检验异常值，样品检出限(Limit of detection，LOD)根据公式LOD＝LOB±3×RD计算LOD为25.5copies/μl。
实施例3
一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，包括上游引物容器、下游引物容器、探针容器、数字PCR反应缓冲液容器、阳性对照容器和阴性对照容器；
其中上游引物序列为SEQ ID NO.1＝5’-ATGTTGCCCGTTTGTCCTCT-3’，
下游下游引物序列为SEQ ID NO.3＝5’-GCCCTACGAACCACTGAACA-3’
探针引物序列为SEQ ID NO.5＝5’-FAM-CCGGACCTGCATGACTACTG-TAMRA-3’；
以下为检测步骤：
(1)用1mM pH7.4的TE缓冲液，将分别上游引物、下游引物、探针引物溶解，得到20μM的溶液，4℃保存。
(2)将上游引物、下游引物、探针引物按照一定比例混合。取1μl探针混合物，10μl不含dUTP的2×ddPCR Supermix，1μl样品，加入一定量的水配置为20μl PCR反应液。
(3)阳性对照采用乙肝病毒DNA片段PCR扩增产物，不含乙肝病毒的血清为阴性对照；待测样品为病毒总DNA提取物。
(4)将样品、阳性对照、阴性对照的PCR各20μl加入反应孔，通过微滴发生器生成微滴后用于PCR反应。
(5)95℃下保持10分钟；94℃反应30s，60℃反应1min，循环40次；98℃下10分钟，并冷却至4℃。升降温速度为2℃/s。
(6)随后采集荧光信号，利用软件对PCR阳性和PCR阴性液滴进行计数，并进行数据分析。阳性对照测定结果大于100copies/μl，阴性结果小于1copies/μl，实验结果成立，阴性对照中测定值加上三倍标准偏差为检测限，样品结果大于检测限，判定检出。
(7)检出限的计算。阈值采用严格阈值线，空白检出限(Limit of blank，LOB)为1copies/μl，用Grubbs剔除检验异常值，样品检出限(Limit of detection，LOD)根据公式LOD＝LOB±3×RD计算LOD为29.5copies/μl。
总结：根据以上实施例可以得出，本发明所述的一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒具有灵敏度高，检测方便，无需标准品，不受PCR试剂干扰等优点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州健雄职业技术学院
<120> 一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用
<130> 2019
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<223> SEQ ID NO.1
<400> 1
atgttgcccgtttgtcctct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<223> SEQ ID NO.2
<400> 2
tggaaccttttcggctcctc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<223> SEQ ID NO.3
<400> 3
gccctacgaaccactgaaca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<223> SEQ ID NO.4
<400> 4
gggagtccgcgtaaagagag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<223> SEQ ID NO.5
<400> 5
ccggacctgcatgactactg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<223> SEQ ID NO.6
<400> 6
tcgtttccatggctgctagg 20

Claims (10)

1.一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于，包括上游引物容器、下游引物容器、探针容器、数字PCR反应缓冲液容器、阳性对照容器和阴性对照容器；
所述上游引物容器内具有上游引物，所述上游引物具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述下游引物容器内具有下游引物，所述下游引物具有如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
所述探针容器内具有荧光探针，所述荧光探针具有如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于，当上游引物的核酸序列为SEQ ID NO.1时，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5；当上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2时，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，所述荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
3.根据权利要求1所述的一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，所述3’ 端标记有荧光淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为TAMRA。
5.根据权利要求1所述的一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应缓冲液包括Taq酶、dNTP和镁离子。
6.根据权利要求1所述的一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为乙肝病毒DNA片段PCR扩增产物，所述阴性对照为超纯水、去离子水或不含乙肝病毒的血清。
7.如权利要求1-6任一项所述的高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒在HBV DNA检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取人血浆样本中的DNA，包括HBV DNA与游离的人基因组DNA，为待测样品；
（2）采用试剂盒中的引物与探针，配置PCR预备液，再分别加入等体积的待测样品，阳性对照和阴性对照，通过微滴发生器生成微滴后用于PCR反应；
（3）扩增完成后检测荧光信号，利用软件对PCR阳性和PCR阴性液滴进行计数，并进行数据分析。
8.根据权利要要求7所述的高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒在HBV DNA检测中的应用，其特征在于，所述步骤（3）中，当阳性对照测定结果大于100 copies/μl，阴性结果小于1 copies/μl，则所述待测样品的检测结果可用于判定待测样品中原始HBV DNA拷贝数。
9.根据权利要求7所述的高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒在HBV DNA检测中的应用，其特征在于，所述PCR预备液为：
2X数字PCR反应缓冲液包括Taq酶、dNTP和镁离子 10ul
10X引物，探针组合 1ul
去离子水 9ul。
10.根据权利要求9所述的高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒在HBV DNA检测中的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：
95℃下保持10分钟；
94℃反应30 s，60℃反应1min，循环40次；
98℃下10分钟，并冷却至4℃，升降温速度为2℃/s。
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