CN111363859A

CN111363859A - 一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法

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Publication number: CN111363859A
Application number: CN202010452867.6A
Authority: CN
Inventors: 张树文; 葛斌文
Original assignee: Nanjing Liming Biological Products Co ltd
Current assignee: Nanjing Liming Biological Products Co ltd
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2020-05-26
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2040-05-26
Also published as: CN111363859B

Abstract

本发明公开了一种用于2019‑nCoV检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法，涉及病毒体外核酸检测技术领域。用于2019‑nCoV检测的核酸组合物为正向引物、反向引物及探针；用于2019‑nCoV检测的检测试剂盒中包含该核酸组合物，还包括酶混合物和PCR MIX，该检测试剂盒可制备成液态，也可制备成粉态；本发明中粉态的检测试剂盒的生产方法包括混合和冻干步骤。本发明中的核酸组合物及试剂盒可对2019‑nCoV基因序列上的ORF3中的目标基因进行特异性扩增，且检测灵敏度高，还能够对病毒的初始拷贝数进行准确定量，可广泛用于2019‑nCoV核酸检测。

Description

一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法

技术领域

本发明涉及病毒体外核酸检测技术领域，更具体地说，它涉及一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法。

背景技术

2019年12月以来，陆续发现了多例不明原因肺炎病例，现已证实为一种新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病。此次疫情传染性强，临床上以发热、乏力、干咳为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状，部分患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现，病情危重者可导致死亡。2020年1月12日，世界卫生组织将引起本次病毒性肺炎病例的病原体命名为2019-nCoV，即2019新型冠状病毒。

2019-nCoV属于β属的新型冠状病毒，为RNA病毒，其有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，是目前已知的可以感染人的第7种冠状病毒，其余6种冠状病毒分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。其中前4种在人群中较为常见，致病性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道症状，另外2种是致病性较高的SARS冠状病毒和MERS冠状病毒。核酸检测是临床病原学诊断的常用方法，其具有灵敏高、特异性强等优点。新型冠状病毒肺炎疫情发生以来，核酸检测是临床诊断、解除隔离、康复出院的重要诊断依据。基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR技术具有简单、快速、准确的优势，已广泛应用于临床病原体的检测，曾在2003年爆发的SRAS病毒的疫情控制方面做出过重要贡献，是WHO推荐的MERS-CoV病毒检测方法之一，目前，实时荧光RT-PCR技术已被列入我国2019-nCoV诊疗指南。

为了助力2019-nCoV引起的肺炎疫情的检疫和防控工作，自疫情发生以来，国内外陆续涌现出了2019-nCoV核酸检测试剂盒，如公开号为CN110982945A 的中国专利中公开的一种检测2019新型冠状病毒的核酸组合物、试剂盒以及方法，公开号为CN111074008A的中国专利中公开的一种可提高准确率的COVID-19新型冠状病毒核酸检测方法等。

但是，从目前临床实际使用情况来看，现有的核酸检测试剂盒仍然存在假阴性的情况，会造成漏检，给疫情防控带来很大的隐患。其假阴性的原因可能是实时荧光定量检测病毒时，由于使用的引物或探针的特异性不高，导致了无法特异性地扩增出目标基因，因此无法检测出样本中的病毒信号。鉴于此，目前本领域的技术人员仍需继续研发特异性高的核酸检测方案，以改善现有的核酸检测试剂盒存在的假阴性问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物，其引物和探针易于特异性地扩增出样本中的目标基因，对样本具有准确的2019-nCoV病毒检测能力。

本发明的第二个目的在于提供一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其能够特异、灵敏地检测出样本中的2019-nCoV病毒，且试剂盒使用起来操作简单、操作步骤少、失误率低，检测效率高。

本发明的第三个目的在于提供一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒生产方法，其选择冻干法生产用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，使得本发明中的检测试剂盒具有即用即溶解、使用方便、不易降解、便于长途运输的优势。

为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物，所述核酸组合物包括正向引物、反向引物和探针，其特征在于，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示；

所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；

所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示；

所述探针的5’端采用荧光报告基团修饰，所述探针的3’端采用荧光淬灭基团修饰。

通过采用上述技术方案，本方案中将2019-nCoV的全基因组序列与其他6种冠状病毒的全基因组序列进行比对分析，在2019-nCoV基因序列中的开放读码框ORF3的基因上针对性地设计了正向引物、反向引物和探针，能够特异性地扩增ORF3上的目标基因，从而特异性地指示被测样本中的2019-nCoV。同时，在NCBI数据库里primer-blast扩增引物对新冠病毒以外的物种无匹配的结果，说明引物对其他物种无扩增，特异性良好，因此，以本方案中的正、反向引物和探针扩增样本时，能够特异性地扩增出样本中的目标基因，从而准确指示2019-nCoV的有无，减少核酸检测时假阴性的情况发生，进而减少疫情防控中的漏检情况。通过探针上荧光报告基团和荧光淬灭基团的引入，无PCR扩增时，荧光淬灭基团能够淬灭荧光报告基团，无荧光信号；在进行延伸反应时，聚合酶的 5’外切酶活性能够对探针进行酶切，使得荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，荧光报告基团得以报告荧光信号，从而指示出样本中存在目标基因的扩增。随着PCR产物的增加，荧光信号也等比例增加，从而可以通过荧光信号的出现与否判读样本中是否出现了目标基因的扩增，以快速指示样本中有无2019-nCoV。同时，还可以通过荧光信号定量样本中2019-nCoV的起始拷贝数，以指示样本中的病毒量。

为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，包括上述的正向引物、反向引物和探针，且所述正向引物、反向引物和探针独立包装，还包括酶混合物和PCR MIX。

通过采用上述技术方案，能够将合成的核酸组合物较长时间地保存于试剂盒中，使得疫情防控期间对2019-nCoV临床检测使用时更加方便。同时，正向引物、反向引物和探针独立包装的设置，能够减少本方案中的试剂盒在存储过程中正向引物、反向引物及探针之间发生聚合而失效的几率。

进一步地，所述正向引物、反向引物及探针为液态，所述酶混合物和PCR MIX为液态，所述PCR MIX中包含有PCR缓冲液、阳离子及dNTPs。

通过采用上述技术方案，液态的组分制备起来工序简单，制备成本低且制备速度快，便于检测试剂盒的大批量生产，符合当前新型冠状病毒肺炎疫情的防疫需求。通过酶混合物和PCR MIX的加入，当样本中存在2019-nCoV时，正向引物和反向引物及探针能够以dNTPs为原料，在酶混合物的促进下完成链延伸，从而实现目标基因反转录和扩增的效果。通过PCR缓冲液的加入，能够平衡PCR反应的酸碱度，以便反应正常进行。通过阳离子的加入，能够对PCR扩增的特异性和产量起到促进效果。

进一步地，所述正向引物、反向引物和探针为粉态，所述酶混合物和所述PCR MIX均为粉态，检测试剂盒内还包括粉态的冻干保护剂，粉态的核酸组合物、粉态的酶混合物、粉态的PCR MIX及粉态的冻干保护剂混合后冻干形成冻干粉反应试剂置于检测试剂盒内。

通过采用上述技术方案，为检测试剂盒提供了另一种剂型，虽然粉态的冻干粉反应试剂制备时加工工序多于液态，但是粉态的冻干粉反应试剂成品易于保存，易于运输，且使用时不容易发生交叉污染，使用起来相对于液态试剂会更加便捷。同时，本方案中的冻干粉反应试剂将检测试剂盒中的所有组分混匀后冻干，极大减少了检测时的加样步骤，进而减少加样失误，提高检测效率。采用冻干粉反应试剂能够有效减少检测过程中试剂反复冻融的问题，从而有利于本测试剂盒的扩增效率维持在较高水平。冻干过程中，检测试剂盒中的各组分会发生低温、冻结及脱水效应，这种情况下尤其酶混合物作为蛋白质其存在失活的风险，通过冻干保护剂的加入，能够减小冻干过程中活性组分的变性，维持冻干后冻干粉反应试剂的催化功能。

进一步地，所述酶混合物中包含有RNA酶抑制剂。

通过采用上述技术方案，由于2019-nCoV 为RNA病毒，而RNA稳定性较差，在自然环境下容易降解，通过RNA酶抑制剂的加入，能够减缓2019-nCoV在检测过程中的降解，使反转录顺利进行，从而准确检出样本中是否有2019-nCoV，减少因为2019-nCoV样本降解而出现的假阴性的检测结果，提高本检测试剂盒的可靠性。

进一步地，检测试剂盒内还包括阳性对照品，所述阳性对照品为含有目标基因序列的假病毒。

通过采用上述技术方案，在PCR扩增时，检测试剂盒中含有目标基因序列的假病毒能够作为阳性对照和被测样本做平行试验，以检测PCR扩增体系的配制、扩增程序以及检测实验操作是否正确。当加入有阳性对照品的体系出现扩增曲线，说明PCR扩增实验体系配制、扩增程序及检测操作正确，此时可根据样本有无扩增曲线来判读样本中是否检出2019-nCoV，因此，检测过程中阳性对照品的使用能够消除环境和人为操作带来的误差或错误，指示实验的有效性，减少结果判读过程中的变量，从而提高本方案中的检测试剂盒的检测准确性。

进一步地，所述酶混合物还包括DNA聚合酶和逆转录酶，所述DNA聚合酶选用热启动Taq酶，所述逆转录酶选自c-MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶中的一种。

通过采用上述技术方案，由于2019-nCoV 为RNA病毒，而PCR扩增的模板为DNA，所以本检测试剂盒中添加有逆转录酶，反应初始时，在逆转录酶的促进下首先将2019-nCoV中的目标基因通过一步法反转录为cDNA，之后该cDNA才能在DNA聚合酶的作用下实现目标基因的扩增。

进一步地，所述PCR缓冲液选用Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH=8.3。

通过采用上述技术方案，Tris为弱碱，其作为缓冲液有效的缓冲范围在pH7.0～9.2之间，Tris-HCl能够作为基础的缓冲成份，调节检测试剂盒反应过程中的酸碱度，维持PCR扩增体系的酸碱稳定，以免体系中的反应物和产物因酸碱度变化而出现变性的可能性，促使PCR扩增反应正常进行。

进一步地，所述阳离子包括K⁺和Mg²⁺，所述正向引物和反向引物在PCR扩增反应体系中的终浓度为50～250nmol/mL；所述探针在PCR扩增反应体系中的终浓度为50～200nmol/mL；所述酶混合物中各组分在PCR扩增反应体系中的终浓度为 10⁵U/L 热启动Taq酶，4×10⁶U/L 逆转录酶，8×10⁵U/L RNA酶抑制剂；所述PCR MIX各组分在PCR扩增反应体系中的终浓度为，50 mM Tris-HCl ，50 mM K⁺，3.5 mM Mg²⁺，0.2mM dNTPs。

通过采用上述技术方案，K⁺能够促进引物退火，对每个PCR反应进程起到加速作用。Mg²⁺一方面能够作为热启动Taq酶β亚基的激活剂，与热启动Taq酶螯合，使热启动Taq酶发挥活性；另一方面，Mg²⁺还是dNTPs的激活剂，主要用于吸引dNTPs的γ磷酸基团上的氧的电子，使得聚合反应更容易发生。因此通过K⁺和Mg²⁺的加入，能够对PCR反应起到促进作用。

为实现上述第三个目的，本发明提供了如下技术方案：

上述的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒生产方法，包括如下步骤，

S1：混合

将液态的终浓度为50～250nmol/mL的所述正向引物和反向引物、终浓度为50～200nmol/mL的所述探针及液态的酶混合物、PCR MIX以及液态的终浓度为0.2M的冻干保护剂混匀，获得反应混合液；

S2：冻干

将S1中的反应混合液冻干，获得所述冻干粉反应试剂，所述冻干程序为：

预冷冻，温度-15℃，预冷冻时间1.5小时；

升华，温度-4℃，升华时间 0.5小时；

解析干燥，温度10℃，解析干燥时间0.5小时：

加强干燥，温度25℃，加强干燥时间0.5小时。

通过采用上述技术方案，能够生产出冻干粉反应试剂，且该生产方法步骤简单，易于操作，适应大批量生产的需求。本方案中生产的冻干粉反应试剂投入使用时，能够即用即溶解，使检测更加便捷，同时冻干粉相对于液态的反应试剂而言性能更加稳定，不容易降解；而且通过冻干浓缩后使得检测试剂盒体积小，质量轻，更加适应长途运输，便于不同地区获取检测试剂盒。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1.本发明中根据2019-nCoV的特征序列设计并合成出能够特异性扩增2019-nCoV中目标基因的正向引物、反向引物及探针，提高了2019-nCoV核酸检测的准确性，能够减少检测假阴性结果发生的几率。

2.本发明中的检测试剂盒中包括了荧光定量PCR反应时所需的液态的正向引物、反向引物、探针、酶混合物、PCR MIX及RNA酶抑制剂，使得检测时只需要将采集的核酸样本和检测试剂盒中提供的配置好的液态试剂混合，加入DEPC H₂O便可反应，使医务人员在进行核酸检测时不用一一配置多种反应试剂，从而实现检测操作简单且步骤少、加样失误率低、检测效率高的效果。同时，液态的反应试剂易于制备，便于本方案中液态的检测试剂盒适应大批量生产。

3.本发明中提供的检测试剂盒的另一种粉状剂型，其将正向引物、反向引物、探针、酶混合物、PCR MIX、RNA酶抑制剂及冻干保护剂混合冻干形成一支冻干粉反应试剂，使得检测过程中不用多次加样，且使用时即用即溶解、方便快捷、使用和存储过程不易降解，能够进一步提高检测效率和检测结果的可靠性。同时粉状试剂更适应长途运输，方便了不同地区的医务人员获取本检测试剂盒。

附图说明

图1是性能检测实验1中的扩增曲线图。

图2是性能检测实验1中的标准曲线图。

图3是性能检测实验3中的扩增曲线图。

图4是性能检测实验4中的扩增曲线图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

制备例1

一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物：

通过全球流感序列数据库(GISAID)（www.gisaid.org）获得已公开的2019-nCoV的全基因组组序列和其他6种冠状病毒的全基因组序列，并在线（http://www.ebi.ac.uk/）对2019-nCoV的基因序列和其他6种冠状病毒进行序列比对分析，找到2019-nCoV全基因组序列上的特异性保守序列ORF3，该基因片段的碱基序列如序列表中的SEQ ID NO.4所示，以ORF3为指示基因，在ORF3上的序列上选择一段保守序列作为扩增的目标基因，该保守序列的碱基序列如序列表中的SEQ ID NO.5所示，利用实时TaqMan 荧光定量PCR 的设计软件BeaconDesigner7.0 ，针对ORF3上的目标基因，设计一个能够特异性扩增目标基因的正向引物，该正向引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，一个能够特异性扩增目标基因的反向引物，该反向引物的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示，并设计一个能够与目标基因特异性结合的探针，该探针的碱基序列如序列表中的SEQ ID NO.3所示。

利用ABI DNA 合成仪合成正向引物、反向引物及探针，并利用HAP、PAGE或HPLC方法中的一种，优选为PAGE纯化法对上述正、反向引物和探针进行纯化。合成探针时，在探针的5’端引入荧光报告基团FAM修饰， 3’端引入荧光淬灭基团BHQ1修饰，荧光报告基团FAM还可以用ROX、HEX、CY5或CY3中的一种替换，荧光淬灭基团BHQ1还可以用BHQ2替换，选用荧光基团时，FAM，HEX，CY3以BHQ1淬灭，ROX，CY5以BHQ2淬灭。

设计并合成的正向引物、反向引物和探针的结果如表1所示。

表1：正向引物、反向引物及探针的信息

SEQ ID NO.	引物	序列5’-3’	荧光标记基团
				1	正向引物	ATGAGCCTGAAGAACATGTCC
2	反向引物	TACCTTGGTTAAATACTACTTGGC
				3	探针	TAACAACTCCGGATGAACCGTCGAT	5’FAM；3’BHQ1

制备例2

阳性对照品：

构建含有目标基因SEQ ID NO.5的pUC57-T 重组质粒DNA，以该重组质粒DNA转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京索莱宝科技有限公司。增殖后的大肠杆菌DH5α用碱裂解法提取DNA，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测提取的DNA的A₂₆₀ 、A₂₈₀及浓度，获得假病毒颗粒作为阳性对照品。

实施例1

一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其包含有液态的正向引物、反向引物、探针、DNA聚合酶、逆转录酶、Tris-HCl、阳离子、dNTPs、RNA酶抑制剂及阳性对照品，其中正向引物、反向引物和探针为制备例1制得，阳性对照品为制备例2制得。正向引物、反向引物、探针及阳性对照品分别独立包装。

DNA聚合酶采用热启动Taq酶，逆转录酶选自c-MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶中的一种，优选为c-MMLV逆转录酶。RNA酶抑制剂选用RNasin，热启动Taq酶、c-MMLV逆转录酶和RNasin可分别独立包装也可至少两种混合，本实施例中热启动Taq酶、c-MMLV逆转录酶和RNasin按照表2中的终浓度混合为一支酶混合物包装。热启动Taq酶、c-MMLV逆转录酶及RNasin均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

Tris-HCl为市售分析纯，阳离子为K⁺和Mg²⁺，其中K⁺由KCl溶液提供，Mg²⁺由MgCl₂溶液提供，KCl和MgCl₂均为市售分析纯，dNTPs购自索莱宝。Tris-HCl、KCl、MgCl₂及dNTPs可分别独立包装，也可至少两种混合，本实施例中的Tris-HCl、KCl、MgCl₂及dNTPs按照表2中的终浓度混合成一支PCR MIX包装，能够使检测试剂盒使用时通过一次PCR MIX的加入，就能实现PCR缓冲液、阳离子及dNTPs这3种组分的加入，减少了临床检测时的加样次数，既减少了临床检测时加样过程中的操作失误，又能缩减检测时间，提高新型冠状病毒肺炎疫情的核酸检测效率。

本实施例中还提供了上述检测试剂盒检测时20ul的PCR扩增反应体系，其中正向引物和反向引物的终浓度均为50～250nmol/mL，优选为200nmol/m，探针的终浓度为50～250nmol/mL，优选为100nmol/mL，具体PCR扩增反应体系如表2所示。

表2：荧光定量PCR扩增反应体系（20 ul）

本实施例中还提供了该实施例中的检测试剂盒使用时的检测方法

S1:配置PCR扩增反应体系

将上表2中除待检测核酸样本以外的各组分混匀，分装入PCR板上的PCR孔内，每孔分装15ul，形成PCR反应加样孔，将PCR反应加样孔分为实验组和对照组，其中实验组中加入5ul的被测病毒样本作为待检测核酸样本，对照组中加入5ul制备例2中的阳性对照品作为待检测核酸样本，配置成20ul PCR扩增反应体系，上述操作均在无菌环境下进行。

S2：PCR扩增

将S1中含有实验组和对照组PCR扩增反应体系的PCR板放入博日LineGene9600plus荧光定量PCR仪内进行扩增，扩增程序为50℃ 15min，95℃ 3min，循环一次；95℃ 15s，60℃60 s，循环45次，荧光检测在60℃收集，荧光通道选用FAM。

S3：结果判读

对S2扩增得到的扩增曲线进行判读，若对照组有扩增曲线，说明实验体系配制和操作正确，实验结果有效，此时，若实验组有扩增曲线，则可判断该实验组检测到2019-nCoV，若实验组无扩增曲线，则可判断该实验组未检测到2019-nCoV；

对S2扩增得到的扩增曲线进行判读，若对照组无扩增曲线，说明本次实验无效，需重新进行。

实施例2

一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其包含有粉态的正向引物、反向引物、探针、DNA聚合酶、逆转录酶、Tris-HCl、阳离子、dNTPs、RNA酶抑制剂及冻干保护剂，还包括液态的阳性对照品，且正向引物、反向引物、探针、DNA聚合酶、逆转录酶、Tris-HCl、阳离子、dNTPs、RNA酶抑制剂及冻干保护剂为液态时混合后冻干形成一支冻干粉反应试剂置于检测试剂盒内，液态的阳性对照品独立包装于检测试剂盒内。其中正向引物、反向引物和探针为制备例1制得，阳性对照品为制备例2制得，冻干保护剂选用海藻糖，为市售分析纯，其余组分的来源与实施例1相同。

本实施例中还提供了上述用于2019-nCoV检测的检测试剂盒生产方法，其包括如下步骤：

S1：混合

将终浓度与实施例1相同的液态的正向引物、反向引物、探针、DNA聚合酶、逆转录酶、Tris-HCl、阳离子、dNTPs及RNA酶抑制剂混合，并加入海藻糖混匀，其余体积用DEPC-PCRH₂O补足，形成反应混合液，下表3示出1L反应混合液的配制；

表3:1L反应混合液

S2：冻干

将S1中配制的反应混合液分装入PCR管中，每孔分装20 ul，放入北京松源华兴LGJ-20F压盖型冻干机中冻干，获得上述冻干粉反应试剂，冻干程序为：预冷冻，温度-15℃，预冷冻时间1.5小时；

升华，温度-4℃，升华时间 0.5小时；

解析干燥，温度10℃，解析干燥时间0.5小时：

加强干燥，温度25℃，加强干燥时间0.5小时。

按照上述方法生产的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒中用于PCR反应的冻干粉反应试剂为干粉状，且每个分装有冻干粉反应试剂的PCR管中的PCR反应组分已按照PCR扩增反应体系中所需的终浓度配置，使用时即用即溶，便可形成一管液态的PCR反应混合液，只需单独加入被测核酸样本即可上机进行检测，不仅使用方便、检测所需时间短，且样本间不容易发生交叉污染，能够减少检测失误。

S1：配制PCR扩增反应体系

将装有冻干粉反应试剂的PCR管分为实验组和对照组，实验组和对照组的PCR管内分别加入13ul EPC-PCR H2O复溶，复溶后体积15ul，其中每个对照组的PCR管内分别加入5ul的被测病毒样本作为待检测核酸样本, 对照组中加入5ul制备例2中的阳性对照品作为待检测核酸样本，配制成20ul的PCR扩增反应体系，上述操作均在无菌环境下进行。

S2：PCR扩增

将S1中含有实验组和对照组PCR扩增反应体系的PCR管放入博日LineGene9600plus荧光定量PCR仪内进行扩增，扩增程序为50℃ 15min，95℃ 3min，循环一次；95℃ 15s，60℃60 s，循环45次，荧光检测在60℃收集，荧光通道选用FAM。

S3：结果判读

性能检测实验1

检测试剂盒的扩增效率

将制备例2中制备的阳性对照品梯度稀释，获得浓度为8x10⁵copies/μL，8x10⁴copies/μL，8x10³copies/μL，8x10² copies/μL，8x10¹ copies /μL，8 copies /μL，8x10^-1copies /μL 7种浓度，作为本性能检测实验中使用的待检测核酸样本。使用实施例1中的检测试剂盒，通过实施例1中确定的检测方法，对该7种浓度的待检测核酸样本进行检测，以复溶后的冻干粉反应试剂中加入5ul DEPC-PCR H₂O作为空白对照，扩增曲线如图1所示。

从图1可以看出，上述7种浓度均可检出荧光信号，表明本发明中的检测试剂盒能够成功对上述7种浓度的待检测核酸样本进行扩增，且检测下限精确至8x10^-1 copies /μL时，Ct值为30.49，可见本检测试剂盒具有高扩增效率。

参照图1的扩增曲线，获得如表4所示的上述各个浓度的Ct值。

表4：7种浓度待检测核酸样本扩增Ct值

浓度copies/μL	Ct值
		8x10<sup>5</sup>	17.16
8x10<sup>4</sup>	20.35
		8x10<sup>3</sup>	24
8x10<sup>2</sup>	27.27
		8x10<sup>1</sup>	30.49
8	33.47
		8x10<sup>-1</sup>	37.3

从图1可知，前6种浓度的扩增曲线呈光滑S形，扩增线性良好，因此，选用前6种浓度为标准品，以标准品拷贝数的对数为横坐标，以测得的Ct值为纵坐标，绘制如图2所示的标准曲线，标准曲线的Ct值在17.16～37.3之间。

参照图2可知，扩增效率为0.99797，相关系数R²为-0.99967，说明本发明中的扩增体系和检测试剂盒具有良好的扩增效率。另外，本发明中的检测试剂盒在实际对未知的病毒样本进行检测时，可根据未知样本扩增的Ct值，利用图2构建的标准曲线得到未知病毒样本的起始拷贝数，从而对未知样本中的2019-nCoV进行精确定量，判断出样本中的病原体浓度。

性能检测实验2

灵敏度测试

将制备例2中制备的阳性对照品依次稀释为6.4copies/μL，3.2 copies /μL，1.6copies/μL，0.8 copies/μL，0.4 copies/μL及0.2 copies/μL 6种浓度，作为灵敏度测试中使用的待检测核酸样本，通过实施例2中的检测试剂盒和确定的检测方法对该6种浓度的待检测核酸样本进行检测，每个浓度扩增20个重复，根据扩增曲线的有无及Ct值获得如表5所示的灵敏度测试结果。

表5：灵敏度测试结果

浓度copies/μL	检测平均Ct值	检出比例
			6.4	34.4	20/20
3.2	35.6	20/20
			1.6	36.4	20/20
0.8	37.5	20/20
			0.4	37.7	17/20
0.2	37.8	7/20

表5结果显示，在浓度低至0.8 copies/μL时，本发明中的检测试剂盒能100%检出阳性对照品，在浓度低至0.4 copies/μL时，本发明中的检测试剂盒检出率为85%，因此，本发明中的检测试剂盒在待检测核酸样本浓度较低时能够检出，可知本发明中的试剂盒灵敏度高，漏检风险小。

性能检测实验3

特异性检测

选取与2019-nCoV感染部位相同或感染症状相似的其他病原体：冠状病毒OC43、NL63、229E、HKU1、副流感病毒、甲型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、SARS冠状病毒及MERS冠状病毒和制备例2中制备的阳性对照品，使用实施例2中的检测试剂盒，通过实施例2中确定的检测方法，以上述病毒样本作为待检测核酸样本，分析本发明中的检测试剂盒的特异性，所有待检测核酸样本的检测浓度均为800copies/uL。其中冠状病毒OC43、NL63、229E、HKU1、副流感病毒、甲型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、SARS冠状病毒及MERS冠状病毒样本标准品购自英国朗道实验诊断有限公司（Randox）。

检测结果如图3所示，结果表明本发明的检测试剂盒对冠状病毒OC43、NL63、229E、HKU1、副流感病毒、甲型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、SARS冠状病毒及MERS冠状病毒样本的检测均为阴性，而对制备例2中制备的阳性对照品的检测结果为阳性，表明本发明试剂盒具有较高的特异性。

性能检测试验4

临床样本检测

从南京市疾控中心病毒实验室获取48个临床收集的2019-nCoV咽拭子样本，其中南京市疾控中心病毒实验室已检测出该48个临床收集的2019-nCoV样本中含有8个阳性样本，40个阴性样本。利用杭州博日核酸提取试剂盒BSC57提取上述48个样本中的RNA，利用分光光度计检测洗脱液的A₂₆₀、A₂₈₀及浓度，检测浓度大于0.8 copies/μL，且1.7 < A₂₆₀/ A₂₈₀<2.0后，取5ul洗脱液，使用实施例2中的检测试剂盒，通过实施例2中确定的检测方法，对上述48个临床样本进行盲测，典型检测结果如图4所示。

由图4可知，本发明中的检测试剂盒检出8例阳性，40 例阴性，且检出样本信息与南京市疾控中心病毒实验室存样信息吻合，说明本发明中的试剂盒具有良好的临床检测效果。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

序列表

<110> 南京黎明生物制品有限公司

<120> 一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

atgagcctga agaacatgtc c 21

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

taccttggtt aaatactact tggc 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

taacaactcc ggatgaaccg tcgat 25

<210> 4

<211> 828

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

atggatttgt ttatgagaat cttcacaatt ggaactgtaa ctttgaagca aggtgaaatc 60

aaggatgcta ctccttcaga ttttgttcgc gctactgcaa cgataccgat acaagcctca 120

ctccctttcg gatggcttat tgttggcgtt gcacttcttg ctgtttttca gagcgcttcc 180

aaaatcataa ccctcaaaaa gagatggcaa ctagcactct ccaagggtgt tcactttgtt 240

tgcaacttgc tgttgttgtt tgtaacagtt tactcacacc ttttgctcgt tgctgctggc 300

cttgaagccc cttttctcta tctttatgct ttagtctact tcttgcagag tataaacttt 360

gtaagaataa taatgaggct ttggctttgc tggaaatgcc gttccaaaaa cccattactt 420

tatgatgcca actattttct ttgctggcat actaattgtt acgactattg tataccttac 480

aatagtgtaa cttcttcaat tgtcattact tcaggtgatg gcacaacaag tcctatttct 540

gaacatgact accagattgg tggttatact gaaaaatggg aatctggagt aaaagactgt 600

gttgtattac acagttactt cacttcagac tattaccagc tgtactcaac tcaattgagt 660

acagacactg gtgttgaaca tgttaccttc ttcatctaca ataaaattgt tgatgagcct 720

gaagaacatg tccaaattca cacaatcgac ggttcatccg gagttgttaa tccagtaatg 780

gaaccaattt atgatgaacc gacgacgact actagcgtgc ctttgtaa 828

<210> 5

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

gagcctgaag aacatgtcca aattcacaca atcgacggtt catccggagt tgttaatcca 60

gtaatggaac caatttatga tgaaccg 87

Claims

1.一种用于2019-nCoV检测的核酸组合物，所述核酸组合物包括正向引物、反向引物和探针，其特征在于，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示；

所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；

所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示；

2.一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的正向引物、反向引物和探针，且所述正向引物、反向引物和探针独立包装，还包括酶混合物和PCRMIX。

3.根据权利要求2所述的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其特征在于，所述正向引物、反向引物及探针为液态，所述酶混合物和PCR MIX为液态，所述PCR MIX中包含有PCR缓冲液、阳离子及dNTPs。

4.根据权利要求2所述的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其特征在于，所述正向引物、反向引物和探针为粉态，所述酶混合物和所述PCR MIX均为粉态，检测试剂盒内还包括粉态的冻干保护剂，粉态的核酸组合物、粉态的酶混合物、粉态的PCR MIX及粉态的冻干保护剂混合后冻干形成冻干粉反应试剂置于检测试剂盒内。

5.根据权利要求3或4所述的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其特征在于，所述酶混合物中包含有RNA酶抑制剂。

6.根据权利要求3或4所述的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒内还包括阳性对照品，所述阳性对照品为含有目标基因序列的假病毒。

7.根据权利要求3或4所述的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其特征在于，所述酶混合物还包括DNA聚合酶和逆转录酶，所述DNA聚合酶选用热启动Taq酶，所述逆转录酶选自c-MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶中的一种。

8.根据权利要求3或4所述的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液选用Tris-HCl，所述Tris-HCl的pH=8.3。

9.根据权利要求3或4所述的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒，其特征在于，所述阳离子包括K⁺和Mg²⁺，所述正向引物和反向引物在PCR扩增反应体系中的终浓度为50～250nmol/mL；所述探针在PCR扩增反应体系中的终浓度为50～200nmol/mL；所述酶混合物中各组分在PCR扩增反应体系中的终浓度为 10⁵U/L 热启动Taq酶，4×10⁶U/L 逆转录酶，8×10⁵U/L RNA酶抑制剂；所述PCR MIX各组分在PCR扩增反应体系中的终浓度为，50 mM Tris-HCl ，50 mM K⁺，3.5 mM Mg²⁺，0.2mM dNTPs 。

10.如权利要求4所述的一种用于2019-nCoV检测的检测试剂盒生产方法，其特征在于，包括如下步骤，

S1：混合

S2：冻干

预冷冻，温度-15℃，预冷冻时间1.5小时；

升华，温度-4℃，升华时间 0.5小时；

解析干燥，温度10℃，解析干燥时间0.5小时：

加强干燥，温度25℃，加强干燥时间0.5小时。