CN111926120B - 一种用于2019-nCoV M基因检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种用于2019‑nCoV M基因检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法，属于病毒体外核酸检测技术领域。本申请的用于检测2019‑nCoV M基因的核酸组合物，包括三组引物探针组合中的任意一组，每组引物探针组合均包括正向引物、反向引物和探针；本申请还提供了一种包括上述任意一组引物探针组合的检测试剂盒，试剂盒中还包括酶混合物和PCR缓冲液、阳离子及dNTPs，该检测试剂盒可以制备成液态或粉态。本申请的核酸组合物和检测试剂盒可以对2019‑nCoV M基因中的目标基因进行特异性扩增，灵敏度高，降低了假性结果出现的几率，检测结果准确可靠。

Description

一种用于2019-nCoV M基因检测的核酸组合物及其试剂盒与 生产方法
技术领域
本申请涉及病毒体外核酸检测技术领域，特别涉及一种用于2019-nCoV M基因检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法。
背景技术
2019年12月以来，陆续发现了多例不明原因肺炎病例，现已证实为一种新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病。2020年1月12日，世界卫生组织将引起本次病毒性肺炎病例的病原体命名为2019-nCoV，2020年2月11日被国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2。
2019-nCoV为RNA病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，具有极强的传染性，主要经呼吸道飞沫传播（喷嚏、咳嗽）和接触传染，主要引起人类呼吸系统感染，感染者常出现发热、乏力、干咳，逐渐出现呼吸困难等症状，多数患者预后良好，部分患者起病症状轻微，无明显发热，严重者出现急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒及凝血功能障碍等症状，病情危重者可导致死亡。2019-nCoV是第7个已报导可感染人的冠状病毒，其余6个分别为HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63，HCoV-HKU1及MERS-HCoV。其中HCoV-229E 和HCoV-NL63属于α属冠状病毒，HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV与2019-nCoV均为β属冠状病毒。
核酸检测是临床病原学诊断的常用方法，具有灵敏高、特异性强等优点。新型冠状病毒肺炎疫情发生以来，核酸检测是临床诊断、解除隔离、康复出院的重要诊断依据。基于TaqMan探针法的实时荧光PCR技术具有简单、快速、准确的优势，已广泛应用于临床病原体的检测，在2003年我国爆发的SRAS病毒的疫情控制方面做出重要贡献，是WHO推荐的MERS-CoV病毒检测方法之一，目前实时荧光RT-PCR技术已被列入我国2019-nCoV诊疗指南。
自疫情发生以来，国内外陆续涌现出了2019-nCoV核酸检测试剂盒，但是，从目前临床实际使用情况来看，现有的核酸检测试剂盒仍然存在假阴性的情况，会造成漏检，给疫情防控带来很大的隐患。其假阴性的原因可能是使用的引物序列都存在或多或少的引物区突变，特异性不高，从而无法特异性地扩增出目标基因，因此无法检测出样本中病毒的存在。鉴于此，目前仍需继续研发特异性高的核酸检测方案，以改善现有的核酸检测试剂盒存在的假阴性问题。
发明内容
针对现有的2019-nCoV核酸检测存在假阴性问题，本申请的目的是提供一种用于2019-nCoV M基因检测的核酸组合物，本申请的引物和探针组合能够特异性的扩增2019-nCoV M基因中的目标基因，且灵敏度高，从而能够准确的指示样品中2019-nCoV病毒的存在。
本申请的第二个目的在于提供一种用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒，本申请试剂盒较少的操作步骤可有效降低操作失误率，且检测时间短、检测效果准确可靠。
本申请的第三个目的在于提供一种用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒生产方法，本申请只需要将基因扩增所用试剂进行混合冻干便可生产获得2019-nCoV检测试剂盒，生产方法简单，适合大规模生产。
为了实现上述第一个目的，本申请是通过以下技术方案得以实现的：
一种用于2019-nCoV M基因检测的核酸组合物，包括三组引物探针组合中的任意一组，每组引物探针组合均包括正向引物、反向引物和探针；
第一组正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示；
第一组反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；
第一组探针的序列如SEQ ID NO.3所示；
第二组正向引物的序列如SEQ ID NO.4所示；
第二组反向引物的序列如SEQ ID NO.5所示；
第二组探针的序列如SEQ ID NO.6所示；
第三组正向引物的序列如SEQ ID NO.7所示；
第三组反向引物的序列如SEQ ID NO.8所示；
第三组探针的序列如SEQ ID NO.9所示；
所述三组引物探针组合中的探针5’端均采用荧光报告基团修饰，探针的3’端均采用荧光淬灭基团修饰。
通过采用上述技术方案，本申请首先分析了2019-nCoV的病毒结构，其表现出典型的冠状病毒属结构：5’非翻译区(UTR)、 复制酶复合体(orf1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因、3’UTR，以及几个未识别的非结构开放阅读框。其中M基因编码的M蛋白是一种跨膜蛋白，被认为是冠状病毒颗粒组装过程中的又一关键信号。由于M基因在病毒增殖中的重要性以及M基因的保守性，所以，本申请针对2019-nCoV的M基因进行引物和探针的设计和筛选。
本申请从全球流感序列数据库(GISAID)（www.gisaid.org）下载了3295个全基因组序列，通过序列比对并与其他六种冠状病毒基因组数据分析比对，在新型冠状病毒的M基因上设计了三组引物探针组合，设计获得的引物探针组合与3295个全基因组序列完全匹配，无突变。而且每条序列与其他6种新冠病毒基因的一致性均低于80%；与其他呼吸道病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒序列一致性均低于60%。在NCBI数据库里，扩增引物对2019-nCoV病毒以外的物种无匹配结果。本申请的三组引物探针组合能够特异性的扩增2019-nCoV M基因上的目标基因，对其他物种、其他病毒，甚至是其他新冠病毒均无特异扩增，从而能够准确的检测出样品中的2019-nCoV病毒，降低实验结果假阴性的发生率，提高检测结果的准确性。
为了实现上述第二个目的，本申请提供了一种用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒，包括上述三组引物探针组合中的任意一组、酶混合物和PCR缓冲液、阳离子及dNTPs。
通过采用上述技术方案，本申请将引物探针组合以及酶混合物和PCR缓冲液、阳离子及dNTPs制备成试剂盒的形式，一方面方便了2019-nCoV病毒的检测，缩短了检测时间，降低了检测操作的复杂性，降低操作失误率；另一方面试剂盒的形式便于检测试剂的储存、运输和销售，从而保证了试剂中有效成分的稳定性，进一步的保证了检测结果的准确性。
本申请的PCR缓冲液能够在PCR反应体系中起到缓冲作用，为酶混合物提供一个最适酶催化反应的条件，从而保证酶的有效性和高效性。本申请的阳离子能够对PCR反应起到促进作用，加快PCR反应进程，缩短整个检测时间。本申请的dNTP是聚合酶链式反应的原料，保证了PCR反应的正常进行。
进一步的，所述PCR缓冲液为pH=8.3的Tris-HCl缓冲液。
进一步的，所述阳离子包括K+和Mg2+。
通过采用上述技术方案，本申请的K+能够促进引物退火，使引物与目的基因快速且特异性的配对，加速PCR反应进程。本申请的Mg2+作为热启动Taq酶β亚基的激活剂，能够与热启动Taq酶螯合，使热启动Taq酶发挥活性，另外，Mg2+还可以吸引dNTPs中γ磷酸基团上的氧的电子，从而激活dNTPs，使得聚合反应更容易进行。
进一步的，所述酶混合物包括热启动Taq酶、c-MMLV酶和RNasin。
通过采用上述技术方案，本申请的c-MMLV酶为逆转录酶，c-MMLV酶将样品中的RNA逆转录为DNA，逆转录获得的cDNA在热启动Taq酶的作用下实现目标基因的扩增，从而在荧光标记基团的作用下实现对样品中2019-nCoV病毒的荧光定量。本申请的RNasin是一种RNA酶抑制剂，可以有效抑制RNA酶的活性，从而降低了待测样品中RNA被降解的可能性，减少因样本被降解而出现假阴性发生的概率。
进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照品，所述阳性对照品为含有目标基因序列的假病毒。
通过采用上述技术方案，本申请中的阳性对照品可以验证PCR反应体系、反应过程中是否存在操作失误之处，从而排除了人为因素造成的实验错误，指示实验结果的有效性和准确性。
进一步的，所述引物探针组合、酶混合物和PCR缓冲液、阳离子及dNTPs均为液态，或引物探针组合、酶混合物和PCR缓冲液、阳离子及dNTPs均为粉态。
通过采用上述技术方案，本申请试剂盒中的试剂可以为液态形式也可以为粉态形式。液态形式的试剂制备速度快，成本较低。另外，本申请可以将液态形式的引物探针组合中的正向引物、反向引物以及探针单独包装，降低试剂盒在储存过程中因引物探针相互聚合而失效的风险。粉态形式的试剂由于将检测所需的所有试剂都进行混合冻干，检测时只需要加入DEPC H2O复溶即可进行病毒检测，极大的简化了操作步骤，在疫情时间紧迫的情况下，进一步降低了人为操作可能带来的失误或错误的发生率，从而提高了检测结果的可靠性。
进一步的，所述引物探针组合、酶混合物和PCR缓冲液、阳离子及dNTPs均为粉态时，所述试剂盒中还包括粉态的冻干保护剂。
通过采用上述技术方案，本申请在检测有效成分中加入冻干保护剂，冻干保护剂可以防止酶混合物在冻干过程中变性，从而保证了酶混合物在冻干检测试剂中的活性，保证了检测过程的顺利进行。
为了实现上述第三个目的，本申请提供了一种用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒生产方法，包括以下步骤：
a.将液态的引物探针组合，液态的酶混合物和PCR缓冲液、阳离子及dNTPs以及液态的冻干保护剂进行混合，得到反应混合物溶液；
其中，引物探针组合中正向引物和反向引物的终浓度均为50～250nmol/mL，探针的终浓度均为50～200nmol/mL；
b.将步骤a获得的反应混合物溶液进行冻干，获得冻干粉检测试剂。
通过采用上述技术方案，本申请冻干检测试剂的制备方法简单，只需要先将液态的检测试剂混合，然后再冻干即可。检测试剂冻干后可解决检测过程中由于试剂不能一次用完，而出现的试剂反复冻融的问题，这是因为试剂反复冻融增大了试剂失活的可能性，不利于扩增效率维持在较高水平。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请的核酸组合物能够特异性的扩增2019-nCoV病毒M基因中的目标基因，从而准确的检测出样品中2019-nCoV病毒的存在，特异性好，灵敏度高，降低了检测结果假阴性的发生几率；
2、本申请将引物探针组合、酶混合物以及PCR缓冲液、阳离子及dNTPs制备成含有液态试剂或粉态试剂的试剂盒，简化了2019-nCoV病毒检测的操作步骤，尤其是含有冻干粉检测试剂的试剂盒，检测时只需要加入DEPC H2O进行复溶便可对样品进行检测，极大的降低了操作的失误率，提高了检测结果的可靠性；
3、本申请的粉态试剂盒的制备方法简单，且冻干后的试剂有效性能够保证，适合大规模生产。另外，粉态试剂盒体积较小，更加便于储存、运输和销售，更好的满足目前全国对2019-nCoV病毒检测的需要。
附图说明
图1是本申请性能检测实验2中待测样本检测浓度为6.4 copies/μL时的荧光定量PCR扩增曲线图；
图2是本申请性能检测实验3中的扩增曲线图；
图3是本申请性能检测实验3中的扩增标准曲线图；
图4是本申请性能检测实验4中的扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
制备例1
一种用于2019-nCoV M基因检测的核酸组合物
本申请从全球流感序列数据库(GISAID)下载了3295个全基因组序列，通过序列比对并与其他六种冠状病毒基因组数据分析比对，利用实时TaqMan 荧光定量PCR 的设计软件BeaconDesigner7.0，在2019-nCoV M基因上设计了三组引物探针组合，设计的引物探针组合与3295个全基因组序列完全匹配，无突变。而且每条序列与其他6种新冠病毒基因的一致性低于80%；与其他呼吸道病毒，流感病毒、呼吸道合胞病毒序列一致性低于60%。在NCBI数据库里，扩增引物对2019-nCoV病毒以外的物种无匹配结果。
本申请中三组引物探针组合的序列信息参见表1。
Figure 252728DEST_PATH_IMAGE001
三组引物探针组合中的探针5’端标记可以选用FAM荧光基团、ROX荧光基团、HEX荧光基团、CY3基团及CY5基团中的任意一种，3’ 端标记对应的淬灭基团为FAM、HEX、CY3以BHQ1淬灭；ROX、CY5以BHQ2淬灭。优选地，5’端选用FAM荧光基团标记，3’端选用BHQ1标记。
本申请的引物探针组合均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，每组探针的荧光标记基团在合成时已经引入。
制备例2
阳性对照品的制备
按照NCBI上公开的2019-nCoV M基因序列构建含扩增区域的pUC57-T 重组质粒DNA，以该重组质粒DNA转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自北京索莱宝科技有限公司）。增殖后的大肠杆菌DH5α用碱裂解法提取DNA，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测提取的DNA的A260 、A280及浓度，获得作为阳性对照品的假病毒颗粒，浓度为109copies/mL。
实施例1
一种用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒，其包括制备例1的三组引物探针组合中的任意一组、Tris-HCl (pH=8.3)、KCl、MgCl2、dNTPs、热启动Taq酶、c-MMLV酶和RNasin，以及实施例2制备的阳性对照品，以上试剂均为液态。
采用上述试剂盒进行2019-nCoV 病毒检测配置反应体系时，每种引物的终浓度为50～250nmol/mL，每种探针的终浓度为50～200nmol/mL。特别优选地，每种引物的终浓度为200nmol/mL，每种探针的终浓度为100nmol/mL。热启动Taq酶、c-MMLV酶和RNasin的终浓度分别为105U/L、4×106U/L、8×105U/L。dNTPs、Tris-HCl (pH=8.3)、KCl和MgCl2 的终浓度分别为200 μM、50 mM、50 mM、3.5 mM。本申请试剂盒中的热启动Taq酶、c-MMLV酶和RNasin可以预先混合成酶混合物；dNTPs、Tris-HCl (pH=8.3)、KCl和MgCl2可以预先混合，在配置反应体系时，能够提高操作速度，降低加样错误发生率。
本实施例以20μL的反应体系为例，每种试剂的具体加入量参见表2。在试剂盒的使用过程中，如果需要扩大反应体系，可以等比例增加各试剂的加入量。
Figure 701027DEST_PATH_IMAGE002
本实施例中正向引物、反向引物和探针可采用制备例1中三组引物探针组合的任意一组。
在采用本实施例的试剂盒进行2019-nCoV病毒检测时，将表2中除待检测样本以外的各组分混匀，分装入PCR管内，每管分装15μL，然后向每个PCR管中加入待测样本，将待测样本分为对照组和实验组，对照组中的待测样本为制备例2中制备的假病毒颗粒，作为阳性对照；实验组中的待测样本为被测病毒样本。
将配置好的上述反应体系用博日LineGene9600plus荧光定量PCR系统进行检测，循环参数设置如下：50℃×15min，95℃×3min；95℃×15s，60℃×60 s，循环40次，荧光检测在60℃。荧光通道选择：选用FAM通道。
对扩增曲线进行判读，若对照组有扩增曲线，说明扩增体系配制正确且操作准确，实验结果有效，此时若实验组有扩增曲线，则可判断待测样品中存在2019-nCoV病毒，若实验组无扩增曲线，则可判断待测样品中无2019-nCoV病毒。若对照组无扩增曲线，说明本次实验无效，需重新进行实验。
实施例2
一种用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒，其包括制备例1的三组引物探针组合中的任意一组、Tris-HCl (pH=8.3)、KCl、MgCl2、dNTPs、热启动Taq酶、c-MMLV酶、RNasin和冻干保护剂，将上述试剂在液态时进行混合冻干，制备成冻干检测试剂。除冻干保护剂外，以上组分在保证其在总反应体系中终浓度与实施例1相同的前提下，按照表2公开的加入量进行等比例扩大。本实施例的冻干保护剂选用海藻糖（市售分析纯），在反应体系中的终浓度为0.2M。另外，本实施例的试剂盒中还包括制备例2制备获得的液态的阳性对照品，单独包装。
本申请实施例还提供了一种用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒生产方法，包括以下步骤：
a.将终浓度与实施例1相同的液态引物探针组合，液态的酶混合物和dNTPs、Tris-HCl (pH=8.3)、KCl和MgCl2以及海藻糖进行混合，其余体积用DEPC-PCR H2O补足，得到反应混合物溶液；
b.将步骤a获得的反应混合物溶液分装入PCR管中，每管分装15μL，放入LGJ-20F压盖型冻干机（北京松源华兴）中冻干，获得冻干检测试剂。冻干程序为：
预冷冻，温度设定为-15℃，预冷冻时间1.5小时；
升华，温度设定为-4℃，升华时间 0.5小时；
解析干燥，温度设定为10℃，解析干燥时间0.5小时：
加强干燥，温度设定为25℃，加强干燥时间0.5小时。
在使用本实施例试剂盒时，向含有冻干检测试剂的PCR管中加入13μL DEPC-PCRH2O复溶，复溶后体积15μL，然后加入5μL待测样本（待测样本分为对照组和实验组），按照实施例1的检测方法进行检测和实验结果判定即可。本实施例的冻干粉态检测试剂即用即溶，不存在检测试剂因反复冻融而出现有效性降低问题，检测结果可靠。
性能检测实验
1.引物探针组合扩增效率测定
采用实施例1的扩增体系和扩增条件，待测样本选用制备例2制备的阳性对照品，浓度梯度为106-103copies/μL，每个浓度重复3次，检测本申请三组引物探针组合的扩增效率。三组引物探针组合扩增获得的序列以及检测结果参见表3。
Figure 887288DEST_PATH_IMAGE003
从表3可以看出第一组引物探针组合相较于其它两组，扩增效率最好，高达97.11%。由于本申请第一组引物探针组合的扩增效率最好，所以本申请的以下性能测试均采用第一组引物探针组合进行。
2.灵敏度测试
第一组引物探针组合的灵敏度测试实验采用实施例2的扩增体系和扩增条件。向实施例2的含有冻干检测试剂的PCR管中加入13μL DEPC H2O复溶(复溶之后体积为15μL)，再加入5μL梯度稀释的制备例2制备的阳性对照品作为待测样本，浓度分别为0.1copies/μL，0.2 copies/μL，0.4 copies/μL，0.8 copies/μL，1.6copies/μL，3.2copies/μL，6.4copies/μL，测试扩增体系的检测灵敏度，每个浓度扩增20个重复，根据扩增曲线的有无及Ct值获得灵敏度测试结果，实验结果参见表4。
Figure 813656DEST_PATH_IMAGE004
从表4可以看出，在待测样本浓度低至0.4 copies/μL时，本申请试剂盒可以全部检出，本申请试剂盒的检测灵敏度为0.4 copies/μL；在待测样本浓度为0.2 copies/μL时，本申请试剂盒的检出率也高达85%。以上实验结果表明，本申请试剂盒在待测样本中2019-nCoV病毒含量较低时也可以保持很高的检出率，灵敏度非常高，降低了漏检的风险。图1为待测样本检测浓度为6.4 copies/μL时的扩增曲线。
3.线性范围测试
第一组引物探针组合的线性范围测试实验采用实施例2的扩增体系和扩增条件。向实施例2的含有冻干检测试剂的PCR管中加入13μL DEPC H2O复溶(复溶之后体积为15μL)，再加入5μL梯度稀释的制备例2制备的阳性对照品作为待测样本，浓度分别为800000copies/μL，80000 copies/μL，8000copies/μL，800 copies/μL，80 copies/μL，8 copies/μL，0.8 copies/μL，测试扩增体系的线性范围和扩增效率，每个浓度扩增3个重复。以上7种浓度的待测核酸样本扩增Ct值如表5所示，扩增曲线如图2所示；以前6个浓度构建标准曲线，标准曲线如图3所示。
Figure 283821DEST_PATH_IMAGE005
从表5和图2可以看出，以上7种浓度均可检测出荧光信号，选用前6个浓度的拷贝数的对数为横坐标，以测得的Ct值为纵坐标构建标准曲线，如图3所示，本申请扩增体系的相关系数R2为-0.999，线性度良好；扩增效率为1.011，扩增效率良好。
在使用本申请的试剂盒对2019-nCoV病毒进行检测时，可根据待测样本扩增的Ct值，利用图3的扩增标准曲线，进而计算出待测样本中2019-nCoV病毒的拷贝数，从而实现对待测样本中病毒的定量检测。
4. 特异性测试
采用本申请实施例2的检测试剂盒以及检测方法对与2019-nCoV病毒感染部位相同或感染症状相似的其他10种病原体（冠状病毒OC43、NL63、229E、HKU1、副流感病毒、甲型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、SARS冠状病毒及MERS冠状病毒）进行检测，并以制备例2制备的阳性对照品为阳性对照，分析本申请试剂盒扩增体系的特异性。
本申请的冠状病毒OC43、NL63、229E、HKU1、副流感病毒、甲型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、SARS冠状病毒及MERS冠状病毒样本标准品购自英国朗道实验诊断有限公司（Randox）。
将制备例2的阳性对照品分别与冠状病毒OC43、NL63、229E、HKU1、副流感病毒、甲型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、SARS冠状病毒及MERS冠状病毒样本混合，混合液中新冠假病毒颗粒浓度为500copies/mL，冠状病毒OC43、NL63、229E、HKU1、副流感病毒、甲型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、SARS冠状病毒及MERS冠状病毒浓度为106copies/mL。
图4为制备例2的阳性对照品和冠状病毒OC43的混合液作为待测样本时，本试剂盒的特异性测试结果图，从图4中可以看出，本申请的阳性对照能够扩增出一条曲线，而冠状病毒OC43无扩增曲线。本申请只给出了阳性对照品和冠状病毒OC43混合液的特异性实验结果图，其余9种病原体的实验结果与冠状病毒OC43相同，均无扩增曲线形成。以上实验结果表明，本申请试剂盒的引物探针组合特异性好，降低了假阳性发生的几率。
本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 南京黎明生物制品有限公司
<120> 一种用于2019-nCoV M基因检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
cgcgttccat gtggtcattc 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
atgtccacga aggatcacag ct 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
tctcaacgtg ccactccatg gc 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
gaccgcttct agaaagtgaa ctcgt 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
tcgtgatgta gcaacagtga tttct 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
cggagctgtg atccttcgtg gac 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
gctacatcac gaacgctttc tta 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
actgctactg gaatggtctg tgt 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
cgcagcgtgt agcaggtgac 20
<210> 10
<211> 128
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
cgcgttccat gtggtcattc aatccagaaa ctaacattct tctcaacgtg ccactccatg 60
gcactattct gaccagaccg cttctagaaa gtgaactcgt aatcggagct gtgatccttc 120
gtggacat 128
<210> 11
<211> 131
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 11
gaccgcttct agaaagtgaa ctcgtaatcg gagctgtgat ccttcgtgga catcttcgta 60
ttgctggaca ccatctagga cgctgtgaca tcaaggacct gcctaaagaa atcactgttg 120
ctacatcacg a 131
<210> 12
<211> 119
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
acgctttctt attacaaatt gggagcttcg cagcgtgtag caggtgactc aggttttgct 60
gcatacagtc gctacaggat tggcaactat aaattaaaca cagaccattc cagtagcag 119

Claims (9)

1.一种用于2019-nCoV M基因检测的核酸组合物，其特征在于：包括引物探针组合，引物探针组合包括正向引物、反向引物和探针；
正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示；
反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；
探针的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述引物探针组合中的探针5’端采用荧光报告基团修饰，探针的3’端采用荧光淬灭基团修饰。
2.一种用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物探针组合、酶混合物和PCR缓冲液、阳离子及dNTPs。
3.根据权利要求2所述的一种用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液为pH=8.3的Tris-HCl缓冲液。
4.根据权利要求2所述的一种用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒，其特征在于：所述阳离子包括K+和Mg2+。
5.根据权利要求2所述的一种用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒，其特征在于：所述酶混合物包括热启动Taq酶、c-MMLV酶和RNasin。
6.根据权利要求2所述的一种用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照品，所述阳性对照品为含有目标基因序列的假病毒。
7.根据权利要求2-6任一所述的一种用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒，其特征在于：所述引物探针组合、酶混合物和PCR缓冲液、阳离子及dNTPs均为液态，或引物探针组合、酶混合物和PCR缓冲液、阳离子及dNTPs均为粉态。
8.根据权利要求7所述的一种用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒，其特征在于：所述引物探针组合、酶混合物和PCR缓冲液、阳离子及dNTPs均为粉态时，所述试剂盒中还包括粉态的冻干保护剂。
9.一种权利要求8所述的用于2019-nCoV M基因检测的试剂盒生产方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.将液态的引物探针组合，液态的酶混合物和PCR缓冲液、阳离子及dNTPs以及液态的冻干保护剂进行混合，得到反应混合物溶液；
其中，引物探针组合中正向引物和反向引物的终浓度均为50～250nmol/mL，探针的终浓度为50～200nmol/mL；
b.将步骤a获得的反应混合物溶液进行冻干，获得冻干粉检测试剂。
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