CN112553373A - 用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN112553373A CN202011442596.2A CN202011442596A CN112553373A CN 112553373 A CN112553373 A CN 112553373A CN 202011442596 A CN202011442596 A CN 202011442596A CN 112553373 A CN112553373 A CN 112553373A
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Beijing Chaoyang Hospital
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Abstract

本发明公开了一种用于新型冠状病毒2019‑nCoV核酸快速检测的试剂盒及检测方法，该试剂盒包括2019‑nCoV ORF1ab反应液、2019‑nCoV N反应液、RT‑RPA反应管、RT‑RPA反应缓冲液、RT‑RPA反应启动液、阳性质控品、阴性质控品。本发明的用于新型冠状病毒2019‑nCoV核酸快速检测的试剂盒及检测方法通过RT‑RPA技术实现恒温核酸快速扩增，并配合RPA技术的exo荧光探针检测，应用实时荧光RPA监测仪，能快速检测咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等样本中新型冠状病毒2019‑nCoV的ORF1ab和N基因，可用于新型冠状病毒2019‑nCoV临床早期诊断、疫情防控及科学研究。

Description

用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明涉及冠状病毒检测技术领域，具体来说，涉及一种用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒及检测方法。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV)感染是一种传染性极强的感染性疾病，其主要临床表现从轻微呼吸道感染症状、消化系统症状等，到严重的呼吸系统感染导致急性呼吸衰竭而死亡。新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。目前研究显示2019-nCoV与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85％以上，因此2019-nCoV应归入“SARS样”或者“类SARS”的冠状病毒。2019-nCoV与SARS同属于ⅡB组的β冠状病毒，该病毒属于单股正链RNA病毒，其基因组长度约为30,000bp，在目前已知的RNA病毒中是最大的，具有很强的感染性和致死率。近期研究发现，该病毒潜伏期最长可达14天，并且处于潜伏期的病人依然具有很强感染性。由此可见，针对2019-nCoV的快速准确的检测对于新型冠状病毒感染的肺炎的及时诊断及疫情的防控至关重要。
目前针对2019-nCoV的核酸检测，应用最为广泛的是基于Taqman探针法的实时荧光定量PCR技术。该方法在探针的5′端和3′端分别标记报告基团(R)和淬灭基团(Q)，构成能量传递结构。当探针完整时，R基团发出的荧光被Q基团所抑制，不能发出荧光，而当探针被分解后，抑制作用解除，R基团发出荧光。随着PCR产物的增加，荧光信号也同步增加。可通过检测系统观察到信号的变化，从而实现实时定量分析。虽然Taqman探针法荧光定量PCR对于2019-nCoV的核酸检测敏感性高，特异性强，但需要专业的实验室和昂贵的仪器设备，操作复杂，专业性要求高，且用时较长，难以在疫情突发时满足基层单位筛查防控的需求。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒及检测方法，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒，包括2019-nCoVORF1ab反应液、2019-nCoV N反应液、RT-RPA反应管、RT-RPA反应缓冲液、RT-RPA反应启动液、阳性质控品、阴性质控品；
所述2019-nCoV ORF1ab反应液包含特异性检测2019-nCoV ORF1ab基因特异性保守区域的RPA扩增引物和exo荧光探针、特异性检测内参基因RNaseP的RPA扩增引物和exo荧光探针，所述2019-nCoV N反应液包含特异性检测2019-nCoV N基因特异性保守区域的RPA扩增引物和exo荧光探针、特异性检测内参基因RNaseP的RPA扩增引物和exo荧光探针；
所述特异性检测2019-nCoV ORF1ab基因特异性保守区域的RPA扩增引物中，上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；所述特异性检测2019-nCoV N基因特异性保守区域的RPA扩增引物中，上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；所述特异性检测内参基因RNaseP基因的RPA扩增引物中，上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示；
所述特异性检测2019-nCoV ORF1ab基因特异性保守区域的exo荧光探针的序列如SEQ ID NO:7所示，所述特异性检测2019-nCoV N基因特异性保守区域的exo荧光探针的序列如SEQ ID NO:8所示，所述特异性检测内参基因RNaseP的exo荧光探针的序列如SEQ IDNO:9所示。
进一步地，所述特异性检测2019-nCoV ORF1ab基因特异性保守区域的exo荧光探针内部THF分子两侧分别带有荧光基团和淬灭基团；所述特异性检测2019-nCoV N基因特异性保守区域的exo荧光探针内部THF分子两侧分别带有荧光基团和淬灭基团；所述特异性检测内参基因RNaseP的exo荧光探针内部THF分子两侧分别带有荧光基团和淬灭基团。
进一步地，所述RT-RPA反应管采用TwistAmpTMexo RT Kit试剂盒中的内含RT-RPA试剂冻干粉的8联管。
进一步地，所述RT-RPA试剂冻干粉采用TwistAmpTMexo RT Kit试剂盒中的试剂冻干粉，组分主要包括逆转录酶、重组酶、链置换DNA聚合酶、dNTPs。
进一步地，所述RT-RPA反应缓冲液采用TwistAmpTMexo RT Kit试剂盒中的RT-RPA反应缓冲液。
进一步地，所述RT-RPA反应启动液为TwistAmpTMexo RT Kit试剂盒中的MgAc溶液，浓度为280mM。
进一步地，所述阳性质控品为含有2019-nCoV病毒靶标基因假病毒与内参假病毒混合液。
进一步地，所述阴性质控品为灭菌去离子水。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的方法，包括以下步骤：
(1)RNA提取，取待测样本、阳性质控品、阴性质控品，使用RNA提取试剂盒进行RNA提取操作；
(2)RT-RPA反应，使用待测样本及阳性质控品、阴性质控品提取得到的RNA作为模板，使用所述的用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒进行RT-RPA检测，每个样本进行2个反应孔，分别检测2019-nCoV ORF1ab和2019-nCoV N基因，2019-nCoV ORF1ab反应体系包括：2019-nCoV ORF1ab反应液8μL、RT-RPA反应缓冲液29.5μL、模板RNA 10μL，2019-nCoV N反应体系包括：2019-nCoV N反应液8μL、RT-RPA反应缓冲液29.5μL、模板RNA10μL；
将上述体系溶液加入预先装有RT-RPA试剂冻干粉的RT-RPA反应管中，每管47.5μL，涡旋振荡，使管内的RT-RPA试剂冻干粉重新溶解，在每个RT-RPA反应管内加入RT-RPA反应启动液2.5μL，启动RT-RPA反应；
将RT-RPA反应管放入实时荧光RPA监测仪，设定反应温度39℃、时间20min，进行实时荧光RPA反应，检测FAM通道和HEX通道荧光强度；
(3)结果分析，对实时荧光RPA监测仪检测得到的数据分别进行分析，通收集的荧光曲线和到达阈值所用的时间判定结果，对待测样本中新型冠状病毒2019-nCoV核酸进行定性判断。
进一步地，当新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测结果为阳性时，提示受检样本为新型冠状病毒感染的肺炎患者。
本发明的有益效果：
(1)本发明的用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒对新型冠状病毒2019-nCoV核酸水平进行检测，适用于咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液、粪便多种类型样本的检测，可准确反映出样本中2019-nCoV感染的状态，可用于新型冠状病毒感染的肺炎的监测和防控及临床诊断，有助于新型冠状病毒感染的肺炎的早期诊断和治疗；
(2)本发明的用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒分别针对新型冠状病毒2019-nCoV基因组中开放读码框1ab(open reading frame,ORF1ab)和核壳蛋白(nucleoprotein，N)基因特异性序列设计专用引物、探针，从而保证检测的特异性和准确性；
(3)本发明的用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的方法采用双靶标基因的检测方案，同时加入内参基因以监控取样过程、样本提取及一步法反转录-重组酶聚合酶等温扩增(RT-RPA)过程，极大程度地保证了检测结果的特异性和准确性；
(4)相对于已有的基于Taqman探针法的实时荧光定量PCR技术，本发明的用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒及检测方法采用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase ampl ification，RPA)检测技术，一次检测所需时间缩短了一半以上，由40～60分钟缩短至20分钟，由于RPA技术是利用等温方法进行核酸扩增，这样可摆脱高端精密的温控循环系统，相比实时荧光定量PCR仪，实时荧光RPA监测仪体积小、便于携带、反应耗时短，且价格低廉，更适于现场快速检测(point-of-caretesting，POCT)，能够实现新型冠状病毒感染的肺炎疑似患者和密切接触人群的快速诊断。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒，包括2019-nCoVORF1ab反应液、2019-nCoV N反应液、RT-RPA反应管、RT-RPA反应缓冲液、RT-RPA反应启动液、阳性质控品、阴性质控品；
所述2019-nCoV ORF1ab反应液包含特异性检测2019-nCoV ORF1ab基因特异性保守区域的RPA扩增引物和exo荧光探针、特异性检测内参基因RNaseP的RPA扩增引物和exo荧光探针，所述2019-nCoV N反应液包含特异性检测2019-nCoV N基因特异性保守区域的RPA扩增引物和exo荧光探针、特异性检测内参基因RNaseP的RPA扩增引物和exo荧光探针；
所述特异性检测2019-nCoV ORF1ab基因特异性保守区域的RPA扩增引物中，
上游引物2019-nCoV ORF1ab-F的序列为：
CAAATACCTACAACTTGTGCTAATGACCCTGTG(SEQ ID NO:1)，
下游引物2019-nCoV ORF1ab-R的序列为：
ACGATTGTGCATCAGCTGACTGAAGCATGGGT(SEQ ID NO:2)；
所述特异性检测2019-nCoV N基因特异性保守区域的RPA扩增引物中，
上游引物2019-nCoV N-F的序列为：
CAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATG(SEQ ID NO:3)，
下游引物2019-nCoV N-R的序列为：
CTTGTTGTTGTTGGCCTTTACCAGACATTTTG(SEQ ID NO:4)；
所述特异性检测内参基因RNaseP基因的RPA扩增引物中，
上游引物RNaseP-F的序列为：TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTG(SEQ ID NO:5)，
下游引物RNaseP-R的序列为：GAAACAGCTACTGGTTTTTCAATTTCCTGTTTC(SEQ ID NO:6)；
所述特异性检测2019-nCoV ORF1ab基因特异性保守区域的exo荧光探针：2019-nCoV ORF1ab-P，探针内部THF分子两侧分别带有荧光基团(FAM)和淬灭基团(BHQ1)，其序列为：
ACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGG[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]GTGGAAAGGTTATGGCT[Spacer-C3](SEQ ID NO:7)；
所述特异性检测2019-nCoV N基因特异性保守区域的exo荧光探针：2019-nCoV N-P，探针内部THF分子两侧分别带有荧光基团(FAM)和淬灭基团(BHQ1)，其序列为：
ATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGC[FAM-dT]G[THF][BHQ1-dT]TGACAGATTGAACCA[Spacer-C3](SEQ ID NO:8)；
所述特异性检测内参基因RNaseP的exo荧光探针：RNaseP-P,探针内部THF分子两侧分别带有荧光基团(HEX)和淬灭基团(BHQ1)，其序列为：
CCGCTCACCTTGGCTATTCAGTTGTTGCTA[HEX-dT]C[THF]A[BHQ1-dT]CATATCGTTGACTTT[Spacer-C3](SEQ ID NO:9)。
其中，2019-nCoV ORF1ab反应液中各引物浓度均为2.6μM，探针浓度均为0.75μM；2019-nCoV N反应液中各引物浓度均为2.6μM，探针浓度均为0.75μM。
所述RT-RPA反应管采用
Figure BDA0002822979520000061
exo RT Kit试剂盒中的内含RT-RPA试剂冻干粉的8联管。所述RT-RPA试剂冻干粉采用
Figure BDA0002822979520000062
exo RT Kit试剂盒中的试剂冻干粉，组分主要包括逆转录酶、重组酶、链置换DNA聚合酶、dNTPs。所述RT-RPA反应缓冲液采用
Figure BDA0002822979520000063
exo RT Kit试剂盒中的RT-RPA反应缓冲液。所述RT-RPA反应启动液为
Figure BDA0002822979520000064
exo RT Kit试剂盒中的MgAc溶液，浓度为280mM。所述阳性质控品为含有2019-nCoV病毒靶标基因假病毒与内参假病毒混合液。所述阴性质控品为灭菌去离子水。
实施例2
采用实施例1所述的用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒进行检测的方法包括以下步骤：
(1)RNA提取，取待测样本(咽拭子、痰液、肺泡灌洗液)、阳性质控品、阴性质控品，使用RNA提取试剂盒进行RNA提取操作。RNA提取试剂盒可采用市售产品，QIAGEN公司生产的QIAamp DSP Virus Spin Kit。
(2)RT-RPA反应，使用待测样本及阳性质控品、阴性质控品提取得到的RNA作为模板，使用试剂盒进行RT-RPA检测。每个样本进行2个反应孔，分别检测2019-nCoV ORF1ab和2019-nCoV N基因。
2019-nCoV ORF1ab反应体系如表1所示：
表1 2019-nCoV ORF1ab反应体系
试剂名称 用量
2019-nCoV ORF1ab反应液 8μL
RT-RPA反应缓冲液 29.5μL
模板RNA 10μL
2019-nCoV N反应体系如表2所示：
表2 2019-nCoV N反应体系
试剂名称 用量
2019-nCoV N反应液 8μL
RT-RPA反应缓冲液 29.5μL
模板RNA 10μL
将上述体系溶液加入预先装有RT-RPA试剂冻干粉的RT-RPA反应管中，每管47.5μL。涡旋振荡，使管内的RT-RPA试剂冻干粉重新溶解。在每个RT-RPA反应管内加入RT-RPA反应启动液2.5μL，启动RT-RPA反应。
将RT-RPA反应管放入实时荧光RPA监测仪，设定反应温度39℃、时间20min，进行实时荧光RPA反应，检测FAM通道和HEX通道荧光强度。
(3)结果分析，反应结束后自动保存结果，对实时荧光RPA监测仪检测得到的靶标基因和内参基因的扩增曲线分别进行分析。设置阈值，调整阈值线到刚好超过阴性质控品的最高点。然后通过各待测样本荧光曲线和到达阈值所用的时间(Time threshold,Tt)判定结果。
(A)检验结果分析要求
a)阴性质控品：FAM通道与HEX通道检测均无Tt值。
b)阳性质控品：FAM通道与HEX通道检测Tt值均≤16。
c)以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
(B)检验结果判断
a)如果待测样本2019-nCoV ORF1ab和N荧光信号FAM通道均检测到典型的S型扩增曲线，且Tt≤16，表示2019-nCoV病毒核酸检测为阳性。
b)如果待测样本2019-nCoV ORF1ab和N荧光信号FAM通道均未检测到典型的S型扩增曲线(NoTt)，均无Tt值，且HEX通道检测Tt值≤16，表示2019-nCoV病毒核酸检测为阴性。
c)如果待测样本2019-nCoV ORF1ab和N荧光信号FAM通道均未检测到典型的S型扩增曲线(NoTt)，均无Tt值，且HEX通道检测无Tt值，或Ct值＞16，需重新检测。
d)如果待测样本2019-nCoV ORF1ab和N荧光信号FAM通道仅有一个反应管检测到典型的S型扩增曲线，且Tt≤16，需重新检测。
(4)检测结果。阴性质控品FAM通道与HEX通道检测均无Tt值；阳性质控品的FAM通道与HEX通道检测Tt值均≤16，阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求。2019-nCoV核酸阳性的新型冠状病毒感染的肺炎临床标本检测结果，2019-nCoV ORF1ab和N荧光信号FAM通道均检测到扩增明显S型曲线，且Tt≤16，表示2019-nCoV病毒核酸检测为阳性。2019-nCoV核酸阴性的正常人标本检测结果，2019-nCoV ORF1ab和N荧光信号FAM通道均未检测到典型的S型扩增曲线(NoTt)，均无Tt值，且HEX通道检测Tt值≤16，表示2019-nCoV病毒核酸检测为阴性。
实施例3
选取人冠状病毒SARSr-CoV、MERSr-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、H1N1、腺病毒5型、呼吸道合胞病毒、EB病毒、人巨细胞病毒的阳性样本各1例作为特异性样本，对所有样本进行核酸提取，扩增及结果分析步骤参照实施例2进行，同时进行阴、阳性质控品的检测。
检测结果：阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求。全部特异性样本检测结果均为阴性，说明本试剂盒对人冠状病毒SARSr-CoV、MERSr-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、H1N1、腺病毒5型、呼吸道合胞病毒、EB病毒、人巨细胞病毒无非特异性检出信号。
本发明提出的引物与探针组合物中，靶标基因exo探针使用FAM，内参基因exo探针使用HEX标记，显然可以选用其它合适荧光标记。内参基因仅仅是作为监控取样过程、样本提取及RT-RPA过程，显然选择其它的内参基因并不影响2019-nCoV核酸定性检测的结果。
本发明提出的引物与探针组合物，其工作浓度已依据相应的RT-RPA检测试剂及RT-RPA温度和反应时间等参数进行优化。显然依据其它合适的RT-RPA检测试剂及RT-RPA温度和反应时间等参数同样可以获得理想的2019-nCoV核酸定性检测的结果。另外，更改引物与探针组合物的储存液浓度并不影响本发明的性质。
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过RT-RPA技术实现恒温核酸快速扩增，并配合RPA技术特有的exo荧光探针检测，应用实时荧光RPA监测仪，能准确快速检测咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等多种类型样本中新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab和N基因，可广泛应用于新型冠状病毒2019-nCoV临床早期诊断、疫情防控及科学研究等多个领域。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京朝阳医院
北京市临床检验中心
北京华诺奥美基因生物科技有限公司
<120> 用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒及检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaatacctacaacttgtgctaatgaccctgtg 33
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgattgtgcatcagctgactgaagcatgggt 32
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagcagtaggggaacttctcctgctagaat g 31
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttgttgttgttggcctttaccagacattttg 32
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttctgacctgaaggctctgcgcggacttgt g 31
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaacagctactggtttttcaatttcctgtttc 33
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acttaaaaacacagtctgtaccgtctgcgggtggaaaggttatggct 47
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggcggtgatgctgctcttgctttgctgcgtgacagattgaacca 46
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccgctcaccttggctattcagttgttgctacacatatcgttgacttt 47

Claims (10)

1. 一种用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒，其特征在于，包括2019-nCoV ORF1ab 反应液、2019-nCoV N 反应液、RT-RPA反应管、RT-RPA反应缓冲液、RT-RPA反应启动液、阳性质控品、阴性质控品；
所述2019-nCoV ORF1ab 反应液包含特异性检测2019-nCoV ORF1ab基因特异性保守区域的RPA扩增引物和exo荧光探针、特异性检测内参基因RNaseP的RPA扩增引物和exo荧光探针，所述2019-nCoV N 反应液包含特异性检测2019-nCoV N基因特异性保守区域的RPA扩增引物和exo荧光探针、特异性检测内参基因RNaseP的RPA扩增引物和exo荧光探针；
所述特异性检测2019-nCoV ORF1ab基因特异性保守区域的RPA扩增引物中，上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；所述特异性检测2019-nCoV N基因特异性保守区域的RPA扩增引物中，上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；所述特异性检测内参基因RNaseP基因的RPA扩增引物中，上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示；
所述特异性检测2019-nCoV ORF1ab基因特异性保守区域的exo荧光探针的序列如SEQID NO:7所示，所述特异性检测2019-nCoV N基因特异性保守区域的exo荧光探针的序列如SEQ ID NO:8所示，所述特异性检测内参基因RNaseP的exo荧光探针的序列如SEQ ID NO:9所示。
2. 根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒，其特征在于，所述特异性检测2019-nCoV ORF1ab基因特异性保守区域的exo荧光探针内部THF分子两侧分别带有荧光基团和淬灭基团；所述特异性检测2019-nCoV N基因特异性保守区域的exo荧光探针内部THF分子两侧分别带有荧光基团和淬灭基团；所述特异性检测内参基因RNaseP的exo荧光探针内部THF分子两侧分别带有荧光基团和淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒，其特征在于，所述RT-RPA反应管采用内含RT-RPA试剂冻干粉的8联管。
4.根据权利要求3所述的用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒，其特征在于，所述RT-RPA试剂冻干粉包括逆转录酶、重组酶、链置换DNA聚合酶、dNTPs。
5.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒，其特征在于，所述RT-RPA反应缓冲液由Tris-HCl溶液组成。
6.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒，其特征在于，所述RT-RPA反应启动液为MgAc溶液，浓度为280mM。
7.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有2019-nCoV病毒靶标基因假病毒与内参假病毒混合液。
8.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为灭菌去离子水。
9.一种用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）RNA提取，取待测样本、阳性质控品、阴性质控品，使用RNA提取试剂盒进行RNA提取操作；
（2）RT-RPA反应，使用待测样本及阳性质控品、阴性质控品提取得到的RNA作为模板，使用权利要求1-8任一项所述的试剂盒进行RT-RPA检测，每个样本进行2个反应孔，分别检测2019-nCoV ORF1ab 和2019-nCoV N基因，2019-nCoV ORF1ab反应体系包括：2019-nCoVORF1ab反应液8μL、RT-RPA反应缓冲液29.5μL、模板RNA 10μL，2019-nCoV N反应体系包括：2019-nCoV N反应液8μL、RT-RPA反应缓冲液29.5μL、模板RNA 10μL；
将上述体系溶液加入预先装有RT-RPA试剂冻干粉的RT-RPA反应管中，每管47.5μL，涡旋振荡，使管内的RT-RPA试剂冻干粉重新溶解，在每个RT-RPA反应管内加入RT-RPA反应启动液2.5μL，启动RT-RPA反应；
将RT-RPA反应管放入实时荧光RPA监测仪，设定反应温度39℃、时间20min，进行实时荧光RPA反应，检测FAM通道和HEX通道荧光强度；
（3）结果分析，对实时荧光RPA监测仪检测得到的数据分别进行分析，通收集的荧光曲线和到达阈值所用的时间判定结果，对待测样本中新型冠状病毒2019-nCoV核酸进行定性判断。
10.根据权利要求9所述的用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的方法，其特征在于，当新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测结果为阳性时，提示受检样本为新型冠状病毒感染的肺炎患者。
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