CN111270017A - 一种基于数字pcr检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于数字PCR检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用。所述引物探针组合中引物对的核酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述引物探针组合中探针的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明针对COVID‑19中ORF1ab基因区域设计引物对和探针，能够特异性地检测出新型冠状病毒，使用所述引物探针组合制备的试剂盒，配合数字PCR技术同时使用，能够对样本进行绝对定量，检测灵敏度高，检测结果还可以排除复杂样本对于实验结果的干扰，准确度高。

Description

一种基于数字PCR检测新型冠状病毒的引物探针组合及其 应用

技术领域

本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种检测新型冠状病毒(COVID-19)的引物探针组合及其应用，尤其涉及一种基于数字PCR检测COVID-19的引物探针组合及其应用。

背景技术

新型冠状病毒(COVID-19)是一种具有包膜的、不分节段的正链单股RNA病毒，颗粒呈圆形或椭圆形，直径约60～140nm，属于网巢病毒目冠状病毒科乙型冠状病毒属。此病毒基因组长度约30kb左右，其基因序列显示与中华菊头蝠中发现的冠状病毒相似，例如MERS-CoV或SARS-CoV，与SARS-CoV同属于乙型冠状病毒属谱系β(Betacoronavirus Lineageβ，Sarbecovirus)。

新型冠状病毒肺炎的临床表现为以发热、乏力、干咳为主，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和(或)低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等。新型冠状病毒被认为对人群普遍易感，其可通过包括呼吸道飞沫、飞沫形成的气凝胶、皮肤接触或直接接触带有病毒的分泌物进行传播，可从包括眼睛、鼻腔、口腔进入人体。目前所见传染源主要是新型冠状病毒感染的患者，无症状感染者也可能成为传染源。

为了及时发现人群中病毒携带者，有效控制病毒在人群中的传播，建立快速、敏感、准确的新型冠状病毒检测方法是十分必要的。目前临床上用于检测新冠病毒核酸的方法主要为实时荧光RT-PCR，依赖于Taqman探针技术的实时荧光RT-PCR虽然具有高特异性和敏感性，但其定量依赖于标准物质，要求样本中目的基因的扩增效率与标准物质一致，定量准确性易受样本基质及干扰物质的影响，同时其检测下限仍很高，暂时不能检测出微量的病毒。

数字PCR是近十年来兴起的第三代PCR技术，主要原理是将单个DNA分子置于独立的反应室中，每个反应室或不含待检核酸靶分子，或含有至少一个待检核酸靶分子，并对其进行PCR扩增，利用TaqMan化学试剂及染料标记探针检测特定的靶序列。经PCR扩增后，分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为“1”，没有荧光信号的微滴判读为“0”，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例给出待检靶分子的拷贝数浓度。

数字PCR定量的结果不再依赖于Ct值而直接给出靶序列的起始拷贝数浓度，实现了真正意义上的绝对定量。与实时荧光PCR相比，该方法具有精准、超灵敏度和不易受PCR抑制物影响等优点，使得其能够有效检测临床样本中低载量的病毒核酸，降低假阴性结果。

因此，开发相关利用数字PCR对新型冠状病毒(COVID-19)进行绝对定量的检测方法和试剂盒对流行病学调查、疫情监控、口岸检验检疫以及卫生保障领域具有重大意义。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于数字PCR检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用，依据新型冠状病毒ORF1ab区域中RNA聚合酶(RdRp)基因区域设计了一对特异性引物及探针，同时建立了基于数字PCR技术的检测方法。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种基于数字PCR技术检测新型冠状病毒的引物探针组合，所述引物探针组合中的引物对如SEQ ID NO.1～2所示，所述引物探针组合中的探针如SEQID NO.3所示。

本发明针对新型冠状病毒(COVID-19)ORF1ab基因区域设计的特异性引物探针能检测出新型冠状病毒，其中ORF1ab为RNA依赖的RNA聚合酶基因(RdRp)所在区域，编码RNA聚合酶，负责病毒核酸复制，同时所述引物探针组合对于与新冠状病毒核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他微生物等无交叉反应，特异性较好。

作为本发明优选的技术方案，所述引物探针组合用于扩增新型冠状病毒的RdRp基因。

优选地，所述探针的5′端修饰有发光的报告荧光基团，3′端修饰有荧光淬灭基团。

优选地，所述发光的报告荧光基团包括FAM、HEX、TET、JOE、CY3或CY5中的任意一种。

优选地，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意一种。本发明中，所述引物探针组合的具体序列如表1所示：

表1

优选地，所述引物探针组合还包括检测内参基因的引物对和探针。

优选地，所述内参基因包括人RPPH1基因。

优选地，所述人RPPH1基因的引物对如SEQ ID NO.4～5所示。

优选地，所述人RPPH1基因的探针如SEQ ID NO.6所示。

优选地，所述内参基因的探针的5′端修饰有发光的报告荧光基团，3′端修饰有荧光淬灭基团。

优选地，所述用于扩增新型冠状病毒的RdRp基因的探针的荧光基团与所述内参基因的探针的报告荧光基团不同。本发明中，所述内参基因的引物对和探针的具体序列如表2所示：

表2

本发明中，所述的目的基因引物探针是依据新型冠状病毒ORF1ab基因区域设计的，内参基因引物探针是依据人RPPH1基因区域设计的，扩增的目的片段大小分别为SEQ IDNO.7(111bp)和SEQ ID NO.8(87bp)。

扩增序列SEQ ID NO.7为：

5′-GACTGGTATGATTTTGTAGAAAACCCAGATATATTACGCGTATACGCCAACTTAGGTGAACGTGTACGCCAAGCTTTGTTAAAAACAGTACAATTCTGTGATGCCATGCGA-3′

扩增序列SEQ ID NO.8为：

5′-CTGGCCCTAGTCTCAGACCTTCCCAAGGGACATGGGAGTGGAGTGACAGGACGCACTCAGCTCGTGGCCCCACTGATGAGCTTCCCT-3′

第二方面，如第一方面所述的引物探针组合在制备新型冠状病毒检测试剂盒中的应用。

第三方面，本发明还提供一种基于数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的引物探针组合。

本发明提供的试剂盒配合数字PCR，能够实现对待测样本中目的基因的绝对定量，其定量结果直接为目的基因拷贝数(对应病毒个数)而非Ct值，所得结果较为准确，能够为病程和疗效的判读提供量化的核酸水平依据。

优选地，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。

本发明中，所述阳性对照品中含有新型冠状病毒中包含RdRP基因的一段核苷酸序列、和内参基因人RPPH1的核苷酸序列；阴性对照品中仅包含内参基因的核苷酸序列。添加阳性对照品和阴性对照品能够进一步验证试剂盒的检测结果是否可靠，确认在使用试剂盒过程中是否有其他元素的干扰。

第四方面，一种如第三方面所述的新型冠状病毒检测试剂盒的使用方法，包括步骤如下：

将待测样品、所述的引物探针组合、酶和反应缓冲液混合，制备微滴，然后将微滴转入PCR仪中进行扩增，再使用微滴分析仪检测扩增后的微滴，分析数据，得到所述待测样品的检测结果。

所述试剂盒的使用还能够排除复杂样本对实验结果的干扰：所述试剂盒在使用时不受PCR抑制物的影响，可避免样本复杂性导致的PCR假阴性，尤其适用于检测成分复杂的粪便样本或其他复杂样本，也可适用于检测基质成分复杂的环境样本。

作为本发明优选的技术方案，所述引物探针组合中引物的工作浓度为0.5-0.8μM，例如可以是0.5μM、0.55μM、0.6μM、0.65μM、0.7μM、0.75μM或0.8μM等。

优选地，所述引物探针组合中探针的工作浓度为0.2-0.4μM，例如可以是0.2μM、0.22μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.38μM或0.4μM等。

优选地，所述扩增时的反应程序为：45℃保持15min；95℃变性10min；95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，35-40个循环；扩增完成后4℃保存。

所述反应程序中也可以包含终延伸步骤，即在循环结束后72℃延伸10min。

优选地，所述检测结果判定为有效的方法为：

阳性对照品中目的基因的拷贝数为70～90，例如70、72、75、78、80、82、85、86、88或90等，即检测到目的基因80±10个拷贝；内参基因80±10个拷贝(内参基因80±10个拷贝)；内参基因的拷贝数为70～90，并且阴性对照品中目的基因的拷贝数为0～3，内参基因的拷贝数为70～90。

本发明中，在使用试剂盒时，只有在阳性对照中目的基因80±10个拷贝，内参基因80±10个拷贝；且阴性对照中目的基因<3个拷贝，内参基因80±10个拷贝时，同时满足上述两个条件才能证明在实验过程中没有遭受其他污染，检测结果具有可靠性。

作为本发明优选的技术方案，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

将待测样品、用于扩增新型冠状病毒的RdRp基因的引物探针组合、内参基因的引物对和探针、酶和反应缓冲液混合，所述引物探针组合中引物的工作浓度为0.5-0.8μM，探针的工作浓度为0.2-0.4μM，制备微滴；

然后将微滴转入转入PCR板，于PCR仪中进行扩增，反应程序为：45℃保持15min；95℃变性10min；95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，35-40个循环；升降温速度为1-2℃/sec；

再使用微滴分析仪检测扩增后的微滴，分析数据，得到所述待测样品的检测结果，所述检测结果判定为有效的方法为：阳性对照品中目的基因的拷贝数为70～90，内参基因的拷贝数为70～90，并且阴性对照品中目的基因的拷贝数为0～3，内参基因的拷贝数为70～90。

本发明中，所述基于数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒可以使用如下方法检测待测样品：

(1)配制数字PCR反应液。

数字PCR反应液20μL配方为：一步法反应缓冲液4μL，酶混合液2μL，10μM RdRP-F、RdRP-R、RNAP-F和RNAP-R引物各1.2μL，10μM RdRP-P和RNAP-P各0.6μL，待测样品RNA模板为8μL；

(2)制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR仪中进行扩增。

反应程序：45℃15min；95℃10min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃15s，55℃20s，72℃20s；每步都设置2℃/sec的升降温速度；

(3)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果；

(4)待测样本结果判定：阳性：标本检测结果≥3个拷贝；

阴性：标本检测结果<3拷贝，内参基因≥3个拷贝。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明通过的引物探针组合是针对病毒ORF1ab基因区域设计的特异性引物和探针，能够检测出新型冠状病毒，对与新冠状病毒核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他微生物如新型甲型H1N1流感病毒(2009)、乙型流感Yamagata、副流感病毒PIV-1和PIV-3(RSVB)、冠状病毒NL63、冠状病毒HKU1、冠状病毒OC43、冠状病毒229E核酸、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒等均无交叉反应，检测结果特异性较好；

(2)本发明提供的检测试剂盒的检测结果较为可靠，可排除复杂样本对于实验结果的干扰，其检测结果不受PCR抑制物的影响，可避免由于样本复杂性导致的PCR假阴性或假阳性，尤其适用于检测成分复杂的粪便样本或其他复杂样本，也可适用于检测基质成分复杂的环境样本等；

(3)本发明所述的检测方法具有高灵敏度，可以对样本进行绝对定量，其定量结果直接为目的基因拷贝数(对应病毒个数)而非Ct值，为病程和疗效的判读提供量化的核酸水平依据，本发明所述的方法在3个拷贝的模板量下，可以检测出区别于无模板对照的拷贝数，即所述方法在扩增体系为20μL时，最低可检测到3个拷贝的目的基因。

附图说明

图1为实施例3中目的基因RdRP的检测结果示意图，其中，通道1表示FAM通道，图中孔位A01～H01和A02分别对应实施例3中的各检测样本。

图2为实施例3中内参基因人RPPH1的检测结果示意图，其中，通道2表示HEX通道，图中孔位A01～H01和A02分别对应实施例3中的各检测样本。

图3为实施例4中目的基因RdRP的检测结果示意图，其中通道1表示FAM通道，孔位A01～B02为3个拷贝模板量的检测结果，孔位C02～D03为无模板对照的检测结果，孔位E03～F03为阴性对照品和阳性对照品的检测结果。

图4为实施例4中内参基因人RPPH1的检测结果示意图，其中通道2表示HEX通道，孔位A01～B02为3个拷贝模板量的检测结果，孔位C02～D03为无模板对照的检测结果，孔位E03～F03为阴性对照品和阳性对照品的检测结果。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。

实施例1

本实施例提供一种基于数字PCR技术检测新型冠状病毒的引物探针组合。

以新型冠状病毒的ORF1ab处RdRP基因为靶基因，进行适用于数字PCR(ddPCR)的特异性引物和探针的设计，所述的引物探针序列如下：

(1)目的基因上游引物序列RdRP-F：

5′-GACTGGTATGATTTTGTAGAAAACCC-3′；

(2)目的基因下游引物序列RdRP-R：

5′-TCGCATGGCATCACAGAATTG-3′；

(3)目的基因探针序列RdRP-P：

5′-FAM-CGCCAACTTAGGTGAACGTGTACGC-BHQ1-3′。

实施例2

本实施例提供一种利用实施例1提供的引物探针组合制备的检测试剂盒，所述试剂盒中还包含检测内参基因的引物对和探针、阴性对照品、阳性对照品、阳性对照品、酶混合液和反应缓冲液。

其中，酶混合液(规格为200μL/管)中包括逆转录酶、Hot Taq DNA聚合酶、甘油和BSA，反应缓冲液(规格为500μL/管)包含脱氧核糖核苷三磷酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)和镁离子，均来自深圳华因康基因科技有限公司；

所述阳性对照品中含有新型冠状病毒中包含RdRP基因的一段核苷酸序列、和内参基因人RPPH1的核苷酸序列；阴性对照品中仅包含内参基因人RPPH1的核苷酸序列。

以人RPPH1基因为内参基因，进行适用于ddPCR的特异性引物和探针的设计，所述的引物探针序列如下：

内参基因上游引物序列RNAP-F：5′-CTGGCCCTAGTCTCAGAC-3′；

内参基因下游引物序列RNAP-R：5′-AGGGAAGCTCATCAGTGG-3′；

内参基因探针序列RNAP-P：

5′-HEX-AGGACGCACTCAGCTCGTGGCC-BHQ1-3′。

实施例3

本实施例用于验证实施例2中提供的试剂盒的检测特异性。具体操作步骤为：

1.数字PCR扩增反应

(1)配制数字PCR反应液

数字PCR反应液20μL配方如下所示，其中引物和探针的起始浓度均为10μM：

(2)在微滴PCR的生成芯片上，加入步骤(1)中的20μL微滴PCR反应体系，再加入40μL的微滴生成用油，进行微滴生成步骤，完成后将微滴化的反应体系转移至96孔板中，封膜；

(3)将封膜后的96孔板放入PCR仪中进行扩增；

反应程序：45℃15min；95℃10min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃15s，55℃20s，72℃20s；每步都设置2℃/sec的升降温速度；

(4)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果；

本实施例中使用的待测样本包括：

新型甲型H1N1流感病毒(2009)、乙型流感Yamagata、副流感病毒PIV-1、冠状病毒OC43、冠状病毒229E核酸、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒核酸提取物进行检测，上述病毒均为与新冠状病毒核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的病毒；同时设置阴性对照和阳性对照。最终检测结果如表3所示：

表3

检测结果如上表所示，再结合图1与图2，其中图1为通道1即FAM通道下目的基因RdRP的检测结果，图2为通道2即HEX通道下内参基因人RPPH1的检测结果，孔位A01、B01、C01、D01、E01、F01、G01、H01和A02分别对应新型甲型H1N1流感病毒(2009)、乙型流感Yamagata、副流感病毒PIV-1、冠状病毒OC43、冠状病毒229E核酸、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒核酸提取物、阳性对照和阳性对照。

因此，本实施例中仅在阳性对照组中检测到阳性微滴，其余组均无扩增信号，说明本发明提供的COVID-19数字PCR引物和探针具备很强的特异性。

实施例4

本实施例用于测试实施例2中提供的试剂盒的检测灵敏度。

对于新型冠状病毒(COVID-19)核酸提取采用如下方法：

使用Qiagen公司生产的QIAamp病毒RNA纯化mini试剂盒对人鼻咽拭子样本进行核酸提取。取200μL样本处理液，按照提取试剂盒的说明书进行病毒核酸提取，最终溶解于50μL无RNA酶水中，并对该阳性样品进行梯度稀释。

通过实施例3中给出的检测方法进行检测。检测结果如图3和图4所示，其中图3为通道1即FAM通道下目的基因RdRP的检测结果，图4为通道2即HEX通道下内参基因人RPPH1的检测结果，孔位A01～B02为3个拷贝模板量的检测结果，孔位C02～D03为无模板对照的检测结果，孔位E03～F03为阴性对照品和阳性对照品的检测结果。

结果显示，在数字PCR反应液20μL配方下，当阳性样品中含有3个拷贝的模板量下，可以检测出区别于无模板对照的拷贝数，即本数字PCR的检测方法在扩增体系为20μL时，最低可检测到为3个拷贝。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华因康基因科技有限公司

<120> 一种基于数字PCR检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用

<130> 20200327

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gactggtatg attttgtaga aaaccc 26

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgcatggca tcacagaatt g 21

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgccaactta ggtgaacgtg tacgc 25

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctggccctag tctcagac 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agggaagctc atcagtgg 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aggacgcact cagctcgtgg cc 22

<210> 7

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gactggtatg attttgtaga aaacccagat atattacgcg tatacgccaa cttaggtgaa 60

cgtgtacgcc aagctttgtt aaaaacagta caattctgtg atgccatgcg a 111

<210> 8

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctggccctag tctcagacct tcccaaggga catgggagtg gagtgacagg acgcactcag 60

ctcgtggccc cactgatgag cttccct 87

Claims (10)

1.一种基于数字PCR检测新型冠状病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合中引物对的核酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述引物探针组合中探针的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合用于扩增新型冠状病毒的RdRp基因；

优选地，所述探针的5′端修饰有发光的报告荧光基团，3′端修饰有荧光淬灭基团；

优选地，所述发光的报告荧光基团包括FAM、HEX、TET、JOE、CY3或CY5中的任意一种；

优选地，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意一种。

3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包括检测内参基因的引物对和探针；

优选地，所述内参基因包括人RPPH1基因；

优选地，所述人RPPH1基因的引物对的核酸序列如SEQ ID NO.4～5所示；

优选地，所述人RPPH1基因的探针的核酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述内参基因的探针的5′端修饰有发光的报告荧光基团，3′端修饰有荧光淬灭基团；

优选地，所述用于扩增新型冠状病毒的RdRp基因的探针的报告荧光基团与所述内参基因的探针的报告荧光基团不同。

5.如权利要求1-4任一项所述的引物探针组合在制备新型冠状病毒检测试剂盒中的应用。

6.一种基于数字PCR检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-4任一项所述的引物探针组合。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。

8.一种如权利要求6或7所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括步骤如下：

将待测样品、所述的引物探针组合、酶和反应缓冲液混合，制备微滴，然后将微滴转入PCR仪中进行扩增，再使用微滴分析仪检测扩增后的微滴，分析数据，得到所述待测样品的检测结果。

9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述引物探针组合中引物的工作浓度为0.5-0.8μM；

优选地，所述引物探针组合中探针的工作浓度为0.2-0.4μM；

优选地，所述扩增时的反应程序为：45℃保持15min；95℃变性10min；95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，35-40个循环；

优选地，所述检测结果判定为有效的方法为：

阳性对照品中目的基因的拷贝数为70～90，内参基因的拷贝数为70～90，并且阴性对照品中目的基因的拷贝数为0～3，内参基因的拷贝数为70～90。

10.根据权利要求8或9所述的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括步骤如下：

将待测样品、用于扩增新型冠状病毒的RdRp基因的引物探针组合、内参基因的引物对和探针、酶和反应缓冲液混合，所述引物探针组合中引物的工作浓度为0.5-0.8μM，探针的工作浓度为0.2-0.4μM，制备微滴；

然后将微滴转入转入PCR板，于PCR仪中进行扩增，反应程序为：45℃保持15min；95℃变性10min；95℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，35-40个循环；升降温速度为1-2℃/sec；

再使用微滴分析仪检测扩增后的微滴，分析数据，得到所述待测样品的检测结果，所述检测结果判定为有效的方法为：阳性对照品中目的基因的拷贝数为70～90，内参基因的拷贝数为70～90，并且阴性对照品中目的基因的拷贝数为0～3，内参基因的拷贝数为70～90。

Images