CN113388699A - 数字pcr技术检测新型冠状病毒的试剂盒及方法 - Google Patents
数字pcr技术检测新型冠状病毒的试剂盒及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113388699A CN113388699A CN202110675880.2A CN202110675880A CN113388699A CN 113388699 A CN113388699 A CN 113388699A CN 202110675880 A CN202110675880 A CN 202110675880A CN 113388699 A CN113388699 A CN 113388699A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- final concentration
- primer
- gene
- rdrp
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 74
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 12
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 11
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 18
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 33
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 description 3
- 241001428935 Human coronavirus OC43 Species 0.000 description 3
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 2
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 208000010444 Acidosis Diseases 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 208000006083 Hypokinesia Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 239000009147 Kangxin Substances 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027417 Metabolic acidosis Diseases 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150016678 RdRp gene Proteins 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241001678561 Sarbecovirus Species 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000017574 dry cough Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 were tested Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本能发明提供数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒及方法，包括：扩增SARS‑COV‑2的ORF1ab基因内RdRp区段的基因片段，通过扩增产物情况检测是否存在SARS‑COV‑2；其中，检测片段的核苷酸序列如SEQ.NO.1所示。
Description
技术领域
本发明属于病毒分子检测领域，具体涉及数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒及方法。
背景技术
2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是2019年在人体中发现的冠状病毒新毒株。该病毒症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。从分子角度来讲，新型冠状病毒(SARS-COV-2)是一种具有包膜的、不分节段的正链单股RNA病毒，基因组长度约30kb左右，与SARS-CoV同属于乙型冠状病毒属谱系β(BetacoronavirusLineageβ,Sarbecovirus)。该病毒有12个蛋白编码区/开放读码框(ORF)，其中ORF1ab为RNA依赖的RNA聚合酶基因(RdRp)所在区域，编码RNA聚合酶，负责病毒核酸复制。由于SARS-COV-2的RdRp区段在进化树上与SARS-CoV的RdRp基因显著不同，故被列为一种全新的β属冠状病毒。因而，位于ORF1ab基因内RdRp区段成为鉴定SARS-COV-2核酸的一个重要标志物。
由于该病毒传染性极强，且会出现无症状感染的现象，因此，通过快速检测病毒是控制病毒传染的重要手段。目前针对ORF1ab的测试引起研究者注意，其中，申请号为202010160162.7中国专利公开了包含ORF1ab基因特异引物和Taqman探针。依赖于Taqman探针的检测具有高特异性和敏感性，但其定量依赖于标准物质，要求样本中目的基因的扩增效率与标准物质一致，定量准确性易受样本基质及干扰物质的影响。同时其检测下限仍很高，还不能检测出微量的病毒。
发明内容
基于上述技术问题，本发明提供数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒及方法。
具体技术方案如下：
数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其不同之处在于，包括扩增SARS-COV-2的ORF1ab基因内RdRp区段的基因片段的引物对、ORF1ab基因探针引物、内参基因扩增引物对及内参基因探针引物，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ.NO.1所示。
进一步，所述扩增基因片段的引物对的核苷酸序列如SEQ.NO.2～SEQ.NO.3所示。
进一步，所述内参基因扩增引物对扩增的为RPPH1基因区域内的基因片段，其核苷酸序列如SEQ.NO.4所示。
进一步，所述内参基因扩增引物对的核苷酸序列如SEQ.NO.5～SEQ.NO.6所示。
进一步，所述ORF1ab基因探针引物的核苷酸序列如SEQ.NO.7所示，所述内参基因探针引物如SEQ.NO.8。
进一步，所述ORF1ab基因探针引物与内参基因探针引物的5’端连接有荧光基团，3’连接有荧光淬灭基团。
进一步，所述数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒还包括阳性对照品与阴性对照品。
一种数字PCR技术检测新型冠状病毒的反应体系，其不同之处在于，所述反应体系包括下列组分：
上述扩增SARS-COV-2的ORF1ab基因内RdRp区段的基因片段的引物对：上游引物与下游引物的终浓度各为200nM～800nM；
ORF1ab基因探针引物的终浓度为100nM～400nM；、
内参基因扩增引物对：上游引物与下游引物的终浓度各为200nM～800nM；
内参基因探针引物的终浓度为100～400nM；
反应缓冲液；
酶混合液；
及
RNA模板。
进一步，所述反应体系包括下列组分：
扩增SARS-COV-2的ORF1ab基因内RdRp区段的基因片段的引物对：上游引物与下游引物的终浓度各为500nM～600nM；
ORF1ab基因探针引物的终浓度为250nM～300nM；
内参基因扩增引物对：上游引物与下游引物的终浓度各为500nM～600nM；
及
内参基因探针引物的终浓度为250nM～300nM。
一种数字PCR检测新型冠状病毒的方法，其不同之处在于，往上述反应体系中加入微滴生成用油生成微滴后进行PCR反应，分析扩增反应产物的数据，得到PCR扩增结果，判断是否存在SARS-COV-2病毒。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明采用数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒对RdRp区段的基因片段进行测试，该试剂盒灵敏度高，可以对样本进行绝对定量，在20μl体系下可以检测3个拷贝的目的基因，特异型强，不与其他病毒产生交叉反应。
(2)试剂盒选取特定目的基因引物及特定内参基因引物，在55℃～58℃条件下，扩增效果更佳，荧光信号更强。
(3)试剂盒选取目的基因扩增引物、内参基因扩增引物的上下游引物在500nM～600nM，目标基因探针引物及内参基因探针引物的浓度在250nM～300nM时，其阳性信号与阴性信号分离程度更大，荧光信号更强，便于后续操作与观察。
附图说明
图1为实施例3～实施例8ORF1ab基因检测结果；
图2为实施例3～实施例8内参基因检测结果；
图3为实施例3、实施例9～实施例23ORF1ab基因检测结果；
图4为实施例3、实施例24～实施例35内参基因检测结果；
图5为实施例36ORF1ab基因检测结果；
图6为实施例37ORF1ab基因的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供一种扩增SARS-COV-2的ORF1ab基因内RdRp区段的基因片段的引物对。
引物对的上游引物序列(RdRP-F)如SEQ.NO.2所示，下游引物(RdRP-R)序列如SEQ.NO.3所示，扩增的基因片段如SEQ.NO.1所示。
实施例2
本实施例提供一种数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒，具体包括：
实施例1的引物对；
ORF1ab基因探针引物(RdRP-P)，序列如SEQ.NO.7所示，该探针引物的5’端连接有FAM荧光报告基团，3’端连接有BHQ1荧光淬灭基团。
内参基因上游引物(RNAP-F)，序列如SEQ.NO.5所示；
内参基因下游引物(RNAP-R)，序列如SEQ.NO.6所示；
内参基因探针引物(RNAP-P)，序列如SEQ.NO.8所示，该探针引物的5’端连接有HEX荧光报告基团，3’端连接BHQ1荧光淬灭基团。
其中，内参基因引物对扩增扩增的为RPPH1基因区域内的基因片段，其核苷酸序列如SEQ.NO.4所示；
阴性对照品：含内标基因片段(RPPH1)的体外转录RNA，浓度为10copies/μl。
阳性对照品：含新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因及内标基因片段(RPPH1)的体外转录RNA，浓度均为10copies/μl。
反应缓冲液：主要包含1.5mM dNTPs、150mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、5mg/mlBSA、5mM DTT和15mM镁离子。
酶缓冲液：主要包含0.5U/μl逆转录酶、0.25U/μl Hot Taq DNA聚合酶、50％甘油和5mg/ml BSA。
实施例3
本发明提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，包括如下步骤：
(1)病毒核酸提取
使用Qiagen公司生产的QIAamp病毒RNA纯化mini试剂盒对人鼻咽拭子样本进行核酸提取。取200μl样本处理液，按照提取试剂盒说明书进行病毒核酸提取，最终溶解于50μl无RNA酶水中。
(2)配制数字PCR反应体系
反应缓冲液4μl，酶混合液2μl，10μM的RdRP-F、RdRP-R、RNAP-F和RNAP-R引物各1.2μl，10μM的RdRP-P和RNAP-P各0.6μl，待测样品RNA模板为8μl，整个反应体系为20μl。
(3)PCR反应
在微滴PCR的生成芯片上，加入(2)中的20μL微滴PCR反应体系，加入40μL的微滴生成用油，生成微滴，然后将其转移至96孔板中，封膜后采用PCR仪中进行扩增；
反应程序为：45℃15min；95℃10min；随后进行35个循环，每个循环包括变性温度：95℃15s，退火温度：55℃20s，延伸温度：72℃20s；每步都设置2℃/sec的升降温速度。
(4)结果分析
将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果。检测结果的有效性判定方法为：阳性对照：目的基因80±10个拷贝，内参基因80±10个拷贝；阴性对照：目的基因<3个拷贝，内参基因80±10个拷贝；
待测样本结果判定标准：阳性：标本检测结果≥3个拷贝；阴性：标本检测结果<3拷贝，内参基因≥3个拷贝。
实施例3采用三份不同的临床样本进行了3次实验，样品分别标记为1号样本、2号样本及3号样本。
实施例4
本发明提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，唯一不同的是，退火温度为56℃。
实施例5
本发明提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，唯一不同的是，退火温度为57℃。
实施例6
本发明提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，唯一不同的是，退火温度为58℃。
实施例7
本发明提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，唯一不同的是，退火温度为59℃。
实施例8
本发明提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，唯一不同的是，退火温度为60℃。
其中，实施例3～实施例8的1号样本的目的基因扩增情况如图1所示，其中，A01：退火温度为55℃的扩增情况；B01:退火温度为56℃的扩增情况；C01：退火温度为57℃的扩增情况；D01：退火温度为58℃的扩增情况；E01:退火温度为59℃的扩增情况；F01:退火温度为60℃的扩增情况。
实施例3～实施例8的1号样本的内标基因扩增情况如图2所示，其中，A01：退火温度为55℃的扩增情况；B01:退火温度为56℃的扩增情况；C01：退火温度为57℃的扩增情况；D01：退火温度为58℃的扩增情况；E01:退火温度为59℃的扩增情况；F01:退火温度为60℃的扩增情况。
从图1及图2可以看出以上退火温度条件下，均扩增情况良好，其中，在55℃～58℃范围内进一步提高，而55℃最优。
实施例9
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为300nM，RdRP-P终浓度为150nM。
实施例10
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为300nM，RdRP-P终浓度为200nM。
实施例11
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为300nM，RdRP-P终浓度为250nM。
实施例12
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为300nM，RdRP-P终浓度为300nM。
实施例13
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为400nM，RdRP-P终浓度为150nM。
实施例14
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为400nM，RdRP-P终浓度为200nM。
实施例15
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为400nM，RdRP-P终浓度为250nM。
实施例16
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为400nM，RdRP-P终浓度为300nM。
实施例17
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为500nM，RdRP-P终浓度为150nM。
实施例18
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为500nM，RdRP-P终浓度为200nM。
实施例19
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为500nM，RdRP-P终浓度为250nM。
实施例20
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为500nM，RdRP-P终浓度为300nM。
实施例21
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为600nM，RdRP-P终浓度为150nM。
实施例22
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为600nM，RdRP-P终浓度为200nM。
实施例23
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RdRP-F与RdRP-R终浓度为600nM，RdRP-P终浓度为250nM。
实施例3、实施例9～实施例2的2号样本的RdRP基因测试情况如图3所示，其中A02:RdRP-F与RdRP-R终浓度为300nM，RdRP-P终浓度为150nM探针；B02::RdRP-F与RdRP-R终浓度为300nM，RdRP-P终浓度为200nM探针；C02:RdRP-F与RdRP-R终浓度为300nM,RdRP-P终浓度为250nM探针；D02:RdRP-F与RdRP-R终浓度为300nM,RdRP-P终浓度为300nM探针；E02:RdRP-F与RdRP-R终浓度为400nM，RdRP-P终浓度为150nM探针；F02:RdRP-F与RdRP-R终浓度为400nM，RdRP-P终浓度为200nM探针；G02:RdRP-F与RdRP-R终浓度为400nM，RdRP-P终浓度为250nM探针；H02:RdRP-F与RdRP-R终浓度为400nM,RdRP-P终浓度为300nM探针；A03:RdRP-F与RdRP-R终浓度为500nM,RdRP-P终浓度为150nM探针；B03:RdRP-F与RdRP-R终浓度为500nM,RdRP-P终浓度为200nM探针；C03:RdRP-F与RdRP-R终浓度为500nM,RdRP-P终浓度为250nM探针；D03:RdRP-F与RdRP-R终浓度为500nM,RdRP-P终浓度为300nM探针；E03:RdRP-F与RdRP-R终浓度为600nM,RdRP-P终浓度为150nM探针；F03:RdRP-F与RdRP-R终浓度为600nM,RdRP-P终浓度为200nM探针；G03:RdRP-F与RdRP-R终浓度为600nM,RdRP-P终浓度为250nM探针；H03：RdRP-F与RdRP-R终浓度为600nM,RdRP-P终浓度为300nM探针。
从图3可以看出，上述终浓度的条件下，阴性微滴与阳性微滴的分离程度均良好；当RdRP-F与RdRP-R终浓度为500nM～600nM，RdRP-P终浓度为250nM～300nM时，阳性信号与阴性信号分离程度进一步提高，当RdRP-F与RdRP-R终浓度为600nM，RdRP-P终浓度为300nM时，阳性信号与阴性信号分离效果最佳。
实施例24
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RNAP-F与RNAP-R终浓度为300nM，RNAP-P终浓度为150nM。
实施例25
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RNAP-F与RNAP-R终浓度为300nM，RNAP-P终浓度为200nM。
实施例26
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RNAP-F与RNAP-R终浓度为300nM，RNAP-P终浓度为250nM。
实施例27
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RNAP-F与RNAP-R终浓度为400nM，RNAP-P终浓度为150nM。
实施例28
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RNAP-F与RNAP-R终浓度为400nM，RNAP-P终浓度为200nM。
实施例29
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RNAP-F与RNAP-R终浓度为400nM，RNAP-P终浓度为250nM。
实施例30
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RNAP-F与RNAP-R终浓度为500nM，RNAP-P终浓度为150nM。
实施例31
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RNAP-F与RNAP-R终浓度为500nM，RNAP-P终浓度为200nM。
实施例32
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RNAP-F与RNAP-R终浓度为500nM，RNAP-P终浓度为250nM。
实施例33
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RNAP-F与RNAP-R终浓度为600nM，RNAP-P终浓度为150nM。
实施例34
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RNAP-F与RNAP-R终浓度为600nM，RNAP-P终浓度为200nM。
实施例35
本实施例提供一种利用实施例2的试剂盒的测试方法，其步骤与实施例3相同，不同的是RNAP-F与RNAP-R终浓度为600nM，RNAP-P终浓度为250nM。
实施例3、实施例24～实施例35的3号样本的内参基因测试情况如图4所示，其中A04:RNAP-F与RNAP-R终浓度为300nM，RNAP-P终浓度为150nM探针；B04::RNAP-F与RNAP-R终浓度为300nM，RNAP-P终浓度为200nM探针；C04:RNAP-F与RNAP-R终浓度为300nM,RNAP-P终浓度为250nM探针；D04:RNAP-F与RNAP-R终浓度为300nM,RNAP-P终浓度为300nM探针；E04:RNAP-F与RNAP-R终浓度为400nM，RNAP-P终浓度为150nM探针；F04:RNAP-F与RNAP-R终浓度为400nM，RNAP-P终浓度为200nM探针；G04:RNAP-F与RNAP-R终浓度为400nM，RNAP-P终浓度为250nM探针；H04:RNAP-F与RNAP-R终浓度为400nM,RNAP-P终浓度为300nM探针；A06:RNAP-F与RNAP-R终浓度为500nM,RNAP-P终浓度为150nM探针；B06:RNAP-F与RNAP-R终浓度为500nM,RNAP-P终浓度为200nM探针；C06:RNAP-F与RNAP-R终浓度为500nM,RNAP-P终浓度为250nM探针；D06:RNAP-F与RNAP-R终浓度为500nM,RNAP-P终浓度为300nM探针；E06:RNAP-F与RNAP-R终浓度为600nM,RNAP-P终浓度为150nM探针；F06:RNAP-F与RNAP-R终浓度为600nM,RNAP-P终浓度为200nM探针；G06:RNAP-F与RNAP-R终浓度为600nM,RNAP-P终浓度为250nM探针；H06：RNAP-F与RNAP-R终浓度为600nM,RNAP-P终浓度为300nM探针。
从图4可以看出，上述终浓度的条件下，阴性微滴与阳性微滴的分离程度均良好；当RNAP-F与RNAP-R终浓度为500nM～600nM，RNAP-P终浓度为250nM～300nM时，阳性信号与阴性信号分离程度进一步提高，当RNAP-F与RNAP-R终浓度为600nM，RNAP-P终浓度为300nM时，阳性信号与阴性信号的分离效果最佳。
需要说明的是，实施例3～实施例35中需要浓度调整时通过调整相应物质的起始浓度实现。
实施例36
本实施例提供实施例2中试剂盒引物探针特异性实验
利用实施例3中所述的方法，对与新冠状病毒核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他微生物如新型甲型H1N1流感病毒(2009)、乙型流感Yamagata、副流感病毒PIV-1、冠状病毒OC43、冠状病毒229E核酸、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒核酸提取物进行检测，同时设置阴性对照和阳性对照，结果如图5及表1所示，其中，A06:新型甲型H1N1流感病毒测试结果；B06:乙型流感Yamagata测试结果；C06:副流感病毒PIV-1测试结果；D06:冠状病毒OC43测试结果；E06:冠状病毒229E测试结果；F06:SARS冠状病毒测试结果；G06:MERS冠状病毒测试结果；H06:阳性对照；A07:阴性对照。
表1.实施例2试剂盒引物探针特异性
| 样本 | ORF1ab基因 | 内参基因 |
| 新型甲型H1N1流感病毒核酸提取物 | 0 | 0 |
| 乙型流感Yamagata核酸提取物 | 0 | 0 |
| 副流感病毒PIV-1核酸提取物 | 0 | 0 |
| 冠状病毒OC43核酸提取物 | 0 | 0 |
| 冠状病毒229E核酸核酸提取物 | 0 | 0 |
| SARS冠状病毒核酸提取物 | 0 | 0 |
| MERS冠状病毒核酸提取物 | 0 | 0 |
| 阴性对照 | 0 | 78.37 |
| 阳性对照 | 89.918 | 81.432 |
结果如表1及图5所示，仅阳性对照组可检测到阳性微滴，其余组均无扩增信号，说明新型冠状病毒(SARS-COV-2)数字PCR引物探针具备很强的特异性。
实施例37
本实施例提供实施例2试剂盒中引物探针灵敏度实验
本实验采用新型冠状病毒(SARS-COV-2)阳性样品进行梯度稀释。通过实施例3给出的检测方法进行检测。
结果显示本体系在3个拷贝的模板量下，可以检测出区别于无模板对照的拷贝数，即本数字PCR的检测方法在扩增体系为20ul时，结果如图6所示，其中，A08～B09:临界浓度阳性样本10次重复检测；C09～D10:无模板对照10次重复检测；E10:阳性对照；F10:阴性对照。结果显示，最低可检测到为3个拷贝。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉康昕瑞基因健康科技有限公司
<120> 数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒及方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> 新冠病毒(SARS-COV-2)
<400> 1
tgtgatagag ccatgcctaa catgcttaga attatggcct cacttgttct tgctcgcaaa 60
catacaacgt gttgtagctt gtca 84
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtgatagag ccatgccta 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgacaagcta caacacgtt 19
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> RPPH1基因(RPPH1)
<400> 4
gacatgggag tggagtgaca ggacgcactc agctcgtggc cccactgatg agcttccctc 60
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacatgggag tggagtga 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagggaagct catcagtg 18
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggcctcact tgttcttgct cgcaaaca 28
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgcactcag ctcgtggccc 20
Claims (10)
1.数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括扩增SARS-COV-2的ORF1ab基因内RdRp区段的基因片段的引物对、ORF1ab基因探针引物、内参基因扩增引物对及内参基因探针引物，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ.NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述扩增基因片段的引物对的核苷酸序列如SEQ.NO.2～SEQ.NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述内参基因扩增引物对扩增的为RPPH1基因区域内的基因片段，其核苷酸序列如SEQ.NO.4所示。
4.根据权利要求2或3所述的数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述内参基因扩增引物对的核苷酸序列如SEQ.NO.5～SEQ.NO.6所示。
5.根据权利要求3所述的数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述ORF1ab基因探针引物的核苷酸序列如SEQ.NO.7所示，所述内参基因探针引物如SEQ.NO.8。
6.根据权利要求1或5所述的数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述ORF1ab基因探针引物与内参基因探针引物的5’端连接有荧光基团，3’连接有荧光淬灭基团。
7.根据权利要求3所述的数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述数字PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒还包括阳性对照品与阴性对照品。
8.一种数字PCR技术检测新型冠状病毒的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括下列组分：
权利要求1所述的扩增SARS-COV-2的ORF1ab基因内RdRp区段的基因片段的引物对：上游引物与下游引物的终浓度各为200nM～800nM；
ORF1ab基因探针引物的终浓度为100nM～400nM；、
内参基因扩增引物对：上游引物与下游引物的终浓度各为200nM～800nM；
内参基因探针引物的终浓度为100～400nM；
反应缓冲液；
酶混合液；
及
RNA模板。
9.根据权利要求8所述的数字PCR技术检测新型冠状病毒的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括下列组分：
扩增SARS-COV-2的ORF1ab基因内RdRp区段的基因片段的引物对：上游引物与下游引物的终浓度各为500nM～600nM；
ORF1ab基因探针引物的终浓度为250nM～300nM；
内参基因扩增引物对：上游引物与下游引物的终浓度各为500nM～600nM；
及
内参基因探针引物的终浓度为250nM～300nM。
10.一种数字PCR检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，往权利要求8所述的反应体系中加入微滴生成用油生成微滴后进行PCR反应，PCR反应的退火温度为55℃～60℃，分析扩增反应产物的数据，得到PCR扩增结果，判断是否存在SARS-COV-2病毒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110675880.2A CN113388699A (zh) | 2021-06-17 | 2021-06-17 | 数字pcr技术检测新型冠状病毒的试剂盒及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110675880.2A CN113388699A (zh) | 2021-06-17 | 2021-06-17 | 数字pcr技术检测新型冠状病毒的试剂盒及方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113388699A true CN113388699A (zh) | 2021-09-14 |
Family
ID=77621823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110675880.2A Pending CN113388699A (zh) | 2021-06-17 | 2021-06-17 | 数字pcr技术检测新型冠状病毒的试剂盒及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113388699A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111088405A (zh) * | 2020-02-06 | 2020-05-01 | 苏州行知康众生物科技有限公司 | 用于检测冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物、试剂盒及方法 |
| CN111118225A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-05-08 | 苏州锐讯生物科技有限公司 | 新型冠状病毒核酸检测微滴式数字pcr试剂盒及其应用 |
| CN111270017A (zh) * | 2020-04-03 | 2020-06-12 | 深圳华因康基因科技有限公司 | 一种基于数字pcr检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用 |
| CN111394519A (zh) * | 2020-04-13 | 2020-07-10 | 南京实践医学检验有限公司 | 基于数字pcr的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒及应用 |
| CN111621601A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-09-04 | 绍兴同创医疗器械有限公司 | 一种新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒及检测方法 |
| CN111676314A (zh) * | 2020-02-10 | 2020-09-18 | 清华大学 | 基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒2019-nCoV核酸定量检测试剂盒 |
-
2021
- 2021-06-17 CN CN202110675880.2A patent/CN113388699A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111088405A (zh) * | 2020-02-06 | 2020-05-01 | 苏州行知康众生物科技有限公司 | 用于检测冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物、试剂盒及方法 |
| CN111676314A (zh) * | 2020-02-10 | 2020-09-18 | 清华大学 | 基于微液滴数字PCR技术的新型冠状病毒2019-nCoV核酸定量检测试剂盒 |
| CN111118225A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-05-08 | 苏州锐讯生物科技有限公司 | 新型冠状病毒核酸检测微滴式数字pcr试剂盒及其应用 |
| CN111270017A (zh) * | 2020-04-03 | 2020-06-12 | 深圳华因康基因科技有限公司 | 一种基于数字pcr检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用 |
| CN111394519A (zh) * | 2020-04-13 | 2020-07-10 | 南京实践医学检验有限公司 | 基于数字pcr的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒及应用 |
| CN111621601A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-09-04 | 绍兴同创医疗器械有限公司 | 一种新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CLAUDIA ALTERI等: "Detection and quantification of SARS-CoV-2 by droplet digital PCR in real-time PCR negative nasopharyngeal swabs from suspected COVID-19 patients", 《PLOS ONE》 * |
| 李彤等: "新型冠状病毒数字PCR 检测方法建立", 《分子诊断与治疗杂志》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111020064B (zh) | 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒 | |
| CN111004870B (zh) | 新型冠状病毒n基因核酸检测试剂盒 | |
| CN111363860A (zh) | 一种检测新型冠状病毒covid-19的核酸组合物及应用 | |
| CN100378230C (zh) | H5、h7、h9亚型禽流感病毒的实时荧光定量pcr检测方法 | |
| CN110578017B (zh) | 一种同步检测二十三种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法 | |
| CN108676920B (zh) | 一种快速检测小鼠诺如病毒引物、试剂盒及其rt-rpa方法 | |
| CN111500776A (zh) | 新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法 | |
| CN111270017A (zh) | 一种基于数字pcr检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用 | |
| CN111518960A (zh) | 一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法 | |
| CN112553373A (zh) | 用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸快速检测的试剂盒及检测方法 | |
| CN111534637B (zh) | 肠道病毒核酸检测的通用引物和探针以及试剂盒 | |
| CN109234456B (zh) | 一种可同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒及其应用 | |
| CN113293240B (zh) | 一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用 | |
| CN105112564A (zh) | 一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒 | |
| CN112739833A (zh) | 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用 | |
| CN102367488B (zh) | 肠道病毒三联实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒 | |
| CN105907890A (zh) | 一种快速区分HP-PRRS疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法 | |
| Yin et al. | Visual detection of duck Tembusu virus with CRISPR/Cas13: A sensitive and specific point-of-care detection | |
| CN105154584B (zh) | 一种快速区分prrsv经典毒株和变异毒株的hrm非标记探针方法及其引物和探针 | |
| CN111676316B (zh) | 一种快速区分非洲猪瘟病毒基因ii型与其它基因型的引物、探针及其检测方法 | |
| CN108060272A (zh) | 一种快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪嵴病毒的多重pcr检测引物组及试剂盒 | |
| CN112159868A (zh) | 一种新型冠状病毒荧光qRT-PCR法快速检测体系 | |
| CN114634996B (zh) | 用于检测牛呼吸道疾病的引物探针组合、试剂盒及其应用 | |
| CN107937615B (zh) | 用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针 | |
| CN113278730A (zh) | 一种新型冠状病毒检测试剂盒、用途及其使用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210914 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |