CN113293240B - 一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用 - Google Patents

一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用，所述检测新型冠状病毒的引物探针组合包括特异性扩增并检测2019‑nCoV的ORF1ab基因、核壳蛋白N基因和刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对和探针。本发明还提供了一种检测新型冠状病毒的试剂盒及其以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法。本发明所述检测新型冠状病毒的引物探针组合具有良好的特异性与灵敏度，配合优化后的检测体系，可以对待测样本进行快速准确的检测，并可以对整个实验流程进行监控，降低假阳性以及假阴性检测结果的出现概率，具有重要的意义。

Description

一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用。
背景技术
2019新型冠状病毒（2019-nCoV/SARS-CoV-2）是引发新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的病原体，其具有潜伏期长、传染性强的特点，危害人们的身体健康，影响了社会的发展，造成了巨大的损失。
目前，针对新型冠状病毒的检测方法主要包括测序法、qPCR法及胶体金法。测序检测需要配合测序专用的仪器进行使用，适用性较差，且对操作人员的技术水平要求较高。qPCR法是目前应用最广的检测方法，但受样本采集部位、采集方式、采集量、运输与储存及检测人员的操作水平等因素的影响，可能存在一定的误差，仍有可以改进的空间。胶体金法属于抗体检测，检测患者的血清中是否含有特异性抗体，特异性高，准确性好，但患者从感染病毒到体内生成抗体需要的时间较长，通常只能检测出感染时间较长的患者，对处于潜伏期患者的检测效果不佳，且不利于患者的管控。
CN111879939A公开了一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括卡盒、IgM检测试纸条和稀释液；所述IgM检测试纸条包括顺次搭接在PVC板上的样品垫、IgM检测结合垫、层析膜和吸水纸；所述IgM检测结合垫包被有胶体金颗粒标记羊抗人IgM单克隆抗体和胶体金颗粒标记新型冠状病毒重组蛋白；所述层析膜包被有鼠抗人μ链单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体。该试剂盒使用方便，检测准确率高，特异性好，但同样存在只能检测出感染时间较长的患者的弊端。
针对新型冠状病毒的检测，目前普遍存在对感染初期患者的检测灵敏度低、准确性差的问题。因此，如何提供一种新型冠状病毒的检测方法，可以提高检测反应的灵敏度与精准度，并可以对感染初期的病人进行及时的诊断与治疗，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用，所述引物探针组合具有良好的灵敏度，最低检测限度可达1×103 copies/mL，特异性好，检测结果准确，具有极高的应用价值。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种检测新型冠状病毒的引物探针组合，所述检测新型冠状病毒的引物探针组合包括特异性扩增并检测2019-nCoV的ORF1ab基因、核壳蛋白N基因和刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对和探针；
扩增所述ORF1ab基因的特异性引物对包括SEQ ID No.1~2所示的核苷酸序列，检测所述ORF1ab基因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
扩增所述核壳蛋白N基因的特异性引物对包括SEQ ID No.4~5所示的核苷酸序列，检测所述核壳蛋白N基因的探针包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
扩增所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对包括SEQ ID No.7~8所示的核苷酸序列，检测所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的探针包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.1：ACCGCAAGGTTCTTCTTCGT；
SEQ ID No.2：CAAGCTCGTCGCCTAAGTCA；
SEQ ID No.3：CTGGTGGCCATAGTTACGGCGCCG；
SEQ ID No.4：TGGACCCCAAAATCAGCGAA；
SEQ ID No.5：CCCACTGCGTTCTCCATTCT；
SEQ ID No.6：GCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCC；
SEQ ID No.7：AGGTTTTAATTGTTACTTTCCT；
SEQ ID No.8：GCATGTAGAAGTTCAAAAGAAAG；
SEQ ID No.9：CCCACTTATGGTGTTGG。
本发明中，基于多重qPCR技术，可以对ORF1ab基因、N基因和S基因进行同步检测，并且可以对新型冠状病毒的S基因N501Y位点的突变情况进行检测，对病毒的突变株与原始株进行有效鉴别，从而采取更加有效的预防及治疗措施，灵敏度高，重复性好，准确性高，具有广阔的应用前景。
优选地，所述检测新型冠状病毒的引物探针组合还包括特异性扩增并检测内标基因RNaseP的特异性引物对和探针。
优选地，扩增所述内标基因RNaseP的特异性引物对包括SEQ ID No.10~11所示的核苷酸序列，检测所述内标基因RNaseP的探针包括SEQ ID No.12所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.10：AATTCGGCACGAGGTGGGAC；
SEQ ID No.11：TGAATAGCCAAGGTGAGCGG；
SEQ ID No.12：TGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCT。
本发明中，选用人RNaseP蛋白基因作为内源性内标，用于监控样本采集、提取及检测整个实验流程，避免假阴性出现。
本发明中，所有的探针Tm值近乎相同且高于引物Tm值8~10℃，所有引物的Tm值均在58~60℃之间，确保引物在延伸时探针保持与目标序列的结合，检测结果更加准确。
优选地，所述探针含有荧光标记基团。
优选地，所述探针的5’端的荧光标记基团包括荧光发生基团，所述荧光发生基团包括FAM、HEX、ROX或Cy5中的任意一种。
优选地，所述探针的3’端的荧光标记基团包括荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团包括MGB。
优选地，检测所述ORF1ab基因的探针的5’端的荧光发生基团包括FAM，3’端的荧光淬灭基团包括MGB。
优选地，检测所述核壳蛋白N基因的探针的5’端的荧光发生基团包括HEX，3’端的荧光淬灭基团包括MGB。
优选地，检测所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的探针的5’端的荧光发生基团包括ROX，3’端的荧光淬灭基团包括MGB。
优选地，检测所述内标基因RNaseP的探针的5’端的荧光发生基团包括Cy5，3’端的荧光淬灭基团包括MGB。
本发明中，选用不同的荧光发生基团对探针进行分别标记，可以在一次扩增反应中对多个待测基因进行同时检测，降低了检测成本，提高了检测效率。
第二方面，本发明提供了一种检测新型冠状病毒的试剂盒，所述检测新型冠状病毒的试剂盒包括第一方面所述的检测新型冠状病毒的引物探针组合；
所述检测新型冠状病毒的试剂盒还包括PCR缓冲液和酶混合液。
本发明中，通过对检测体系进行优化，配合相关靶点基因的检测引物探针及内标基因的引物探针，可以对样本采集、提取、扩增甚至整个检测流程进行监控，结果准确，具有良好的特异性；检测用时较短，效率较高。
优选地，所述特异性扩增并检测ORF1ab基因、核壳蛋白N基因和刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对和探针的使用浓度独立地为180~220 nM，例如可以是180nM、185 nM、190 nM、195 nM、200 nM、205 nM、210 nM、215 nM或220 nM等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述特异性扩增并检测内标基因RNaseP的特异性引物对和探针的使用浓度独立地为80~120 nM，例如可以是80 nM、85 nM、90 nM、95 nM、100 nM、105 nM、110 nM、115 nM或120 nM等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述Tris-HCl在所述PCR缓冲液中的浓度为26~30 mol/L，例如可以是26mol/L、26.5 mol/L、27 mol/L、27.5 mol/L、28 mol/L、28.5 mol/L、29 mol/L、29.5 mol/L或30 mol/L等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述Tris-HCl的pH值为8~8.5，例如可以是8、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述(NH4)2SO4在所述PCR缓冲液中的浓度为15~25 mmol/L，例如可以是15mmol/L、16 mmol/L、17 mmol/L、18 mmol/L、19 mmol/L、20 mmol/L、21 mmol/L、22 mmol/L、23 mmol/L、24 mmol/L或25 mmol/L等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述KCl在所述PCR缓冲液中的浓度为28~32 mmol/L，例如可以是28mmol/L、28.5 mmol/L、29 mmol/L、29.5 mmol/L、30 mmol/L、30.5 mmol/L、31 mmol/L、31.5mmol/L或32 mmol/L等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述MgCl2在所述PCR缓冲液中的浓度为3.5~4.5mmol/L，例如可以是3.5mmol/L、3.6 mmol/L、3.7 mmol/L、3.8 mmol/L、3.9 mmol/L、4 mmol/L、4.1 mmol/L、4.2mmol/L、4.3 mmol/L、4.4 mmol/L或4.5 mmol/L等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述dNTPs在所述PCR缓冲液中的浓度为0.15~0.25 mol/L，例如可以是0.15 mol/L、0.16 mol/L、0.17 mol/L、0.18 mol/L、0.19 mol/L、0.2 mol/L、0.21 mol/L、0.22 mol/L、0.23 mol/L、0.24 mol/L或0.25 mol/L等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
作为优选技术方案，本发明所述PCR缓冲液包括26~30 mol/L Tris-HCl、15~25mmol/L (NH4)2SO4、28~32 mmol/L KCl、3.5~4.5 mmol/L MgCl2和0.15~0.25 mol/L dNTPs。
优选地，所述热启动Taq酶在所述酶混合液中的浓度为3~8 U，例如可以是3 U、3.5U、4 U、4.5 U、5 U、5.5 U、6 U、6.5 U、7 U、7.5 U或8 U等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述逆转录酶在所述酶混合液中的浓度为3~8 U，例如可以是3 U、3.5 U、4 U、4.5 U、5 U、5.5 U、6 U、6.5 U、7 U、7.5 U或8 U等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述尿嘧啶糖基化酶在所述酶混合液中的浓度为0.05~0.2 U，例如可以是0.05 U、0.06 U、0.07 U、0.08 U、0.09 U、0.1 U、0.11 U、0.12 U、0.13 U、0.14 U、0.15U、0.16 U、0.17 U、0.18 U、0.19 U或0.2 U等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明中，通过加入尿嘧啶糖基化酶可以防止样本被污染，避免假阳性结果的出现。
作为优选技术方案，本发明所述酶混合液包括3~8 U热启动Taq酶、3~8 U逆转录酶和0.05~0.2 U尿嘧啶糖基化酶。
优选地，所述检测新型冠状病毒的试剂盒还包括空白对照和阳性对照。
优选地，所述空白对照包括无RNA酶的水。
优选地，所述2019-nCoV ORF1ab基因假病毒在所述阳性对照中的浓度为(0.8~1.2)×105 copies/mL，例如可以是0.8×105 copies/mL、0.9×105 copies/mL、1×105copies/mL、1.1×105 copies/mL或1.2×105 copies/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述2019-nCoV核壳蛋白N基因假病毒在所述阳性对照中的浓度为(0.8~1.2)×105 copies/mL，例如可以是0.8×105 copies/mL、0.9×105 copies/mL、1×105copies/mL、1.1×105 copies/mL或1.2×105 copies/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述2019-nCoV刺突蛋白S基因假病毒在所述阳性对照中的浓度为(0.8~1.2)×105 copies/mL，例如可以是0.8×105 copies/mL、0.9×105 copies/mL、1×105copies/mL、1.1×105 copies/mL或1.2×105 copies/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述内标基因RNaseP假病毒在所述阳性对照中的浓度为(0.8~1.2)×104copies/mL，例如可以是0.8×104 copies/mL、0.9×104 copies/mL、1×104 copies/mL、1.1×104 copies/mL或1.2×104 copies/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
作为优选技术方案，本发明所述阳性对照包括(0.8~1.2)×105 copies/mL的2019-nCoV ORF1ab基因假病毒、(0.8~1.2)×105 copies/mL的2019-nCoV核壳蛋白N基因假病毒和(0.8~1.2)×105 copies/mL的2019-nCoV刺突蛋白S基因假病毒和(0.8~1.2)×104copies/mL的内标基因RNaseP假病毒。
第三方面，本发明提供了一种第二方面所述的检测新型冠状病毒的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括：
提取待测样本核酸，加入检测新型冠状病毒的引物探针组合、PCR缓冲液和酶混合液进行qPCR检测，根据扩增曲线和反应Ct值对结果进行判断。
本发明中，所述使用方法操作简单，技术成熟，容易掌握，检测效率高，促进了相关产品的使用。
优选地，所述使用方法还包括使用空白对照和阳性对照进行同步检测的步骤。
本发明中，根据扩增曲线和反应Ct值判断检测结果：
（1）FAM、HEX和ROX通道Ct值>40或无明显扩增曲线，且Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒阴性；
（2）FAM、HEX、ROX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），且Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒N501Y突变株阳性；
（3）FAM、HEX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），ROX通道无扩增曲线或Ct值>40，且Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒原始株阳性；
（4）FAM或HEX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），另一通道无扩增曲线，需进行复检，复检结果一致，且ROX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒N501Y突变株阳性；复检结果一致，且ROX通道无扩增曲线或Ct值>40，Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判定样本为2019新型冠状病毒原始株阳性；复检结果为阴性，且Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒阴性；
（5）ROX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），FAM、HEX通道Ct值>40或无明显扩增曲线，Cy5荧光检测通道Ct值≤40，判断样本为新型冠状病毒阴性；
（6）FAM、HEX、ROX、Cy5通道Ct值>40或无明显扩增曲线，判断为无效样本，需要重新检测。
作为优选技术方案，本发明所述检测新型冠状病毒的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，包括：
提取待测样本核酸，加入检测新型冠状病毒的引物探针组合、PCR缓冲液和酶混合液进行qPCR检测，使用空白对照和阳性对照进行同步检测，根据扩增曲线和反应Ct值对结果进行判断；
所述判断的标准如下：
（1）FAM、HEX和ROX通道Ct值>40或无明显扩增曲线，且Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒阴性；
（2）FAM、HEX、ROX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），且Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒N501Y突变株阳性；
（3）FAM、HEX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），ROX通道无扩增曲线或Ct值>40，且Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒原始株阳性；
（4）FAM或HEX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），另一通道无扩增曲线，需进行复检，复检结果一致，且ROX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒N501Y突变株阳性；复检结果一致，且ROX通道无扩增曲线或Ct值>40，Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判定样本为2019新型冠状病毒原始株阳性；复检结果为阴性，且Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒阴性；
（5）ROX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），FAM、HEX通道Ct值>40或无明显扩增曲线，Cy5荧光检测通道Ct值≤40，判断样本为新型冠状病毒阴性；
（6）FAM、HEX、ROX、Cy5通道Ct值>40或无明显扩增曲线，判断为无效样本，需要重新检测。
第四方面，本发明提供了第一方面所述的检测新型冠状病毒的引物探针组合或第二方面所述的检测新型冠状病毒的试剂盒在制备新型冠状病毒检测装置中的应用。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明所述检测新型冠状病毒的引物探针组合具有良好的特异性与灵敏度，灵敏度可达1×103 copies/mL，可以对RF1ab基因、N基因和S基因进行同步检测，同时设置检测内标基因的探针及引物对，可以对采集样本质量及PCR抑制因素进行评估，对检测的过程进行质量控制，检测结果更加准确，重复性极好；
（2）本发明通过对检测体系进行优化，可以对待测样本进行快速准确的检测，通过设置空白对照和阳性对照，配合检测内标基因的探针及引物对，可以对样本采集、提取及检测的整个实验流程进行监控，避免假阴性的出现；通过向体系中添加尿嘧啶糖基化酶，可以避免扩增产物被污染，从而产生假阳性结果，结果准确，用时较短，并且可以对S基因N501Y位点的突变情况进行检测，从而采取更有针对性的治疗方案，对于患者的救治及疫情的控制具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例4中N基因假病毒的扩增曲线图片；
图2为本发明实施例4中MERS冠状病毒的扩增曲线图片；
图3为本发明实施例4中阳性对照假病毒的扩增曲线图片；
图4为本发明实施例4中空白对照的扩增曲线图片；
图5为本发明实施例5中不同组别样本的扩增曲线图片。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
热启动Taq酶购自天根生化科技（北京）有限公司；
逆转录酶购自宝生物工程（大连）有限公司；
尿嘧啶糖基化酶购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；
2019-nCoV ORF1ab基因假病毒、2019-nCoV核壳蛋白N基因假病毒和内标基因RNaseP假病毒来自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；
2019-nCoV刺突蛋白S基因假病毒来自复百澳（苏州）生物科技有限公司；
质控品、内标质控品和其他种类的病毒及细菌质控品来自邦德胜公司；
核酸提取试剂盒购自英潍捷基（上海）贸易有限公司；
已知检测结果的核酸样本来自广东省疾病预防控制中心。
实施例1
本实施例提供一种检测新型冠状病毒的引物探针组合，包括特异性扩增并检测2019-nCoV的ORF1ab基因、核壳蛋白N基因和刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对和探针，以及特异性扩增并检测内标基因RNaseP的特异性引物对和探针。
扩增所述ORF1ab基因的特异性引物对包括SEQ ID No.1~2所示的核苷酸序列，检测所述ORF1ab基因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
扩增所述核壳蛋白N基因的特异性引物对包括SEQ ID No.4~5所示的核苷酸序列，检测所述核壳蛋白N基因的探针包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
扩增所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对包括SEQ ID No.7~8所示的核苷酸序列，检测所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的探针包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；
扩增所述内标基因RNaseP的特异性引物对包括SEQ ID No.10~11所示的核苷酸序列，检测所述内标基因RNaseP的探针包括SEQ ID No.12所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.1：ACCGCAAGGTTCTTCTTCGT；
SEQ ID No.2：CAAGCTCGTCGCCTAAGTCA；
SEQ ID No.3：CTGGTGGCCATAGTTACGGCGCCG；
SEQ ID No.4：TGGACCCCAAAATCAGCGAA；
SEQ ID No.5：CCCACTGCGTTCTCCATTCT；
SEQ ID No.6：GCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCC；
SEQ ID No.7：AGGTTTTAATTGTTACTTTCCT；
SEQ ID No.8：GCATGTAGAAGTTCAAAAGAAAG；
SEQ ID No.9：CCCACTTATGGTGTTGG。
SEQ ID No.10：AATTCGGCACGAGGTGGGAC；
SEQ ID No.11：TGAATAGCCAAGGTGAGCGG；
SEQ ID No.12：TGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCT。
所述探针含有荧光标记基团，所述探针的5’端的荧光标记基团包括荧光发生基团，3’端的荧光标记基团包括荧光淬灭基团，其中，
检测所述ORF1ab基因的探针的5’端的荧光发生基团包括FAM，3’端的荧光淬灭基团包括MGB；
检测所述核壳蛋白N基因的探针的5’端的荧光发生基团包括HEX，3’端的荧光淬灭基团包括MGB；
检测所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的探针的5’端的荧光发生基团包括ROX，3’端的荧光淬灭基团包括MGB；
检测所述内标基因RNaseP的探针的5’端的荧光发生基团包括Cy5，3’端的荧光淬灭基团包括MGB。
本实施例中，所有引物的Tm值均在58~60℃，所有探针的Tm值高于引物Tm值8~10℃，且近乎相同，可以保证引物在延伸时探针可以与目标序列保持结合，提高检测结果的准确性。
实施例2
本实施例提供一种检测新型冠状病毒的试剂盒，所述检测新型冠状病毒的试剂盒包括实施例1所述的检测新型冠状病毒的引物探针组合，所述特异性扩增并检测ORF1ab基因、核壳蛋白N基因和刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对和探针的使用浓度为200nM，所述特异性扩增并检测内标基因RNaseP的特异性引物对和探针的使用浓度为100 nM。
所述检测新型冠状病毒的试剂盒还包括PCR缓冲液和酶混合液，所述PCR缓冲液包括28 mol/L pH 8.0 Tris-HCl、20 mmol/L (NH4)2SO4、30 mmol/L KCl、4 mmol/L MgCl2和0.12 mol/L dNTPs，所述酶混合液包括5 U热启动Taq酶、5 U逆转录酶和0.1 U尿嘧啶糖基化酶。
所述检测新型冠状病毒的试剂盒还包括空白对照和阳性对照，所述空白对照包括无RNA酶的水，阳性对照包括1×105 copies/mL的2019-nCoV ORF1ab基因假病毒、1×105copies/mL的2019-nCoV核壳蛋白N基因假病毒和1×105 copies/mL的2019-nCoV刺突蛋白S基因假病毒和1×104 copies/mL的内标基因RNaseP假病毒。
本实施例通过对扩增体系进行优化，并配合尿嘧啶糖基化酶、空白对照和阳性对照，保证了检测结果的准确性，应用价值更高。
对比例1
与实施例2的区别仅在于，本对比例中，
扩增所述ORF1ab基因的特异性引物对包括SEQ ID No.13~14所示的核苷酸序列，检测所述ORF1ab基因的探针包括SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；
扩增所述核壳蛋白N基因的特异性引物对包括SEQ ID No.16~17所示的核苷酸序列，检测所述核壳蛋白N基因的探针包括SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；
扩增所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对包括SEQ ID No.19~20所示的核苷酸序列，检测所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的探针包括SEQ ID No.21所示的核苷酸序列；
扩增所述内标基因RNaseP的特异性引物对包括SEQ ID No.22~23所示的核苷酸序列，检测所述内标基因RNaseP的探针包括SEQ ID No.24所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.13：GAGCCTTGTCCCTGGTTTCA；
SEQ ID No.14：TCCTCCACGGAGTCTCCAAA；
SEQ ID No.15：TTCGCGACGTGCTCGTACGTGGC；
SEQ ID No.16：ACCAGAATGGAGAACGCAGT；
SEQ ID No.17：GAGTGAGAGCGGTGAACCAA；
SEQ ID No.18：GGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCC；
SEQ ID No.19：ACTTTCCTTTACAATCATATGG；
SEQ ID No.20：AGTTCAAAAGAAAGTACTACTA；
SEQ ID No.21：ACCCACTTATGGTGTTG；
SEQ ID No.22：ATCTAGTGCTGCAGAAAGGC；
SEQ ID No.23：CTTGGCGTCACTTTCAGAGA；
SEQ ID No.24：TGGCAAATCTAGGCTTGCTGTTTGGGC。
其余材料及组分与实施例2相同。
对比例2
与实施例2的区别仅在于，本对比例中，
扩增所述ORF1ab基因的特异性引物对包括SEQ ID No.25~26所示的核苷酸序列，检测所述ORF1ab基因的探针包括SEQ ID No.27所示的核苷酸序列；
扩增所述核壳蛋白N基因的特异性引物对包括SEQ ID No.28~29所示的核苷酸序列，检测所述核壳蛋白N基因的探针包括SEQ ID No.30所示的核苷酸序列；
扩增所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对包括SEQ ID No.31~32所示的核苷酸序列，检测所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的探针包括SEQ ID No.33所示的核苷酸序列；
扩增所述内标基因RNaseP的特异性引物对包括SEQ ID No.34~35所示的核苷酸序列，检测所述内标基因RNaseP的探针包括SEQ ID No.36所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.25：ACACTTGGTGTCCTTGTCCC；
SEQ ID No.26：AAGCTCGTCGCCTAAGTCAA；
SEQ ID No.27：TGGTGGCCATAGTTACGGCGCCG；
SEQ ID No.28：TGCTGCAATCGTGCTACAAC；
SEQ ID No.29：ACTGCTGCCTGGAGTTGAAT；
SEQ ID No.30：ACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCA；
SEQ ID No.31：ATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGT；
SEQ ID No.32：TGCATGTAGAAGTTCAAAAGAA；
SEQ ID No.33：CCAACCCACTTATGGTG；
SEQ ID No.34：ATCTAGGCTTGCTGTTTGGG；
SEQ ID No.35：GCCGAGGTTTCTTCACTGTA；
SEQ ID No.36：ACGCCAAGGCTGCGGTGTCC。
其余材料及组分与实施例2相同。
对比例3
与实施例2的区别仅在于，本对比例中，
扩增所述ORF1ab基因的特异性引物对包括SEQ ID No.37~38所示的核苷酸序列，检测所述ORF1ab基因的探针包括SEQ ID No.39所示的核苷酸序列；
扩增所述核壳蛋白N基因的特异性引物对包括SEQ ID No.40~41所示的核苷酸序列，检测所述核壳蛋白N基因的探针包括SEQ ID No.42所示的核苷酸序列；
扩增所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对包括SEQ ID No.43~44所示的核苷酸序列，检测所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的探针包括SEQ ID No.45所示的核苷酸序列；
扩增所述内标基因RNaseP的特异性引物对包括SEQ ID No.46~47所示的核苷酸序列，检测所述内标基因RNaseP的探针包括SEQ ID No.48所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.37：GGGCGAAATACCAGTGGCTT；
SEQ ID No.38：GATCAGTGCCAAGCTCGTCG；
SEQ ID No.39：GTGGCCATAGTTACGGCGCCGAT；
SEQ ID No.40：CGTGGTCCAGAACAAACCCA；
SEQ ID No.41：GTGACTTCCATGCCAATGCG；
SEQ ID No.42：GCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGG；
SEQ ID No.43：TGTAATGGTGTTGAAGGTTTTA；
SEQ ID No.44：GGTGCATGTAGAAGTTCAAA；
SEQ ID No.45：CCAACCCACTTATGGTGT；
SEQ ID No.46：TACAGTGAAGAAACCTCGGC；
SEQ ID No.47：AAGAAGGGAGTGCTGACAGA；
SEQ ID No.48：TGTGAGGGCTGAAAAGAATGCCCCA。
其余材料及组分与实施例2相同。
实施例3
本实施例对实施例2及对比例1~3制备的检测新型冠状病毒的试剂盒进行检测，使用质控品和内标质控品作为模板进行检测。
扩增体系如下：
组分 体积（μL）
引物探针组合物和PCR缓冲液 23.5
酶混合液 1.5
模板 5
总体积 30
扩增程序如下：
55℃，15 min；
95℃，30 s；
95℃，5 s；60℃，20 s，循环45次。
各荧光检测通道的Ct均值如表1所示。
表1
Figure 693005DEST_PATH_IMAGE001
由表1可以看出，相比于对比例1~3，实施例2中的引物探针组合，针对每个新型冠状病毒特异基因的检出敏感性及特异性最优。本发明的引物探针组合最大优势之一是针对在同一PCR反应体系中共有4对引物和4条探针，实现了多对引物及探针针对不同新型冠状病毒特异基因进行同步检测，并保证针对每种新型冠状病毒特异基因检测的敏感性及特异性均能满足临床检测要求，引物探针设计是至关重要的。
实施例4
本实施例检测实施例2制备的检测新型冠状病毒的试剂盒的准确性与灵敏性，步骤如下：
将试剂盒中的阳性对照进行10倍梯度稀释作为样本模板，参照实施例3中的扩增体系与程序进行扩增检测，结果如表2所示。
表2
Figure 311943DEST_PATH_IMAGE002
其中，N基因假病毒的扩增曲线如图1所示，其余组别的扩增结果与图1类似，此处不再赘述。
根据表2中的检测结果，可以看出本发明所述检测新型冠状病毒的试剂盒的灵敏度很高，对ORF1ab基因、N基因和S基因的最低检测限均可达1×103 copies/mL，结合图1的扩增曲线，可以看出扩增曲线线性关系较好，说明反应特异性较好。
此外，对其他种类的病毒的质控品进行相同的扩增来验证试剂盒的特异性，具体包括地方性人类冠状病毒（HKU1、OC43、NL63和229E）、MERS冠状病毒、H1N1（新型甲型H1N1流感病毒2009、季节性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9、乙型流感Yamagata、Victoria、呼吸道合胞病毒A、B型、副流感病毒1、2、3型、鼻病毒A、B、C组、腺病毒1、2、3、4、5、7、55型、肠道病毒A、B、C、D组、人偏肺病毒（人间质肺病毒）、EB病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、轮状病毒、诺如病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、烟曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌和新生隐球菌，同时使用人类基因组DNA作为对照，并使用阳性对照假病毒和空白对照进行同步扩增。
结果显示，其他种类的病毒及细菌质控品以及人类基因组DNA作为模板的扩增体系均检测不到荧光信号，证明未发生扩增反应，其中，MERS冠状病毒的扩增曲线如图2所示，其余样本的检测结果与其类似，此处不再赘述。此外，阳性对照假病毒的扩增曲线如图3所示，空白对照的扩增结果如图4所示，可以看出对照组的扩增结果与预期相符，证明反应体系无误，进一步证明了检测结果的准确性。
实施例5
本实施例使用实施例2制备的检测新型冠状病毒的试剂盒，对30例（21例原始株阳性，1例S基因N501Y突变株阳性，8例阴性）已知检测结果的核酸样本进行检测，步骤如下：
使用核酸提取试剂盒参照说明书上的步骤提取样本的核酸，作为模板进行检测，同时使用阳性对照和阴性对照进行同步检测，扩增体系和扩增程序与实施例2中的相同。检测结果如表3所示，扩增曲线如图5所示。
表3
Figure 498205DEST_PATH_IMAGE003
根据扩增曲线和反应Ct值对结果进行判断；
所述判断的标准如下：
（1）FAM、HEX和ROX通道Ct值>40或无明显扩增曲线，且Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒阴性；
（2）FAM、HEX、ROX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），且Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒N501Y突变株阳性；
（3）FAM、HEX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），ROX通道无扩增曲线或Ct值>40，且Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒原始株阳性；
（4）FAM或HEX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），另一通道无扩增曲线，需进行复检，复检结果一致，且ROX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒N501Y突变株阳性；复检结果一致，且ROX通道无扩增曲线或Ct值>40，Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判定样本为2019新型冠状病毒原始株阳性；复检结果为阴性，且Cy5通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），判断样本为新型冠状病毒阴性；
（5）ROX通道Ct值≤40（有明显扩增曲线），FAM、HEX通道Ct值>40或无明显扩增曲线，Cy5荧光检测通道Ct值≤40，判断样本为新型冠状病毒阴性；
（6）FAM、HEX、ROX、Cy5通道Ct值>40或无明显扩增曲线，判断为无效样本，需要重新检测。
由表3和图5可知，曲线的线性较好，检测结果与预期完全相符，检测结果准确，用时较短，具有广阔的应用前景。
综上所述，本发明所述检测新型冠状病毒的引物特异性好，灵敏度高，检测结果准确；所述检测新型冠状病毒的试剂盒体系科学，使用方便，可以降低假阴性或假阳性结果的发生概率；可在同一次检测反应中对ORF1ab基因、N基因和S基因同时进行检测，用时较短，检测效率高，同时节省了检测试剂；还可以对N501Y的突变情况进行检测，方便采取针对性的治疗与控制措施，应用价值极高。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 广东凯普生物科技股份有限公司
成都凯普医学检验所有限公司
郑州凯普医学检验所(有限合伙)
广州凯普医药科技有限公司
<120> 一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用
<130> 2021
<160> 48
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
accgcaaggt tcttcttcgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caagctcgtc gcctaagtca 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctggtggcca tagttacggc gccg 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tggaccccaa aatcagcgaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cccactgcgt tctccattct 20
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcaccccgca ttacgtttgg tggaccc 27
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aggttttaat tgttactttc ct 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcatgtagaa gttcaaaaga aag 23
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cccacttatg gtgttgg 17
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aattcggcac gaggtgggac 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgaatagcca aggtgagcgg 20
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tggacctgcg agcgggttct gacct 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gagccttgtc cctggtttca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tcctccacgg agtctccaaa 20
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ttcgcgacgt gctcgtacgt ggc 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
accagaatgg agaacgcagt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gagtgagagc ggtgaaccaa 20
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gggcgcgatc aaaacaacgt cggcccc 27
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
actttccttt acaatcatat gg 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
agttcaaaag aaagtactac ta 22
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
acccacttat ggtgttg 17
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
atctagtgct gcagaaaggc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cttggcgtca ctttcagaga 20
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tggcaaatct aggcttgctg tttgggc 27
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
acacttggtg tccttgtccc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
aagctcgtcg cctaagtcaa 20
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tggtggccat agttacggcg ccg 23
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tgctgcaatc gtgctacaac 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
actgctgcct ggagttgaat 20
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
acgcagaagg gagcagaggc ggca 24
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
atggtgttga aggttttaat tgt 23
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tgcatgtaga agttcaaaag aa 22
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ccaacccact tatggtg 17
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
atctaggctt gctgtttggg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gccgaggttt cttcactgta 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
acgccaaggc tgcggtgtcc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gggcgaaata ccagtggctt 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gatcagtgcc aagctcgtcg 20
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gtggccatag ttacggcgcc gat 23
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
cgtggtccag aacaaaccca 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gtgacttcca tgccaatgcg 20
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
gcccccagcg cttcagcgtt cttcgg 26
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
tgtaatggtg ttgaaggttt ta 22
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ggtgcatgta gaagttcaaa 20
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ccaacccact tatggtgt 18
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
tacagtgaag aaacctcggc 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
aagaagggag tgctgacaga 20
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
tgtgagggct gaaaagaatg cccca 25

Claims (5)

1.一种检测新型冠状病毒的引物探针组合，其特征在于，所述检测新型冠状病毒的引物探针组合包括特异性扩增并检测2019-nCoV的ORF1ab基因、核壳蛋白N基因和刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对和探针；
扩增所述ORF1ab基因的特异性引物对为SEQ ID No.1~2所示的核苷酸序列，检测所述ORF1ab基因的探针为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
扩增所述核壳蛋白N基因的特异性引物对为SEQ ID No.4~5所示的核苷酸序列，检测所述核壳蛋白N基因的探针为SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
扩增所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对为SEQ ID No.7~8所示的核苷酸序列，检测所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的探针为SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；
所述检测新型冠状病毒的引物探针组合还包括特异性扩增并检测内标基因RNaseP的特异性引物对和探针；
扩增所述内标基因RNaseP的特异性引物对为SEQ ID No.10~11所示的核苷酸序列，检测所述内标基因RNaseP的探针为SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；
所述探针的5’端标记荧光发生基团；
所述探针的3’端标记荧光淬灭基团；
检测所述ORF1ab基因的探针的5’端的荧光发生基团为FAM，3’端的荧光淬灭基团为MGB；
检测所述核壳蛋白N基因的探针的5’端的荧光发生基团为HEX，3’端的荧光淬灭基团为MGB；
检测所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的探针的5’端的荧光发生基团为ROX，3’端的荧光淬灭基团为MGB；
检测所述内标基因RNaseP的探针的5’端的荧光发生基团为Cy5，3’端的荧光淬灭基团为MGB。
2.一种检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述检测新型冠状病毒的试剂盒包括权利要求1所述的检测新型冠状病毒的引物探针组合；
所述检测新型冠状病毒的试剂盒还包括PCR缓冲液和酶混合液。
3.根据权利要求2所述的检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增并检测ORF1ab基因、核壳蛋白N基因和刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对和探针的使用浓度独立地为180~220 nM；
所述特异性扩增并检测内标基因RNaseP的特异性引物对和探针的使用浓度独立地为80~120 nM；
所述PCR缓冲液包括26~30 mol/L Tris-HCl、15~25 mmol/L (NH4)2SO4、28~32 mmol/LKCl、3.5~4.5 mmol/L MgCl2和0.15~0.25 mol/L dNTPs；
所述酶混合液包括3~8 U热启动Taq酶、3~8 U逆转录酶和0.05~0.2 U尿嘧啶糖基化酶。
4.根据权利要求2所述的检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述检测新型冠状病毒的试剂盒还包括空白对照和阳性对照；
所述空白对照为无RNA酶的水；
所述阳性对照为(0.8~1.2)×105 copies/mL的2019-nCoV ORF1ab基因假病毒、(0.8~1.2)×105 copies/mL的2019-nCoV核壳蛋白N基因假病毒和(0.8~1.2)×105 copies/mL的2019-nCoV刺突蛋白S基因假病毒和(0.8~1.2)×104 copies/mL的内标基因RNaseP假病毒。
5.一种权利要求2~4任一项所述的检测新型冠状病毒的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：
提取待测样本核酸，加入检测新型冠状病毒的引物探针组合、PCR缓冲液和酶混合液进行qPCR检测，使用空白对照和阳性对照进行同步qPCR检测，根据扩增曲线和反应Ct值对结果进行判断。
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