CN114134143A - 检测标志物、引物、探针或其组合，以及检测试剂、检测试剂盒 - Google Patents

检测标志物、引物、探针或其组合，以及检测试剂、检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测试剂领域，特别涉及检测标志物、引物、探针或其组合，以及检测试剂、检测试剂盒。本发明提供了鉴定新冠变异株B.1.1.7的引物、探针和试剂盒。本试剂盒对口腔拭子、鼻咽拭子和/或痰液中的新冠病毒进行快速地鉴定，具有良好的灵敏度和准确度，且能避免其他类型的常见病毒对实验结果的干扰，为新冠变异株B.1.1.7的鉴定提供可靠的实验依据。

Description

检测标志物、引物、探针或其组合，以及检测试剂、检测试剂盒
技术领域
本发明涉及检测试剂领域，特别涉及检测标志物、引物、探针或其组合，以及检测试剂、检测试剂盒。
背景技术
B.1.1.7是新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus2， SARS-CoV-2)的变异菌株之一，又被成为SARS-CoV-2 variant of concern (VOC)。新型冠状病毒可使感染者患上新冠肺炎，进而出现发热、乏力、干咳等症状，部分患者伴有流鼻涕、鼻塞、咽喉痛等症状，严重者呼吸困难、脓毒症休克、代谢性酸中毒，甚至死亡。在发现的新型冠状病毒变异株中，多数并未对新冠病毒的性能产生影响，其中有三种变异株引起了人们的重大关注，分别为B.1.1.7、B.351、P1。目前的证据并未表明新冠变异株B.1.1.7比普通新冠病毒具有更强的致病性，但是证明B.1.1.7更容易进入人体细胞和逃脱人体免疫防御系统且具有更强的传播能力。B.1.1.7的主要特征在于其刺突蛋白(Spike,S)上积累了10个氨基酸位点的突变，包括N501Y和69-70del。N501Y 是S蛋白的第501位天冬酰胺(N)突变为酪氨酸(Y)，这一突变增强了S蛋白与人细胞表面血管紧张素转换酶2(angiotensinconverting enzyme 2，ACE2) 受体的结合能力，促进病毒进入细胞。69-70del是指新冠病毒S蛋白的第69位组氨酸和70位缬氨酸氨基酸缺失，此缺失改变了S蛋白的构象，可能有利于病毒逃逸宿主的免疫反应。
目前新冠病毒的检测方法有：核酸检测，即通过荧光PCR技术或测序技术直接检测新型冠状病毒；血清学检查，发病3-5天后新型冠状病毒特异性IgM 抗体阳性，IgG抗体滴度恢复期较急性期有4倍及以上增高；胸部影像学检查，可通过影像学检查将感染者分为早期、进展期、危重期和吸收期等4个阶段，影像学检查并不能单独作为新冠病毒感染的证据，但是可弥补核酸检测和血清学检查的不足。这些检查可有效检测新型冠状病毒，但并不能将新冠变异株和普通新冠病毒区分开来。
利用新冠变异株B.1.1.7的特征突变位点，设计特异性引物探针，结合荧光PCR技术，可快速有效地鉴定新冠病毒新冠变异株B.1.1.7。此方法中，检测标志物的选择和引物探针的设计对检测试剂的特异性和灵敏性至关重要。
发明内容
有鉴于此，本发明提供新冠变异株B.1.1.7的检测标志物和检测试剂，进行新冠变异株B.1.1.7的检测和鉴定。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供了新型冠状病毒S基因的69-70del缺失序列和/或 N501Y序列作为标志物在制备检测试剂或检测试剂盒中的应用。
第二方面，本发明提供了新型冠状病毒S基因的69-70del缺失序列和 N501Y序列作为标志物在制备区分新冠变异株B.1.1.7和普通新型冠状病毒的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
第三方面，本发明还提供了引物探针组合，包括：
(I)、引物，具有如SEQ ID No.1～6任意所示的核苷酸序列；和
(II)、荧光探针，具有如SEQ ID No.7～9所示的核苷酸序列；或
(III)、如(I)或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(IV)、与(I)、(II)或(III)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述引物探针组合包括如下组合中的一种或两者以上：
组合一：检测新冠变异株B.1.1.7 69-70del位点的引物探针组合
(1)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
(2)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和
(3)、荧光探针具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；或
(4)、如(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(5)、与(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
组合二：检测新冠变异株B.1.1.7N501Y位点的引物探针组合
(6)、上游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和
(7)、下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和
(8)、荧光探针具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；或
(9)、如(6)、(7)或(8)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(6)、(7)或(8)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(10)、与(6)、(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
组合三：检测内参的引物探针组合，所述内参为核糖核酸酶基因
(11)、上游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和
(12)、下游引物具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；和
(13)、荧光探针具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；或
(14)、如(11)、(12)或(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(11)、(12)或(13)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(15)、与(11)、(12)或(13)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述引物探针组合中，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个或6个。
在本发明的一些具体实施方案中，所述引物探针组合：
具有如SEQ ID No.7所示核苷酸序列的探针的5’端修饰ROX基团，3’端修饰BHQ2基团；和/或
具有如SEQ ID No.8所示核苷酸序列的探针的5’端修饰FAM基团，3’端修饰MGB基团；和/或
具有如SEQ ID No.9所示核苷酸序列的探针的5’端修饰CY5基团，3’端修饰BHQ2基团。
第四方面，本发明还提供了所述引物探针组合在制备新冠病毒检测的试剂或试剂盒中的应用；所述新冠病毒包括新冠变异株B.1.1.7。
第五方面，本发明还提供了新冠变异株B.1.1.7的检测试剂或检测试剂盒，包括所述引物探针组合以及常用的助剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的检测试剂或检测试剂盒包括 PCR反应液1和PCR反应液2；
所述PCR反应液1包含水、PCR反应缓冲液、KOAc、Glycerol、DMSO、 NaN3、dNTP、反转录酶、DNA聚合酶、具有如SEQ ID No.7～9任意所示核苷酸序列的探针；
所述PCR反应液2包含水、MgCl2、叠氮化钠、具有如SEQ ID No.1～6 任意所示核苷酸序列的引物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述检测试剂或检测试剂盒的扩增程序包括：50℃2min，60℃30min，95℃2min，(95℃10s，60℃22s)×45 循环，40℃10s。
第六方面，本发明还提供了本发明还提供了新冠变异株B.1.1.7的检测方法，取待测样本与本发明所述的引物探针组合或所述的试剂盒中的引物探针组合混合后扩增，检测。
在本发明的一些具体实施方案中，扩增体系包括：PCR反应液1 20μl， PCR反应液210μl，待测样品的核酸50μl。
在本发明的一些具体实施方案中，扩增程序包括：50℃2min，60℃30min， 95℃2min，(95℃10s，60℃22s)×45循环，40℃10s。
在本发明的一些具体实施方案中，扩增结果判断：阴性质控品CY5通道 Ct值≤35，FAM通道和ROX通道显示No Ct；阳性质控品Ct值应在20～30之间。
本发明提供了鉴定新冠变异株B.1.1.7的引物、探针和试剂盒。本试剂盒对口腔拭子、鼻咽拭子和/或痰液中的新冠病毒进行快速地鉴定，具有良好的灵敏度和准确度，且能避免其他类型的常见病毒对实验结果的干扰，为新冠变异株B.1.1.7的鉴定提供可靠的实验依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示69-70del引物探针方案筛选；
图2示N501Y引物探针方案筛选；
图3示体系优化前N501Y突变型和野生型扩增图；
图4示体系优化前N501Y突变型和野生型扩增图；
图5示N501Y检测限样本检测结果；
图6示69-70del检测限样本检测结果。
具体实施方式
本发明公开了检测标志物、引物、探针或其组合，以及检测试剂、检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明选择了新型冠状病毒S基因的69-70del缺失序列和N501Y序列作为标志物在制备检测试剂中的应用。
实验结果表明，以S基因的69-70del缺失序列和N501Y序列作为检测标志物，能够特异性的区分新冠变异株B.1.1.7和普通新型冠状病毒。
本发明还提供鉴定新冠变异株B.1.1.7 69-70del位点的引物探针组合，包括：SEQID No.1～2所示核苷酸序列的两条引物，和SEQ ID No.7所示核苷酸序列的探针。
本发明提供了鉴定新冠变异株B.1.1.7N501Y位点的引物探针组合，包括： SEQ IDNo.3～4所示核苷酸序列的两条引物，和SEQ ID No.8所示核苷酸序列的探针。
本发明还提供了鉴定新冠变异株B.1.1.7的试剂盒，其包括所述的鉴定突变位点69-70del和N501Y引物探针组合。
本发明所述试剂盒中还包括检测内参的引物探针组合，所述内参为核糖核酸酶基因，其引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5～6所示；其探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
本发明所提供的用于鉴定69-70del位点和N501Y位点的引物探针组合由多对引物探针方案筛选而来，各方案扩增曲线如图1和2，最终69-70del位点选择方案4，N501Y位点选择方案5。
本发明试剂盒中还包含一定浓度的PCR添加剂，通过优化，有效地抑制单个碱基差异而引起的非特异性扩增(如图3和4)。
具体的，所述试剂盒中包括PCR反应液1、PCR反应液2；
所述PCR反应液1包含水和PCR反应缓冲液、KOAc、Glycerol、DMSO、 NaN3、dNTP、反转录酶、DNA聚合酶、SEQ ID No.7～9所示核苷酸序列的3 条探针；
所述PCR反应液2包含水和MgCl2、叠氮化钠、SEQ ID No.1～6所示核苷酸序列的6条引物。
本发明提供的试剂盒中，PCR反应液1和2性能稳定，在2-8℃条件下保存超过6个月，无须-20℃保存，避免了反复冻融。实验结果表明，本发明提供的试剂盒在37℃加速21天后仍有良好的检测性能。
如上所述的试剂盒中，
SEQ ID No.7所示核酸序列的探针的5’端修饰ROX基团，3’端修饰BHQ2 基团；
SEQ ID No.8所示核酸序列的探针的5’端修饰FAM基团，3’端修饰MGB 基团；
SEQ ID No.9所示核酸序列的探针的5’端修饰CY5基团，3’端修饰BHQ2 基团；
如上所述的方法，优选地，扩增体系包括：PCR反应液1：20μl，PCR 反应液2：10μl，待测样品的核酸50μl。
如上所述的方法，优选地，扩增程序包括：50℃2min，60℃30min，95℃ 2min，(95℃10s，60℃22s)×45循环，40℃10s。
扩增结果判断：阴性质控品CY5通道Ct值≤35，FAM通道和ROX通道显示No Ct；阳性质控品Ct值应在20～30之间。
本发明提供了鉴定新冠变异株B.1.1.7的引物、探针和试剂盒。本试剂盒对口腔拭子、鼻咽拭子和/或痰液中的新冠病毒进行快速地鉴定，具有良好的灵敏度和准确度，且能避免其他类型的常见病毒对实验结果的干扰，为新冠变异株B.1.1.7的鉴定提供可靠的实验依据。
本发明提供的检测标志物、引物、探针或其组合，以及检测试剂、检测试剂盒中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1.用于鉴定新冠变异株B.1.1.7的荧光PCR试剂盒
具体包括以下组分：
(1)PCR反应液1：基础液是0.1MTris-HCl(pH8.0)，共20μl，包括0.3-0.8 pmol/μl探针1、0.3-0.8pmol/μl探针2、0.3-0.8pmol/μl探针3、0.4-0.6M KOAc、 10％-20％Glycerol、15％-20％DMSO、0.05％-0.1％NaN3、30-60U反转录酶、4-6U Taq酶、0.06-0.12UUNG，三条探针分别为：
探针1：5’-TCCATGCTATCTCTGGGACCAATGGT-3’(SEQ ID No.7)；
探针2：5’-CCAACCCACTTATG-3’(SEQ ID No.8)；
探针3：5’-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-3’(SEQ ID No.9)。
(2)PCR反应液2：基础液是H2O，共10μl，包括15-30mM MgCl2， 0.05％-0.1％叠氮化钠，2-5pmol/μl引物1、2-5pmol/μl引物2、2-5pmol/μl引物3、 2-5pmol/μl引物4、1-3pmol/μl引物5、1-3pmol/μl引物6，六条引物分别为：
引物1：5’-CTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGT-3’(SEQ ID No.1)；
引物2：5’-TCAGTGGAAGCAAAATAAACACCA-3’(SEQ ID No.2)；
引物3：5’-GGCCGGTAGCACACCTTGTA-3’(SEQ ID No.3)；
引物4：5’-TGCATGTAGAAGTTCAAAAGAAAGTACTACT-3’(SEQ ID No.4)；
引物5：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’(SEQ ID No.5)；
引物6：5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’(SEQ ID No.6)。
(3)阴性质控品：基础液是TE，600μl，包含人核糖核酸酶基因质粒。
(4)阳性质控品:基础液是TE，600μl，包含经溯源为4.0E+02Copies/μl 的69-70del片段质粒，经溯源为4.0E+03Copies/μlN501Y片段质粒，经溯源为 1.0E+02Copies/μl的人核糖核酸酶基因质粒。
实施例2.本发明试剂盒用于鉴定新冠变异株B.1.1.7的操作步骤：
1.试剂准备
根据待测样本、阴阳性质控品的数量，配制相应量的反应液(PCR反应液 1：20μl/每人份，PCR反应液2：10μl/每人份)，若总量为N，则配制N+1份PCR 反应液，混合备用。
2.模板RNA提取
使用商品化核酸提取试剂盒提取模板RNA。
3.聚合酶链式反应
在100μl PCR管中配制反应体系：PCR反应混合液30μl，模板RNA 50μl，并在PCR仪上进行扩增检测。扩增程序为：50℃2min，60℃30min，95℃2min， (95℃10s，60℃22s，45Cycle)，40℃10s。
4.结果判断
阴性质控品CY5通道显示Ct值≤35，FAM通道显示No Ct，ROX通道显示 No Ct；阳性质控品的三通道出值均应在20-30之间。在以上情况下，待测样品的结果解释如下：
表1结果解释
结果 解释
无效 该样本检测异常
No Ct 未检测出新冠变异株病毒，报告结果为“No Ct”
38＜Ct值 病毒载量低于检测浓度，报告结果为“阴性”
38≥Ct值 新冠变异株病毒载量高于检测浓度，报告结果为“阳性”
实施例3.新型冠状病毒S基因验证
取人工合成的新冠S基因样本，分别稀释至1.00E+7Copies/μl、 1.00E+06Copies/μl、1.00E+05Copies/μl、1.00E+04Copies/μl、1.00E+03Copies/ μl、1.00E+02Copies/μl、1.00E+01Copies/μl、1.00E+00Copies/μl，按照实施例1记载的试剂盒以及实施例2记载的操作步骤进行扩增检测，结果如表2 所示。
表2新型冠状病毒S基因验证结果
样本浓度(Copies/μl) FAM Ct ROXCt
1.00E+07 无Ct 无Ct
1.00E+06 无Ct 无Ct
1.00E+05 无Ct 无Ct
1.00E+04 无Ct 无Ct
1.00E+03 无Ct 无Ct
1.00E+02 无Ct 无Ct
1.00E+01 无Ct 无Ct
1.00E+00 无Ct 无Ct
实施例4.灵敏度测试
按照实施例1记载的试剂盒以及实施例2记载的操作步骤对20份 1Copies/μl样本进行检测，得到的扩增曲线如图5、6所示，数据如表3所示。
表3检测限验证结果
Figure BDA0003429091850000091
Figure BDA0003429091850000101
结论：本试剂盒对20例阳性性本(1Copies/μl)进行检测，结果均为阳性，证明试剂盒的检测限不大于1Copies/μl。
实施例5.特异性测试
按照实施例1记载的试剂盒以及实施例2记载的操作步骤，对34种可能与新冠病毒变异株B.1.1.7产生交叉反应的病原体以及人基因组进行检测，得到的结果如表4所示。
表4特异性检测结果
Figure BDA0003429091850000102
Figure BDA0003429091850000111
结论：本试剂盒对白色念珠菌、H1N1(2009)、烟曲霉、腮腺炎病毒、麻疹病毒、季H1N1、平滑念珠菌、H3N2、轮状病毒、H5N1、诺如病毒、H7N9、水痘带状疱疹病毒、B-Y-乙流、B-V-乙流、腺病毒1型腺病毒2型、腺病毒3 型、腺病毒4型、腺病毒5型、腺病毒7型、腺病毒55型、冠状病毒NL63、结核杆菌、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、冠状病毒HKU1、人鼻病毒A、人鼻病毒B、人鼻病毒C、肠道病毒A、肠道病毒B、肠道病毒C、肠道病毒 D、人基因组等无交叉反应。
实施例6.重复性测试
按照实施例1记载的试剂盒以及实施例2记载的操作步骤，验证精密度，设置中值、低值和阴性样本，每个样本10个重复，计算各自总CV，要求 CV％≤5％，结果如表5所示。
表5重复性检测结果
Figure BDA0003429091850000121
Figure BDA0003429091850000131
结论：中低值样本CV均小于5％，满足要求。
实施例7.稳定性验证
按照实施例1记载的试剂盒以及实施例2记载的操作步骤，验证稳定性，将试剂置于37℃条件下加速0天、7天、14天、21天，扩增检测高中低值样本和阴性样本。结果表6所示。
表6稳定性验证结果
Figure BDA0003429091850000132
Figure BDA0003429091850000141
结论；B.1.1.7检测试剂37℃加速21天后，扩增检测阴性样本，未检出，扩增检测高中低值阳性样本，正常检出，证明扩增性能符合标准，因此本试剂在2～8℃的储存有效期大于6个月。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州安图生物工程股份有限公司
<120> 检测标志物、引物、探针或其组合，以及检测试剂、检测试剂盒
<130> MP21025381
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttgttctta cctttctttt ccaatgt 27
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcagtggaag caaaataaac acca 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23

Claims (8)

1.引物探针组合，其特征在于，包括：
(I)、引物，具有如SEQ ID No.1～6任意所示的核苷酸序列；和
(II)、荧光探针，具有如SEQ ID No.7～9所示的核苷酸序列；或
(III)、如(I)或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(IV)、与(I)、(II)或(III)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，包括如下组合中的一种或两者以上：
组合一：检测新冠变异株B.1.1.7 69-70del位点的引物探针组合
(1)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
(2)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和
(3)、荧光探针具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；或
(4)、如(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(5)、与(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
组合二：检测新冠变异株B.1.1.7N501Y位点的引物探针组合
(6)、上游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和
(7)、下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和
(8)、荧光探针具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；或
(9)、如(6)、(7)或(8)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(6)、(7)或(8)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(10)、与(6)、(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
组合三：检测内参的引物探针组合，所述内参为核糖核酸酶基因
(11)、上游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和
(12)、下游引物具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；和
(13)、荧光探针具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；或
(14)、如(11)、(12)或(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(11)、(12)或(13)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(15)、与(11)、(12)或(13)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。
3.如权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个或6个。
4.如权利要求1至3任一项所述的引物探针组合，其特征在于，
具有如SEQ ID No.7所示核苷酸序列的探针的5’端修饰ROX基团，3’端修饰BHQ2基团；和/或
具有如SEQ ID No.8所示核苷酸序列的探针的5’端修饰FAM基团，3’端修饰MGB基团；和/或
具有如SEQ ID No.9所示核苷酸序列的探针的5’端修饰CY5基团，3’端修饰BHQ2基团。
5.如权利要求1至4任一项所述的引物探针组合在制备新冠病毒检测的试剂或试剂盒中的应用；所述新冠病毒包括新冠变异株B.1.1.7。
6.新冠变异株B.1.1.7的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至4任一项所述的引物探针组合以及常用的助剂。
7.如权利要求6所述的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液1和PCR反应液2；
所述PCR反应液1包含水、PCR反应缓冲液、KOAc、Glycerol、DMSO、NaN3、dNTP、反转录酶、DNA聚合酶、具有如SEQ ID No.7～9任意所示核苷酸序列的探针；
所述PCR反应液2包含水、MgCl2、叠氮化钠、具有如SEQ ID No.1～6任意所示核苷酸序列的引物。
8.如权利要求6或7所述的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂或检测试剂盒的扩增程序包括：50℃2min，60℃30min，95℃2min，(95℃10s，60℃22s)×45循环，40℃10s。
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