CN113278733B - 一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合，含有核苷酸序列如SEQ ID NO：3到6所示的引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO：10到11所示的探针。基于本引物和探针的组合，本发明建立了一种基于纳米粒子PCR技术检测新冠病毒S基因N501Y突变点和S基因D614G突变点的检测方法，具有扩增效率更高和特异性佳的特点，该方法的灵敏度高达5copies/反应，且对8种冠状病毒和N501Y和D614未突变株的SARS‑CoV‑2均表现出优良的特异性。说明该体系可以快速有效的进行新型冠状病毒突变株和未突变株的筛查。

Description

一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体地，涉及一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合。
背景技术
冠状病毒是一个大型病毒家族，是目前人类已知的RNA病毒中基因组最大的病毒。2020年2月11日，国际病毒分类委员会(ICTV)将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2。该病毒属于β冠状病毒，与冠状病毒SARS具有很强的同源性，但传播能力强于SARS。SARS-CoV-2可以引起新型冠状病毒肺炎，该病毒潜伏期长，传染性强，可导致严重急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克，多功能衰竭甚至死亡。
2020年12月14日，英国向世界卫生组织报告了一种新的B.1.1.7谱系新冠病毒变异病株，英国称为“VUI 202012/01”(Variant Under Investigation，year 2020，month12，variant01)，即2020年12月调查的第一号变异毒株。《科学》杂志刊文称，这种新变种比原始毒株的传播性高出40～70％。回顾性研究表明，2020年9月20日在英格兰东南部的肯特郡就已经出现了首例由该变异病毒感染的病例。直至2020年12月中旬，伦敦超过60％的新冠感染病例都来自变异病毒。至此，该变异病毒已传播至英国各地，主要集中在伦敦、东南部和英格兰东部。除英国外，澳大利亚、丹麦、意大利、冰岛与荷兰、中国等国也接连发现了该变异病毒。与此同时，南非在2020年12月中下旬也发现另一种高传染率的SARS-CoV-2变种病毒(被命名为501Y.V2)。南非卫生部长表示，这种被命名为501Y.V2的病毒变种可能是引发南非第二波新冠迅猛疫情的原因。数据显示，南非高达90％的新增病例都是来自该变异病毒株。目前除南非外，已经有包括中国在内的多个国家出现了501Y.V2的感染者。
SARS-CoV-2病毒通常以每个月1～2个突变的速度积累突变。这意味着，直至2020年12月所测的病毒与最开始测定的病毒基因组相差约20个位点，然而，B.1.1.7谱系变异病毒几乎同时出现23个位点的大量突变，进化之快前所未有。根据美国疾控中心(CDC)报道，B.1.1.7谱系病毒株发生23个特殊突变，包括14个非同义突变、6个同义突变和3个删除，其中，刺突蛋白(Spike蛋白)上同时出现的突变主要包含N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、HV69-70del、Y144del。而南非的501Y.V2突变株与英国的B.1.1.7谱系突变株具有相同的N501Y和D614G突变外，还包含了Spike蛋白E484K和K417N两个关键位点的突变。Spike蛋白与人类受体血管紧张素转换酶2(ACE2)的结合片段为residues:336-516。其中，突变N501Y是受体结合域(RBD)中的六个关键接触残基之一，刺突蛋白RBD区域的N501突变可以降低RBD关键残基的极性，从而提高新冠病毒与人体细胞表面ACE2受体的亲和力。
中国专利202010312576.7一种基于RT-LAMP技术检测新冠病毒用引物组及检测试剂盒、202010358418.5一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的探针和引物、试剂盒、检测方法及应用、CN202011428690.2一种用于检测新冠病毒的基因保守序列、引物探针组合、试剂盒及应用等都公开了在核酸水平上的信管病毒的检测方法，但是都无法将特定突变毒株与普通新冠病毒进行区分。
目前，这类高传染率的新型冠状病毒突变毒株只能是通过基因组测序的方法与普通新冠病毒进行区分，过长的测序周期以及上万美元的仪器成本，阻碍了该病毒的检测效率。因此，一种能够有效鉴别高传染率新型冠状病毒与普通型新型冠状病毒的产品是目前亟需的。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合。
本发明的第一个目的是提供一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合。
本发明的第二个目的是提供任一所述的引物和探针的组合早制备检测新冠病毒突变菌株的检测试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种检测新冠病毒突变菌株的检测试剂盒。
本发明的第四个目的是提供一种新型冠状病毒2019-nCoV的非诊断目的的检测方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明提供的一组基于纳米粒子PCR技术检测超高传染率新型突变株的引物组，包括检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的ORF1ab基因的保守序列，S基因N501Y突变点、S基因D614G突变点，以及人基因RP-30。本发明以ORF1ab保守序列及人类基因RP-30作为双内参，RP-30基因作为采样监控，而ORF1ab保守序列作为冠状病毒的监控，双内参保证结果更准确。并通过对ORF1ab保守序列、S基因N501Y突变点、S基因D614G突变点的引物探针的优化，得到扩增效率更高和特异性佳的引物对。
因此本发明要求保护一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合，含有核苷酸序列如SEQ ID NO：3到6所示的引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO：10到11所示的探针。
优选地，SEQ ID NO：11所示的探针的5’端第三个碱基有LNA修饰。
更优选地，还含有核苷酸序列如SEQ ID NO：1到2所示的引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的探针。
更优选地，还含有核苷酸序列如SEQ ID NO：7到8所示的引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的探针。
进一步优选地，各探针的3’端有猝灭荧光基团。
进一步更优选地，所述猝灭荧光基团为BHQ2。
进一步优选地，各探针的5’端有不同的激发荧光基团
进一步更优选地，所述激发荧光基团为VIC、ROX、FAM、和Cy5的一种或几种。
再进一步优选地，在各引物和/或探针的5’端分别修饰有巯基，通过巯基自组装有硫化铋纳米颗粒。
优选地，5’端带有SH(巯基)修饰引物和/或探针，分别与硫化铋纳米颗粒溶液、柠檬酸缓冲液混合均匀，孵育，实现巯基化寡核苷酸在硫化铋纳米颗粒表面的自组装。
任一所述的引物和探针的组合早制备检测新冠病毒突变菌株的检测试剂盒中的应用。
本发明要求保护一种检测新冠病毒突变菌株的检测试剂盒，含有任一所述的引物和探针的组合。
优选地，所述检测试剂盒基于纳米粒子PCR技术，含有所述的引物和探针的组合。
本发明还要求保护一种新型冠状病毒2019-nCoV的非诊断目的的检测方法，使用任一所述的引物和探针的组合。
优选地，利用纳米粒子PCR技术。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明建立了一种基于纳米粒子PCR技术检测新冠病毒S基因S基因N501Y突变点和S基因D614G突变点的检测方法，具有扩增效率更高和特异性佳的特点，该方法的灵敏度高达5copies/反应，且对8种冠状病毒和N501Y和D614未突变株的SARS-CoV-2均表现出优良的特异性。说明该体系可以快速有效的进行新型冠状病毒突变株和未突变株的筛查。
附图说明
图1为Y501突变株的突变上游引物NF-F1检测结果。
图2为Y501突变株的突变上游引物NF-F2检测结果。
图3为G614突变株的突变上游引物DG-F1检测结果。
图4为G614突变株的突变上游引物DG-F2检测结果。
图5为含SARS-CoV-2ORF1ab保守序列重组质粒的灵敏度检测结果。
图6为含SARS-CoV-2S基因Y501突变重组质粒的灵敏度检测结果。
图7为含SARS-CoV-2S基因G614突变重组质粒的灵敏度检测结果。
图8为8种冠状病毒的特异性检测结果。
图9为含SARS-CoV-2S基因N501未突变的重组质粒检测的特异性结果。
图10为含SARS-CoV-2S基因D614未突变的重组质粒检测的特异性结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1引物设计
针对SARS-CoV-2的S基因N501Y突变点和S基因D614G突变点设计引物，并且以ORF1ab保守序列及人类基因RP-30作为双内参，RP-30基因作为采样监控，而ORF1ab保守序列作为冠状病毒的监控，双内参保证结果更准确。通过对ORF1ab保守序列、S基因N501Y突变点、S基因D614G突变点的引物探针的优化，得到扩增效率更高和特异性佳的引物对。
其中，RP-30基因上游引物序列RP-F：AGATTTGGACCTGCGAGCG(SEQ ID NO：7)，
RP-30基因下游引物序列RP-R：AACAACTGAATAGCCAAGGTG(SEQ ID NO：8)；
RP-30基因探针序列RP-R：Cy5-CTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2(SEQ ID NO：12)。
一、ORF1ab保守引物探针设计
1、实验方法
使用NCBI进行基因组序列下载。分别下载不同谱系的SARS-CoV-2基因组序列，以及其他相关冠状病毒SARS-2003、SARS coronavirus ZS-C、bat-SL-CoVZC45、bat-SL-CoVZXC21、SARS coronavirus ZS-B、SARS coronavirus Sin3765、SARS coronavirusSin3408L、MERS coronavirus。使用BioEdit软件进行序列比对，寻找针对不同谱系新型冠状病毒保守，且针对其他冠状病毒特异的序列，并在该段序列上进行ORF1ab的引物探针设计。
针对上述筛选的序列，使用Primer Primier5和oligo7进行引物探针设计，包括ORF1ab基因上游引物F序列ORF-F、ORF1ab基因下游引物序R列ORF-R和ORF1ab基因探针P。
设计ORF1ab的序列如下：
ORF1ab基因上游引物F序列ORF-F：CGGAAGCCAATATGGATCAAG(SEQ ID NO：1)、
ORF1ab基因下游引物序R列ORF-R：TTGGATGATCTATGTGGCAACG(SEQ ID NO：2)、
ORF1ab基因探针P1序列：FAM-CTTTGGTGGTGCATCGTGTTGTCTG-BHQ1(SEQ ID NO：9)。
结合5×PCR缓冲液、酶混合液配置成20μl的反应体系，并检测SARS-CoV-2含ORF1ab保守序列的重组质粒。
其中，PCR缓冲液包括100mmol/L Tris-HCl、15mmol/L MgCl2、250mmol/L KCl、2.5μg/μl BSA、0.5mmol/L dNTP/dUTP混合物、0.25mmol/L NTPs和纯化水；酶混合液包括8U/μL逆转录酶、0.4U/μL RNase抑制剂、0.12U/μL DNA聚合酶、0.02U/μL热敏感UDG和纯化水。引物和探针的用量均为0.2μM。
上机程序为50℃5min，1个循环；95℃2min，1个循环；(95℃5s、60℃30s)，45个循环，使用ABI 7500仪器进行筛选。
2、实验结果
核苷酸序列如SEQ ID ON:1～2所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID ON:9所示的探针能够得到标准的“S”型扩增曲线，说明建立的qPCR扩增方法适用新冠病毒的检测。
二、S基因突变株引物探针优化
1、实验方法
通过进行SARS-CoV-2序列查找与比对，参考(序列号为NC_045512.2)序列位点，确定N501Y突变点的位置为C.23063A>T，D614G突变点的位置为c.23403A>G。根据突变点确认检测突变株的片段。
Y501突变序列(突变点为下划线处)：
TCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTTATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTT
G614突变序列(突变点为下划线处)：
ACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGGTGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGT
根据突变点信息，利用等位基因特异性检测原理，使用Primer Primier5和oligo7进行鉴别引物探针设计。分别包括NY-F、NY-R和NY-P，以及NG-F、NG-R和NG-P。同时，因为NG-P探针的Tm值较低，对单个碱基进行LNA修饰，进行LNA补偿。
设计Y501序列如下：
S基因Y501突变位点上游引物序列
NY-F1：GGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTcA(SEQ ID NO：3)
或NY-F2：GGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGA(SEQ ID NO：13)；
S基因Y501突变位点下游引物序列
NY-R：GTATGGTTGGTAACCAACACCATA(SEQ ID NO：4)；
S基因Y501突变位点探针序列
NY-P：ROX-CAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCAC-BHQ2(SEQ ID NO：10)；
G614序列如下：
S基因G614突变位点上游引物序列
NG-F1：CAGGTTGCTGTTCTTTATCAGcG(SEQ ID NO：5)
或NG-F2：CAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGG(SEQ ID NO：14)；
S基因G614突变位点下游引物序列
NG-R：GCACGTGTTTGAAAAACATTAGAAC(SEQ ID NO：6)
S基因G614突变位点探针序列
NG-P：VIC-AA(+C)TGCACAGAAGTCCCTGTTGCTA-BHQ2(SEQ ID NO：11)。
其中，下划线处为突变点，+为LNA修饰碱基，小写字母为碱基错配设计。
结合5×PCR缓冲液、酶混合液配置成20μl的反应体系，并分别检测SARS-CoV-2含Y501突变的重组质粒、含G614突变的重组质粒和未突变新型冠状病毒的假病毒(来源于邦德胜公司“2019新型冠状病毒核糖核酸液体室内质控品”产品)。
其中，PCR缓冲液包括100mmol/L Tris-HCl、15mmol/L MgCl2、250mmol/L KCl、2.5μg/μl BSA、0.5mmol/L dNTP/dUTP、0.25mmol/L NTPs和纯化水；酶混合液包括1.0μL的200U/μL逆转录酶、0.2μL的50U/μL RNase抑制剂、1.5μL的2U/μL DNA聚合酶、0.5μL的1U/μL热敏感UDG。
上机程序为50℃5min，1个循环；95℃2min，1个循环；(95℃5s、60℃30s)，45个循环，使用ABI 7500仪器进行筛选。
其中，检测SARS-CoV-2含Y501突变的重组质粒使用：
核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的探针，
或，核苷酸序列如SEQ ID NO：3和13所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的探针。
检测SARS-CoV-2含G614突变的重组质粒使用
核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的探针，
或，核苷酸序列如SEQ ID NO：5和14所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的探针。
2、实验结果
检测结果如图1到图4所示，扩增效率比较：NY-F1(SEQ ID NO：3)与NY-F2(SEQ IDNO：13)相当，NG-F1(SEQ ID NO：5)与NG-F2(SEQ ID NO：14)相当；特异性比较：NY-F1(SEQID NO：3)优于NY-F2(SEQ ID NO：13)，NG-F1(SEQ ID NO：5)优于NG-F2(SEQ ID NO：14)。因此选择核苷酸序列如SEQ ID ON:1～12所示的引物和探针核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的探针，以及核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的探针进行纳米粒子PCR体系构建。
实施例2纳米粒子PCR体系建立
一、实验方法
合成实施例1中得到的SEQ ID NO：1到12的引物和探针，然后将合成的带有5’端SH(巯基)修饰oligo片段(引物或探针)与硫化铋纳米颗粒溶液、柠檬酸缓冲液混合均匀，孵育，由于铋(Bi)离子与硫(S)具有较强的亲和性，可以形成共价键，基于Bi-S共价键实现巯基化寡核苷酸在硫化铋纳米颗粒表面的自组装。
将修饰引物结合5×PCR缓冲液、酶混合液配置成20μL的反应体系，分别检测SARS-CoV-2含ORF1ab保守序列的重组质粒、含Y501突变的重组质粒和含G614突变的重组质粒。反应程序为50℃5min，1个循环；95℃3s，1个循环；95℃2s、60℃6s，45个循环，使用激光PCR仪器进行反应。
其中，PCR缓冲液包括100mmol/L Tris-HCl、15mmol/L MgCl2、250mmol/L KCl、2.5μg/μL BSA、0.5mmol/L dNTP/dUTP混合物、0.25mmol/L NTPs和纯化水；
酶混合液包括1.0μL的200U/μL逆转录酶、0.2μL的50U/μL RNase抑制剂、1.5μL的2U/μL DNA聚合酶、0.5μL的1U/μL热敏感UDG。
探针引物混合液包括0.5μL的10μM引物ORF1ab-F、0.5μL的10μM引物ORF1ab-R、0.5μL的10μM探针ORF1ab-P、0.5μL的10μM引物NY-F、0.5μL的10μM引物NY-R、0.5μL的10μM探针NY-P、0.5μL的10μM引物NG-F、0.5μL的10μM引物NG-R、0.5μL的10μM探针GN-P及0.4μL的10μM引物RP-F、0.4μL的10μM引物RP-R、0.4μL的10μM探针RP-P及0.3μL的无核酸酶水。
注：dNTP/dUTP增加体系的抗污染风险，与UDG酶搭配使用。
二、实验结果
检测结果表明(如图1到3)，上述三组引物组能够得到标准的“S”型扩增曲线，说明建立的qPCR扩增方法适用新冠病毒的检测。
实施例3一种基于纳米粒子PCR技术检测新冠病毒突变菌株的检测试剂盒
一、组成
5×PCR缓冲液包括：100mmol/L Tris-HCl、15mmol/L MgCl2、250mmol/L KCl、2.5μg/μLBSA、0.5mmol/L dNTP/dUTP、0.25mmol/L NTPs和纯化水；
酶混合液包括：1.0μL的200U/μL逆转录酶、0.2μL的50U/μL RNase抑制剂、1.5μL的2U/μL DNA聚合酶、0.5μL的1U/μL热敏感UDG；
实施例2制备得到的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～12所示的引物和探针，具体的：
引物序列：(下划线处为突变点，+为LNA修饰碱基)
ORF1ab基因上游引物F序列ORF-F：CGGAAGCCAATATGGATCAAG(SEQ ID NO：1)，
ORF1ab基因下游引物序R列ORF-R:TTGGATGATCTATGTGGCAACG(SEQ ID NO：2)，
S基因Y501突变位点上游引物序列NY-F：GGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGA(SEQ IDNO：3)，
S基因Y501突变位点下游引物序列NY-R：GTATGGTTGGTAACCAACACCATA(SEQ ID NO：4)，
S基因G614突变位点上游引物序列NG-F：CAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGG(SEQ ID NO：5)，
S基因G614突变位点下游引物序列NG-R：GCACGTGTTTGAAAAACATTAGAAC(SEQ IDNO：6)，
RP-30基因上游引物序列RP-F：AGATTTGGACCTGCGAGCG(SEQ ID NO：7)，
RP-30基因下游引物序列RP-R：AACAACTGAATAGCCAAGGTG(SEQ ID NO：8)，
ORF1ab基因探针P1序列：
FAM-CTTTGGTGGTGCATCGTGTTGTCTG-BHQ1(SEQ ID NO：9)，
S基因Y501突变位点探针序列NY-P：
ROX-CAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCAC-BHQ2(SEQ ID NO：10)，
S基因G614突变位点探针序列NG-P：
VIC-AA(+C)TGCACAGAAGTCCCTGTTGCTA-BHQ2(SEQ ID NO：11)，+为LNA修饰碱基，
RP-30基因探针序列RP-R：
Cy5-CTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2(SEQ ID NO：12)。
二、使用方法
1、按照如下体系配制反应混合液：
5μL的5×PCR缓冲液、3.2μL酶混合液(包括1.0μL的200U/μL逆转录酶、0.2μL的50U/μL RNase抑制剂、1.5μL的2U/μL DNA聚合酶、0.5μL的1U/μL热敏感UDG)、6μL探针引物混合液(包括0.5μL的10μM引物ORF1ab-F、0.5μL的10μM引物ORF1ab-R、0.5μL的10μM探针ORF1ab-P、0.5μL的10μM引物NY-F、0.5μL的10μM引物NY-R、0.5μL的10μM探针NY-P、0.5μL的10μM引物NG-F、0.5μL的10μM引物NG-R、0.5μL的10μM探针GN-P及0.4μL的10μM引物RP-F、0.4μL的10μM引物RP-R、0.4μL的10μM探针RP-P及0.3μL的无核酸酶水)、纯化水至20μL。
2、样本制备：
取一份待检测的咽拭子RNA提取物作为RNA样本
3、qPCR反应：
制备的反应混合液20μL和待测RNA样本5μL充分混匀，使用激光控制加热仪器进行上机检测：
4、结果判读
本试剂盒检测目标基因的Ct参考值为40，即Ct小于或等于40为阳性(+)，Ct大于40为阴性(-)，结果判读如表1所示
表1：
“+”代表阳性，“-”代表阴性，“±”表示阴阳性均可，
FAM通道的Ct值应≥24，若FAM信号的Ct值＜24，说明新型冠状病毒的载量较大，应该进行稀释后复测，避免假阳性。
当检测信号检出FAM、ROX和Cy5通道均为阳性的突变株，其为是B.1.1.7谱系或者B.1.351谱系，提示该病毒株具有超高传染性
实施例4试剂盒的灵敏度
含ORF1ab保守序列的重组质粒用ddH2O做梯度稀释，拷贝数依次为106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ml。
含Y501突变序列的重组质粒用ddH2O做梯度稀释，拷贝数依次为106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ml。
含G614突变序列的重组质粒用ddH2O做梯度稀释，拷贝数依次为106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ml。
用实施例3的试剂盒分别检测以上样本。
二、实验结果
测试结果显示如图5到7所示，体系的最低检测限为103copies/ml，即5copies/rxn。
实施例5试剂盒的特异性
以分别含冠状病毒SARS-2003、SARS coronavirus ZS-C、bat-SL-CoVZC45、bat-SL-CoVZXC21、SARS coronavirus ZS-B、SARS coronavirus Sin3765、SARS coronavirusSin3408L、MERS coronavirus片段的重组质粒为模板，同时也将N501Y和D614未突变株的SARS-CoV-2的重组质粒作为特异性模板。并用纯化水作为阴性对照。
用实施例3的试剂盒分别检测以上样本。
二、实验结果
测试结果显示如图8到10所示，PCR体系对上述冠状病毒及非突变型SARS-CoV-2的检测结果均为阴性，说明体系的特异性佳。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院
<120> 一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggaagccaa tatggatcaa g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttggatgatc tatgtggcaa cg 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaagtctaa tctcaaacct tttga 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtatggttgg taaccaacac cata 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caggttgctg ttctttatca ggg 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcacgtgttt gaaaaacatt agaac 25
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacaactgaa tagccaaggt g 21
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctttggtggt gcatcgtgtt gtctg 25
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caactgaaat ctatcaggcc ggtagcac 28
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aactgcacag aagtccctgt tgcta 25
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgacctgaa ggctctgcgc g 21

Claims (5)

1.引物和探针的组合在制备检测新冠病毒突变毒株的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物和探针的组合含有核苷酸序列如SEQ ID NO：1到8所示的引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO：9到12所示的探针；
其中，核苷酸序列如SEQ ID NO：1到2所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的探针用于检测ORF1ab基因；核苷酸序列如SEQ ID NO：3到4所示的引物和核苷酸序列如SEQID NO：10所示的探针用于检测S基因Y501突变位点；核苷酸序列如SEQ ID NO：5到6所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的探针用于检测S基因G614突变位点；核苷酸如序列如SEQ ID NO：7到8所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的探针用于检测RP-30基因；SEQ ID NO：11所示的探针的5’端第三个碱基有LNA修饰；
RP-30基因和ORF1ab基因作为内参；
在各引物和/或探针的5’端分别修饰有巯基，通过巯基自组装有硫化铋纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，各探针的3’端有猝灭荧光基团，各探针的5’端有不同的激发荧光基团。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述猝灭荧光基团为BHQ2。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述激发荧光基团为VIC、ROX、FAM和Cy5。
5.一种检测新冠病毒突变毒株的检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1到4任一所述的引物和探针的组合。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113981140B (zh) * 2021-10-09 2024-02-27 广州达安基因股份有限公司 新型冠状病毒德尔塔突变株的检测方法及核酸检测试剂盒
CN113897460B (zh) * 2021-11-02 2022-08-16 深圳市梓健生物科技有限公司 一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的核酸组合物、试剂盒及方法
CN114150088B (zh) * 2021-11-30 2024-06-25 广东医科大学 一种新冠病毒基因单碱基突变检测方法及其应用
CN113881812B (zh) * 2021-12-03 2022-02-15 深圳联合医学科技有限公司 检测SARS-CoV-2突变株的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN113957176A (zh) * 2021-12-13 2022-01-21 上海捷诺生物科技有限公司 鉴别新冠病毒变异株和野生株的检测试剂、反应体系及试剂盒和用途
CN114107572B (zh) * 2022-01-26 2022-04-12 潮州凯普生物化学有限公司 一种基于多重pcr技术检测不同新冠病毒突变株的引物探针组、检测试剂盒及其应用
CN114438180B (zh) * 2022-03-08 2024-05-28 中南大学 一种非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104093860A (zh) * 2012-02-01 2014-10-08 Gna生物解决办法有限公司 用于扩增核酸的方法
CN111088408A (zh) * 2020-03-20 2020-05-01 广州凯普医药科技有限公司 一种新冠病毒、甲乙流感及呼吸道合胞病毒检测试剂盒
CN111197112A (zh) * 2020-04-02 2020-05-26 广州安必平医药科技股份有限公司 一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒
CN112458210A (zh) * 2020-12-09 2021-03-09 上海伯杰医疗科技有限公司 一种用于检测新冠病毒的基因保守序列、引物探针组合、试剂盒及应用
CN112575120A (zh) * 2020-11-03 2021-03-30 厦门大学 一种SARS-CoV-2 D614G突变检测试剂盒及检测方法
CN112695134A (zh) * 2020-12-02 2021-04-23 湖州市中心医院 一种新型冠状病毒covid-19核酸检测引物组、探针组及检测试剂盒和检测方法
CN112725537A (zh) * 2020-03-12 2021-04-30 宁波海尔施基因科技有限公司 一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量pcr试剂盒、方法及引物探针组合物
CN112760414A (zh) * 2020-09-28 2021-05-07 武汉臻熙医学检验实验室有限公司 引物组及其用途
CN112813203A (zh) * 2021-03-02 2021-05-18 常州国药医学检验实验室有限公司 基于荧光定量pcr技术的新冠病毒核酸及突变基因检测试剂盒及其应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104093860A (zh) * 2012-02-01 2014-10-08 Gna生物解决办法有限公司 用于扩增核酸的方法
CN112725537A (zh) * 2020-03-12 2021-04-30 宁波海尔施基因科技有限公司 一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量pcr试剂盒、方法及引物探针组合物
CN111088408A (zh) * 2020-03-20 2020-05-01 广州凯普医药科技有限公司 一种新冠病毒、甲乙流感及呼吸道合胞病毒检测试剂盒
CN112342315A (zh) * 2020-03-20 2021-02-09 广州凯普医药科技有限公司 一种新冠病毒、甲乙流感及呼吸道合胞病毒检测试剂盒
CN111197112A (zh) * 2020-04-02 2020-05-26 广州安必平医药科技股份有限公司 一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒
CN112760414A (zh) * 2020-09-28 2021-05-07 武汉臻熙医学检验实验室有限公司 引物组及其用途
CN112575120A (zh) * 2020-11-03 2021-03-30 厦门大学 一种SARS-CoV-2 D614G突变检测试剂盒及检测方法
CN112695134A (zh) * 2020-12-02 2021-04-23 湖州市中心医院 一种新型冠状病毒covid-19核酸检测引物组、探针组及检测试剂盒和检测方法
CN112458210A (zh) * 2020-12-09 2021-03-09 上海伯杰医疗科技有限公司 一种用于检测新冠病毒的基因保守序列、引物探针组合、试剂盒及应用
CN112813203A (zh) * 2021-03-02 2021-05-18 常州国药医学检验实验室有限公司 基于荧光定量pcr技术的新冠病毒核酸及突变基因检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Multiplex qPCR discriminates variants of concern to enhance global surveillance of SARS-CoV-2;Chantal B F Vogels et al.;《PLoS Biol》;第19卷(第5期);第1-12页 *
Structure-Function Analyses of New SARS-CoV-2 Variants B.1.1.7, B.1.351 and B.1.1.28.1: Clinical, Diagnostic, Therapeutic and Public Health Implications;Jasdeep Singh et al.;《Viruses》;第13卷(第3期);第1-16页 *
基于硫化铋的纳米探针在癌症诊疗中的应用;李泽伦;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》(第1期);E072-4 *
新型冠状病毒突变体D614G研究进展;路琼 等;《微生物学免疫学进展》;第49卷(第2期);第73-77页 *

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