CN114438180B - 一种非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法。所述非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法包括：核酸扩增检测策略、光声传感定量策略及设备搭建；所述核酸扩增检测策略包括挂锁探针，二级引物和检测探针的DNA序列，并将所述检测探针DNA修饰至纳米金粒子表面，形成特异性纳米金探针，且通过核酸连接酶连接挂锁探针，触发分支滚环扩增，所述分支滚环扩增的产物将引起纳米金探针的聚集，从而产生光声信号。本发明提供的非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法具有高灵敏、可重复、廉价，检测过程中的信号抗干扰能力强的优点。
Description
技术领域
本发明属于单核苷酸突变检测技术领域，尤其涉及一种非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法。
背景技术
对单核苷酸突变进行分析需要极高的检测特异性。目前主流的核酸检测方法，主要是实时定量PCR与基因测序技术。其中，前者由于检测特异性的问题，无法针对一些单核苷酸突变进行响应，从而出现假阴性的情况。另一方面，尽管当前基因测序技术已经可以做到分析完整基因序列与各种突变位点，但仍然存在着样品需求量较大（由于较低的检测灵敏度，要求检测样品为较高浓度）、操作用时较长、设备昂贵等不足。
因此，有必要提供一种新的非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法解决上述技术问题
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种高灵敏、可重复、廉价，检测过程中的信号抗干扰能力强的非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法包括：核酸扩增检测策略、光声传感定量策略及设备搭建；
所述核酸扩增检测策略包括挂锁探针，二级引物和检测探针的DNA序列，并将所述检测探针DNA修饰至纳米金粒子表面，形成特异性纳米金探针，且通过核酸连接酶连接挂锁探针，触发分支滚环扩增，所述分支滚环扩增的产物将引起纳米金探针的聚集，从而产生光声信号，其中检测SARS-COV-2 N501Y突变株A23063T单核苷酸多态性所用挂锁探针序列为Phosphate（磷酸化）-AGT GGG TTG GAA ACC ATA TGA TAG AGC TAA TAT GAG ATA AAG CAGTGA CAT ACG ACA CGG TTG GTA ACC AAC ACC ATA，二级引物序列为AAG CAG TGA CAT ACGACA C，检测探针序列为CTC ATA TTA GCT CTA TCA TAT GGT TTC CAA CCC TTT TTT TTTTTT TTT TTT T-C3-Thiol（巯基），突变型靶标序列为TGG TTT CCA ACC CAC TTA TGG TGTTGG TTA CCA，野生型靶标序列为TGG TTT CCA ACC CAC TAA TGG TGT TGG TTA CCA，扩增反应所用DNA聚合酶为Bst3.0聚合酶；
所述光声传感定量是一种基于光声效应的无损检测技术，所述光声效应是指在短脉冲激光照射下，生物组织吸收了光能之后，温度的升高引起瞬态热膨胀，从而导致局部压力的上升，并产生光声信号；
所述光声传感定量策略包括以下步骤：
（1）.将检测样品放置于设备搭建中，对阳性样品中聚集后的纳米金粒子所产生的光声信号进行收集、滤波、放大处理，并借助计算机进行相关计算，即可得到该检测样品的具体光声信号值，光声信号值的大小与样品中检测靶标的浓度在一定区间内单调相关，最终可实现对靶标的快速定量检测。
作为本发明的进一步方案，所述挂锁探针是一段短单链线性DNA，且当靶标序列存在时，在所述DNA连接酶的作用下，原本是线性的挂锁探针会自身首尾相接形成环状，作为后续滚环扩增反应的环状模板，滚环扩增产物在二级引物作用下进行分支滚环扩增。
作为本发明的进一步方案，所述设备搭建包括有壳体、两个光学窗口、第一底座、微量比色皿、第二底座、水浸超声探头、第三底座、声反射镜和脉冲激光器，两个光学窗口分别开设在壳体的两侧外壁上，所述第一底座固定安装在壳体的底部内壁上，所述微量比色皿设置在第一底座的顶部上，所述第二底座固定安装在壳体的底部内壁上，所述水浸超声探头设置在第二底座的顶部上，所述第三底座固定安装在壳体的底部内壁上，所述声反射镜设置在第三底座的顶部上，所述脉冲激光器设置在壳体的一侧，所述脉冲激光器与微量比色皿、声反射镜和两个光学窗口相适配。
作为本发明的进一步方案，所述分支滚环扩增为基于核酸连接酶连接挂锁探针并触发分支滚环扩增来实现核酸检测。
与相关技术相比较，本发明提供的非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法具有如下有益效果：
本发明提供一种非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法：
1、操作简单，具有高灵敏、可重复、廉价，检测过程中的信号抗干扰能力强等优点，其中，快速核酸扩增检测策略及配套使用的设备搭建，可适用于各种具体的突变位置和突变序列已知的检测。
附图说明
为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明单核苷酸突变基因的核酸扩增检测策略示意图；
图2为本发明中设备搭建的正视结构示意图；
图3为本发明中设备搭建的俯视结构示意图；
图4为本发明中光声传感定量腔设计及部件图；
图5为本发明中（a）琼脂糖凝胶电泳实验结果和（b）光声信号随反应时间、浓度的变化示意图；
图6为本发明中挂锁探针，二级引物和检测探针的DNA序列示意图。
图中：1、壳体；2、光学窗口；3、第一底座；4、微量比色皿；5、第二底座；6、水浸超声探头；7、第三底座；8、声反射镜；9、脉冲激光器。
具体实施方式
请结合参阅图1、图2、图3、图4、图5和图6，其中，图1为本发明单核苷酸突变基因的核酸扩增检测策略示意图；图2为本发明中设备搭建的正视结构示意图；图3为本发明中设备搭建的俯视结构示意图；图4为本发明中光声传感定量腔设计及部件图；图5为本发明中（a）琼脂糖凝胶电泳实验结果和（b）光声信号随反应时间、浓度的变化示意图；图6为本发明中挂锁探针，二级引物和检测探针的DNA序列示意图。非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法包括：核酸扩增检测策略、光声传感定量策略及设备搭建；
所述核酸扩增检测策略包括挂锁探针，二级引物和检测探针的DNA序列，并将所述检测探针DNA修饰至纳米金粒子表面，形成特异性纳米金探针，且通过核酸连接酶连接挂锁探针，触发分支滚环扩增，所述分支滚环扩增的产物将引起纳米金探针的聚集，从而产生光声信号，其中检测SARS-COV-2 N501Y突变株A23063T单核苷酸多态性所用挂锁探针序列为Phosphate（磷酸化）-AGT GGG TTG GAA ACC ATA TGA TAG AGC TAA TAT GAG ATA AAG CAGTGA CAT ACG ACA CGG TTG GTA ACC AAC ACC ATA，二级引物序列为AAG CAG TGA CAT ACGACA C，检测探针序列为CTC ATA TTA GCT CTA TCA TAT GGT TTC CAA CCC TTT TTT TTTTTT TTT TTT T-C3-Thiol（巯基），突变型靶标序列为TGG TTT CCA ACC CAC TTA TGG TGTTGG TTA CCA，野生型靶标序列为TGG TTT CCA ACC CAC TAA TGG TGT TGG TTA CCA，扩增反应所用DNA聚合酶为Bst3.0聚合酶；
所述光声传感定量是一种基于光声效应的无损检测技术，所述光声效应是指在短脉冲激光照射下，生物组织吸收了光能之后，温度的升高引起瞬态热膨胀，从而导致局部压力的上升，并产生光声信号；
所述光声传感定量策略包括以下步骤：
（1）.将检测样品放置于设备搭建中，对阳性样品中聚集后的纳米金粒子所产生的光声信号进行收集、滤波、放大处理，并借助计算机进行相关计算，即可得到该检测样品的具体光声信号值，光声信号值的大小与样品中检测靶标的浓度在一定区间内单调相关，最终可实现对靶标的快速定量检测。
接下来的具体技术解决方案中，以检测2019新型冠状病毒（SARS-COV-2）突变株N501Y为例，对本发明进行阐述；
①设计了挂锁探针（PLP），二级引物（P2）和检测探针（DP）的DNA序列，并合成单链DNA，DNA序列见下表，所合成的DNA单链使用Tris-HCl溶解保存，除非另有说明，本研究使用Tris-HCl (50 mM, pH 8.0)作为缓冲溶液；
所述图6中的ATCG为四种不同的碱基，本发明设计了图6中的碱基序列并将其交给生物公司合成了相应的单链DNA，A(ADENINE 腺嘌呤)、T(THYMINE 胸腺嘧啶)、C(CYTOSINE胞嘧啶)、G(GUANINE 鸟嘌呤)、DNA分子中的碱基A 与T、G与C是互补配对存在的；
举例：假设一条单链DNA的碱基序列为AACCTTGG，则该单链能够与另一条碱基序列为TTGGAACC的单链DNA所互补配对，形成一条双链DNA；
图6为本研究中使用的DNA序列，其中单核苷酸多态性A23063T（对应于SARS-COV-2的N501Y突变株）的位置下划线；
②将检测探针DNA修饰至纳米金粒子表面，形成特异性纳米金探针：
采用柠檬酸盐还原法制备了纳米金溶液（AuNPs），并利用设计并合成好的检测探针对其进行了功能化，如图6中的DNA序列所示，该检测探针（DP）的一端修饰有巯基，即SH-DNA；
具体制备步骤：将四氯金酸水溶液（HAuCl4）在搅拌下加热，然后快速加入柠檬酸钠溶液，其分子比为1:1.3，在3分钟后，溶液颜色变成酒红色，然后将溶液冷却至室温，用0.1 M的三(2-羧乙基)膦（TCEP）在室温下还原SH-DNA (10 μM，10 μL)，反应时间为30 min，将还原SH-DNA与 AuNPs (39 nm，0.8 nM，100 μL)混合，将该混合物置于 -20°C 下冷冻2小时，然后在室温下解冻，最后加入巯基聚乙二醇（SH-PEG）(MW 2000, 2 mg/mL)用于封闭AuNPs 表面(4°C下孵育48 h)，通过2次离心纯化后，可得到功能化的特异性纳米金探针（DP-AuNPs）；
③通过核酸连接酶连接挂锁探针，触发分支滚环扩增，分支滚环扩增的产物将引起纳米金探针的聚集，并产生光声信号；
单核苷酸突变基因的扩增检测策略如图1所示，图中分别包括以下物质：野生型基因单链；突变型基因单链；挂锁探针（其两端可分别于靶序列结合形成带有切口的环）；DNA连接酶；DNA聚合酶；线团状单链扩增产物，二级引物P2以及纳米金探针（灰色线段为修饰在纳米金表面的DNA探针）；
扩增反应依次包括以下几个过程（如图1所示）：a.挂锁探针杂交与连接酶反应（37~55°C）；b.在DNA聚合酶作用下，产生滚环扩增并生成线团状产物；c.在二级引物作用下，滚环扩增的产物在环境中DNA聚合酶存在情况下继续发生扩增反应，形成分支滚环扩增；d.加入的纳米金探针与分支滚环扩增的产物发生杂交，纳米金粒子发生聚集；
由于野生型基因使挂锁探针形成的开环结构在末端并不匹配，连接酶无法使开环闭合，故分支滚环扩增无法发生，但野生型基因与挂锁探针的杂交产物带有两个游离的3'末端，可以被DNA聚合酶识别，生成长DNA双链，该双链副产物不参与后续的纳米金聚集反应；
④搭建一套光声传感定量设备中，对样品中由纳米金粒子聚集而产生的的光声信号进行测量，所测得的光声信号值的大小与样品中检测目标物（即靶标）的浓度在一定区间内单调相关，最终可实现对靶标的快速定量检测；
由多波长激光器（SpitLight 600 OPO, InnoLas）发出640 nm脉冲激光，通过光学反射镜与光栏射进设计好的光声传感定量腔中，腔内装有比色皿、声反射镜，与水浸超声探头，通过3D打印模块固定三者相对位置，使得激光正好穿过微量比色皿中样品位置，样品所产生的光声信号由声反射镜传至换能器处；
首先进行一次纳米金样品的信息采集，通过MATLAB对所采集到的信号进行频谱分析，可见样品的信号主要集中在10 MHz以下，此外，由于所设计的光声传感定量腔体积较小，不适合聚焦式探头，因此，最终选择了中心频率为5 MHz的超声水浸平探头，其中换能器接收到的信号经过脉冲/接收超声放大器（DPR500 Pulser-Receivers, Imaginant,Pittsford, NY, USA）进行信号放大与滤波处理，处理后的信号通过内置于计算机中的数据采集卡（NI PCI-5124, 200 MS/s, 12-Bit, National Instruments Corporation,Austin, TX, USA）采集存储，采用取最大值和平均的方法处理数据；
为了证明分子反应策略和探针设计，采用琼脂糖凝胶电泳分析来评估连接过程、传统分支滚环扩增和分支滚环扩增的产物，与靶核酸（泳道1）和挂锁探针（泳道2）相比，泳道3的差异表明靶标与挂锁探针成功杂交并形成了环状结构模板，在DNA聚合酶（本发明中选用Bst 3.0聚合酶）的作用下，分别发生传统分支滚环扩增（泳道4）与分支滚环扩增（泳道5），对于传统分支滚环扩增，在不添加二级引物的情况下对浓度为100 pM的靶DNA进行扩增，形成与长单链DNA产物相对应的条带；
对于浓度为10 pM的靶DNA的分支滚环扩增，其二级引物与已生成的长单链分支滚环扩增产物杂交并进一步触发级联扩增，产生不同长度的短单链DNA产物，泳道4与泳道5中的产物条带表明，与传统分支滚环扩增相比，分支滚环扩增的扩增效率更高；
特别的，本发明中选用Bst 3.0聚合酶：若使用phi29聚合酶，其核酸外切酶活性会导致二级引物和扩增产物在反应过程中被消化，导致最终产生的产物较少，AuNPs难以聚集，因此，本研究选择工作温度较高、高链置换能力且无外切酶活性的Bst 3.0聚合酶；
使用修饰好的特异性纳米金探针（DP-AuNPs）进行分支滚环扩增，并分别比较了含有0、100 fM、1 pM和10 pM的四种不同靶DNA浓度的检测样本的光声信号随反应时间的变化；
本发明对光声信号的处理与定义过程为：数据采集卡在脉冲激光照射20.25μs后开始记录信号值（因为从比色皿，即样品到超声换能器的距离为30 mm。）取一次信号采集结果中信号的波峰减去波谷所得值为该次所采集到光声信号值，通过将该次采集结果的光声信号值与空白样本测得的光声信号值作比值，实现对光声信号的标准化；
靶标浓度越高的样本，其反应随时间变化的曲线斜率越陡，到达最大信号值的时间也越早，在达到最大信号值后，光声信号仍然会随反应时间的增加而小幅度增加，这可以归因于较高的反应温度（60°C）和激光诱导局部加热所触发的纳米金粒子的非特异性聚集；
与其余低浓度的样品相比，含有最高靶标浓度（10 pM）的样品的饱和光声信号值反而最小，这是由扩增过程中短时间内大量产生的短单链DNA产物引起的，大量的短单链DNA产物与纳米金探针表面的检测探针DNA相结合，使其饱和并无法进一步相互交联形成聚集体，并因此导致钩状效应，即最高靶标浓度（10 pM）下的饱和光声信号值小于其余的低浓度样品光声信号；
其光声定量检测结果如图4（a）所示（图4a中信号的处理：为5个平行样品的平均值，误差棒代表标准差）；
特别的需要注意的是：图4a的光声信号不同，前者为样品信号与空白样品1 h后的信号的比值，后者为样品信号与空白样品0 min时的比值，在数据处理时需要重新定义；
在0.1 fM ~ 1 pM的靶标浓度范围内，光声响应与靶标浓度呈单调正相关，其动态检测范围约3个数量级，基于三倍偏差法则计算其临界值，结果可得：该方法的检测限为0.3fM。在0.3 ~ 300 fM的动态检测范围内，七个不同浓度样品的变异系数的平均值为5%，系统重复性好；
所述光声传感定量系统的特异性实验结果如图4（b）所示；
使用该检测方法对浓度分别为10 fM和1 pM的四种样品进行检测，其中，四种检测样品分别是：含有无关DNA的样品（平均大小为150 nt的剪切鲑鱼精DNA，超声剪切处理鲑鱼精DNA后加热并骤冷获得的平均长度为150碱基的DNA单链）、含有人工合成的野生型DNA序列的样品、含有靶标DNA（突变）序列的样品，以及含有前三种DNA序列的混合样品；
将检测结果进行比较，可以发现：含有无关DNA序列和野生型DNA序列的样品，其光声信号值，接近于空白对照归一化的平均值；此外，含有这三种序列的混合样品的光声信号与仅含有靶标DNA的样品的光声信号值十分相似，这表明本发明中所提出的光声传感定量方法具有较好的特异性和鲁棒性。
所述挂锁探针是一段短单链线性DNA，且当靶标序列存在时，在所述DNA连接酶的作用下，原本是线性的挂锁探针会自身首尾相接形成环状，作为后续滚环扩增反应的环状模板，滚环扩增产物在二级引物作用下进行分支滚环扩增。
所述设备搭建包括有壳体、两个光学窗口、第一底座、微量比色皿、第二底座、水浸超声探头、第三底座、声反射镜和脉冲激光器，两个光学窗口分别开设在壳体的两侧外壁上，所述第一底座固定安装在壳体的底部内壁上，所述微量比色皿设置在第一底座的顶部上，所述第二底座固定安装在壳体的底部内壁上，所述水浸超声探头设置在第二底座的顶部上，所述第三底座固定安装在壳体的底部内壁上，所述声反射镜设置在第三底座的顶部上，所述脉冲激光器设置在壳体的一侧，所述脉冲激光器与微量比色皿、声反射镜和两个光学窗口相适配。
所述分支滚环扩增为基于核酸连接酶连接挂锁探针并触发分支滚环扩增来实现核酸检测。
所述核酸连接酶对连接酶连接位点的核酸配对有着十分苛刻的要求，这种高度特异性已被广泛用于单核苷酸突变的检测。
Claims (4)
1.一种非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法，其特征在于，包括：
核酸扩增检测策略、光声传感定量策略及设备搭建；
所述核酸扩增检测策略包括挂锁探针，二级引物和检测探针的DNA序列，并将所述检测探针DNA修饰至纳米金粒子表面，形成特异性纳米金探针，且通过核酸连接酶连接挂锁探针，触发分支滚环扩增，所述分支滚环扩增的产物将引起纳米金探针的聚集，从而产生光声信号，其中检测SARS-COV-2 N501Y突变株A23063T单核苷酸多态性所用挂锁探针序列为Phosphate（磷酸化）-AGT GGG TTG GAA ACC ATA TGA TAG AGC TAA TAT GAG ATA AAG CAGTGA CAT ACG ACA CGG TTG GTA ACC AAC ACC ATA，二级引物序列为AAG CAG TGA CAT ACGACA C，检测探针序列为CTC ATA TTA GCT CTA TCA TAT GGT TTC CAA CCC TTT TTT TTTTTT TTT TTT T-C3-Thiol（巯基），突变型靶标序列为TGG TTT CCA ACC CAC TTA TGG TGTTGG TTA CCA，野生型靶标序列为TGG TTT CCA ACC CAC TAA TGG TGT TGG TTA CCA，扩增反应所用DNA聚合酶为Bst3.0聚合酶；
所述光声传感定量是一种基于光声效应的无损检测技术，所述光声效应是指在短脉冲激光照射下，生物组织吸收了光能之后，温度的升高引起瞬态热膨胀，从而导致局部压力的上升，并产生光声信号；
所述光声传感定量策略包括以下步骤：
（1）.将检测样品放置于设备搭建中，对阳性样品中聚集后的纳米金粒子所产生的光声信号进行收集、滤波、放大处理，并借助计算机进行相关计算，即可得到该检测样品的具体光声信号值，光声信号值的大小与样品中检测靶标的浓度在一定区间内单调相关，最终可实现对靶标的快速定量检测。
2.根据权利要求1所述的非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法，其特征在于，所述挂锁探针是一段短单链线性DNA，且当靶标序列存在时，在所述DNA连接酶的作用下，原本是线性的挂锁探针会自身首尾相接形成环状，作为后续滚环扩增反应的环状模板，滚环扩增产物在二级引物作用下进行分支滚环扩增。
3.根据权利要求1所述的非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法，其特征在于，所述设备搭建包括有壳体、两个光学窗口、第一底座、微量比色皿、第二底座、水浸超声探头、第三底座、声反射镜和脉冲激光器，两个光学窗口分别开设在壳体的两侧外壁上，所述第一底座固定安装在壳体的底部内壁上，所述微量比色皿设置在第一底座的顶部上，所述第二底座固定安装在壳体的底部内壁上，所述水浸超声探头设置在第二底座的顶部上，所述第三底座固定安装在壳体的底部内壁上，所述声反射镜设置在第三底座的顶部上，所述脉冲激光器设置在壳体的一侧，所述脉冲激光器与微量比色皿、声反射镜和两个光学窗口相适配。
4.根据权利要求1所述的非疾病诊断与治疗目的的基于光声定量检测设备的单核苷酸突变检测方法，其特征在于，所述分支滚环扩增为基于核酸连接酶连接挂锁探针并触发分支滚环扩增来实现核酸检测。
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