CN103614483A - 基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，在洗净的金电极上滴加捕获探针，冰箱中过夜后取出封闭，在金电极上滴加待测样品，反应完后再滴加环化DNA，反应，滚环扩增，再加入金纳米探针，杂交，进行DPV信号检测。本发明选用沙门菌高度保守的invA基因，设计与其特异性结合的探针，结合滚环扩增与金纳米技术，利用电化学技术检测沙门菌invA基因，灵敏度上有了极大的改善，使得检测的线性范围达到100aM～10pM，灵敏度为：100aM。污染牛奶中沙门菌检测范围为20～6×10⁸CFU mL^-1的沙门菌，最低检测限为20CFU mL^-1。本发明构建了快速和超灵敏检测沙门菌的方法，极大提高了检测的灵敏度，具有检测设备小型化、简便快速和检测成本低的特点。

Description

基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法

技术领域

本发明涉及一种沙门菌基因的检测方法，尤其涉及一种基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，属于生物检测领域。

背景技术

沙门氏菌属肠杆菌科,是革兰阴性肠道杆菌，它是食源性疾病中最重要的致病菌之一。沙门氏菌感染后主要引起食物中毒、胃肠炎、伤寒和副伤寒。有研究表明，沙门氏菌的侵袭蛋白与其致病性密切相关，决定着细菌进入宿主上皮细胞的能力。它主要由一系列基因编码，其中invA是编码沙门菌侵染上皮细胞表面蛋白的基因，与该菌致病性密切相关，是沙门菌特有的。

目前，最常用的肠道致病菌检测方法主要有三种：传统的分离培养鉴定、酶联免疫吸附法（ELISA）和聚合酶链式反应（PCR）。传统的分离培养鉴定法是将细菌分离培养后通过菌落计数和菌落形态、染色特征、生化反应等方法对细菌进行鉴定，该方法是细菌鉴定的金标准方法，但是其耗时费力。ELISA方法是基于抗原抗体反应的免疫学检测，与传统的分离培养鉴定方法相比较，缩短了检测时间，但是仍然需要细菌培养这一步，至少需要24～48小时才能得出准确的结果，而且该方法的检测限一般为≥10⁵CFU mL^-1，难以满足低浓度细菌的检测。PCR技术与上述两种方法相比较，优点是较高的灵敏度，但是PCR结果容易出现假阳性；目前实验室主要用凝胶电泳技术来检测PCR扩增的片段，但是凝胶电泳技术的分辨率较低且需要较高精确度的热循环仪，因此限制了PCR技术在实验室检测细菌的广泛运用。另一方法，不使用热循环仪的核酸依赖的扩增（NASBA）和自主序列复制系统（ASR）,在特异性上又大打折扣，主要是由于必须用一个相对较低的温度40℃来进行扩增。链置换扩增术（SDA）利用四种引物在等温条件下扩增,很大程度上克服了这些缺陷，但是仍然存在薄弱的环节：必须利用昂贵的修饰核苷酸作为底物来进行扩增反应。

生物学研究领域中经常遇到一些不能直接扩增的待测分子，且由于其浓度较低而无法检测，因而信号放大技术对不能进行直接扩增的低浓度待测分子的检测显得尤为重要。核酸分子体外扩增是生物技术研究的重要手段，如用于病毒检测和遗传病点突变检测方面的连接酶链式反应（LCR）、支链DNA信号放大系统（bDNA）和侵染探针技术（Invader）；用于快速准确检测和定量分析RNA的NASBA和转录介导的扩增（TMA）；用于检测目的DNA片段的Qβ复制等。目前为止，聚合酶链式反应（PCR）和滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）仍是使用较多的扩增技术。RCA是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物（与部分环状模板互补），在酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复模板片段。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。RCA技术的优势是：高灵敏度、高特异性、简单、易操作、多元性、高通量。

纳米颗粒是一种人工合成的微小颗粒，它的形态可能是乳胶体、聚合物、陶瓷颗粒、金属颗粒和碳颗粒。1996年，Mirkin等人(Mirkin，C.A.，et al；)发现表面修饰有核酸探针的13nm金颗粒溶液中加入与修饰核酸互补配对的目标核酸分子时，由于金颗粒聚集导致溶液的颜色由红变蓝。自此利用纳米颗粒来进行生物分子检测的研究得到广泛应用。目前通用的方法主要分为两种，一种是利用在金或银纳米颗粒修饰核酸探针，根据溶液的颜色变化来检测目标核酸分子，优点是检测方法简单，但是所用的纳米颗粒成本较高；另一种是利用在颗粒表面修饰核酸分子，通过不同的核酸扩增手段后加入荧光探针来进行目标分子检测，优点是检测的灵敏度高，但是荧光探针的成本也较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于构建快速和超灵敏检测沙门菌invA基因的方法，选用沙门菌高度保守的invA基因，设计与其特异性结合的探针，利用滚环扩增与金纳米技术，用电化学策略检测沙门菌，提供一种检测设备小型化、简便快速、灵敏度高、检测成本低的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，包括以下步骤：

1）将裸金电极抛光,洗涤，然后浸入食人鱼溶液中10～15min，再取出清洗、干燥；

2）将巯基标记的捕获探针滴加于上述金电极上，置于4℃冰箱中过夜；

3）将步骤2中的金电极取出，冲洗，用6-巯基-1-己醇封闭1～1.5h，再次冲洗金电极，然后用鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液封闭金电极30～40min；

4）将步骤3中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加待测样品溶液，37℃反应1～1.5h，然后在金电极上滴加提前制备好的环化DNA，37℃反应1～1.5h；

5）将步骤4中的金电极取出冲洗，加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应液，37℃滚环扩增1～1.5h；

6）将步骤5中的金电极取出冲洗，加入用2×SSC杂交液配制的金纳米探针，37℃杂交1～1.5h，用DEA缓冲液清洗电极；

7）在步骤6中的金电极上加入用含有0.8%BSA的DEA缓冲液配制的1.25μg/mL的ST-AP，37℃反应30～45min，用DEA缓冲液冲洗后，置入用DEA缓冲液配制的0.75mg/mL的α-NP底物溶液中进行差动脉冲伏安法DPV信号检测，所得信号用标准曲线法或标准对照法即可得到待检样品中沙门菌的浓度。

所述步骤1中金电极抛光用粒度为0.05μm的氧化铝粉，所述的食人鱼溶液为浓H₂SO₄:H₂O₂体积比为3:1的溶液。

所述的巯基标记的捕获探针序列为：5’-SH-(CH₂)₆–TTTTTTTTTAATACCGGCCTTCAAATCGGCATC-3’，用于制备金纳米探针的用巯基标记的信号探针序列为：5’-SH-(CH₂)₆-TTTTTTTCAGAACTCACCTGTTAGTTTTTT-biotin-3’，制作环化模板DNA时所用的待环化模板DNA序列为：5’-p-CTCAGCTGTGTAACAACATGAAGATTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAACTGTGAAGATCGCTTATTATG TCCTATC-3′，探针2序列：5’–AATACTCATCTGTTTACCGGGCATAAAAAAAAACACAGCTGAGGATAGGACAT-3’。

所述步骤3至6中金电极的冲洗按照如下步骤完成：先用含0.005%吐温20的Tris-HCl缓冲液冲洗三次，然后再用Tris-HCl缓冲液冲洗三次，Tris-HCl缓冲液为含有0.1M氯化钠、5mM氯化镁、20mM Tris-HCl，pH7.4。

所述步骤3中的鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液按浓度为10mg/ml的鲑鱼精DNA与2%BSA体积比为1:80混合配制。

所述步骤5中的滚环扩增反应液中含50mM Tris,10mM氯化镁,33mM醋酸钾,1mM二硫苏糖醇,0.1%吐温-20，pH7.5。

所述步骤6中的2×SSC杂交液含有0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸三钠,pH7.4；所述DEA缓冲液为含有0.1M二乙醇胺，1mM氯化镁，100mM氯化钾,pH9.6。

该方法沙门菌特异性的invA基因检测的线性范围为100aM～10pM，最低检测限为：100aM。

有益效果：本发明选用沙门菌高度保守的invA基因，设计与其特异性结合的探针，结合滚环扩增与金纳米技术，基于其信号放大作用，利用电化学技术检测沙门菌，检测限上有了极大的改善，invA基因检测灵敏度达到100aM～10pM，最低检测限为：100aM。污染牛奶中沙门菌检测范围为20～6×10⁸CFU mL^-1的沙门菌，最低检测限为20CFU mL^-1。本发明构建了快速和超灵敏检测沙门菌invA基因的方法，极大提高了检测的灵敏度，在检测上不需要昂贵的仪器设备，具有检测设备小型化、简便快速、灵敏度高和检测成本低的特点。

附图说明

图1为本发明的检测原理示意图；

图2为本发明的沙门菌invA基因浓度与电流信号线性关系图；

图3为本发明的传感器特异性考察图，其中Complement为沙门菌靶序列，Non-complement为作为对照的非完全互补序列，Blank为空白对照；

图4为本发明的沙门菌浓度与电流信号线性关系图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

本发明中的ST-AP为Streptavidin-alkaline Phosphatase，中文名称为亲和素标记碱性磷酸酶，购自Sigma公司（美国）。

本发明中的α-NP为α-Naphthyl Phosphate,中文名称为1-萘基磷酸酯，购自Sigma公司（美国）。

本发明中的BSA为bovine serum albumin，中文名称为小牛血清白蛋白，购自Sigma公司（美国）。

实施例一、制备环化DNA

将100nmol5’端磷酸化的待环化模板DNA与100nmol探针2混合于100μL连接缓冲液中（pH7.5，50mM Tris,10mM MgCl₂,10mM二硫苏糖醇,0.5mM ATP），接着加入0.2U的T4DNA连接酶，于37℃连接反应60分钟；65℃10分钟灭活T4DNA连接酶，得到的环化模板DNA在-20℃下保存备用。所用的5’端磷酸化的待环化模板DNA序列为：5’-p-CTCAGCTGTGTAACAACATGAAGATTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAACTGTGAAGATCGCTTATTA TGTCCTATC-3′，探针2序列为：5’–AATACTCATCTGTTTACCGGGCATAAAAAAAAACACAGCTGAGGATAGGACAT-3’。

实施例二、金纳米粒子和金纳米探针的制备

（1）用王水浸泡所有器皿24小时，用双蒸水将其冲洗干净备用。

（2）配制100mL0.01%的HAuCl₄·4H₂O去离子水溶液，置于加热磁力搅拌器上搅拌，待溶液煮沸后迅速加入4mL1%柠檬酸三钠溶液。金纳米粒子溶液颜色首先变黑，再逐渐变为酒红色。继续搅拌8～10分钟后，关闭热源并继续搅拌冷却至室温，放入4℃冰箱内备用。

（3）取9μL100μM巯基标记的信号探针加入300μL上述步骤2中的金纳米粒子溶液中，在磁力搅拌器上4℃过夜搅拌12小时。所述的信号探针序列为：5’-SH-(CH₂)₆-TT TTTTTCAGAACTCACCTGTTAGTTTTTT-biotin-3’。

（4）在上述步骤3中过夜搅拌的金纳米粒子溶液中加入0.5M NaCl老化，搅拌12小时。

（5）步骤4中的溶液停止搅拌后收集至离心管8000rpm离心30分钟,去除上清液，所得的DNA修饰的金纳米探针溶于2×SSC溶液（pH7.4，含有0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸三钠）中放置于4℃冰箱保存备用。

实施例三、制备待检样品

一、提取用作PCR模板的基因组DNA

由于沙门菌感染很多是食源性的，因此通常可以用食品或者粪便作为检测源。

用食品检测：在无菌条件下进行操作，将待检食品放入匀浆机中搅成匀浆，取25g（或mL)待检样品的匀浆用225mL缓冲蛋白胨水(BP)稀释成1∶10的均质匀浆液。取1mL均质匀浆液置于离心管中，12000r/min离心5min，灭菌生理盐水洗涤2次，最后用0.25mL蒸馏水悬浮，置于100℃水浴中孵育15分钟然后立即置于冰中。在4℃以12000r/min离心10分钟后，将上清液转移至新管中，该上清液中即含有可以直接用作PCR模板的基因组DNA。

用粪便检测：取腹泻患者粪便标本200mg,使用QIAamp DNA Stool MiniKit(Qiagen Inc.,Valencia,CA,USA,Cat No.51504)试剂盒进行DNA的分离提取,具体步骤按照说明书操作。

二、扩增得到待检的PCR产物样品

配制PCR反应液，含有：取步骤一中来源于食品或者粪便的含有基因组DNA的上清液5.0μL，20μM的正反向引物各1.0μL，25μL的Premix Taq(1.25U DNA polymerase,2×Taq buffer,0.4mM dNTPs)和18μL水，PCR反应的最终体积为50μL。根据沙门菌高度保守的invA基因，利用NCBI网站的Primer Blast模块设计invA基因的扩增引物，正向引物序列为：5’-GCATCCGCATCAATAATACCG-3’，反向引物序列为：5’-TTCTCTGGATGGTATGCCC-3’。PCR反应条件如下：95℃预变性1分钟；接着95℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃引物延伸30秒，35个循环，最后72℃延伸4分钟。扩增产物保藏于4℃冰箱备用，即得到待检样品。

实施例四、基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，按照以下步骤进行：

1）将裸金电极用粒度为0.05μm的氧化铝粉抛光，超声清洗，然后浸入食人鱼溶液中（浓H₂SO₄:H₂O₂=3:1）10～15min，用去离子水清洗金电极后室温自然干燥；

2）将10μL的100nM巯基标记的捕获探针滴加于上述金电极上，置于4℃冰箱中过夜。所述的巯基标记的捕获探针序列为：

5’-SH-(CH₂)₆–TTTTTTTTTAATACCGGCCT TCAAATCGGCATC-3’。

3）将步骤2中的金电极取出，冲洗，用6-巯基-1-己醇封闭1～1.5h，再次冲洗金电极，然后用鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液封闭金电极30～40min；所述的鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液按浓度为10mg/mL的鲑鱼精DNA与2%BSA体积比为1:80混合配制；

4）将步骤3中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加10μL待测样品溶液37℃反应1～1.5h，然后在金电极上滴加10μL提前制备好的环化DNA，37℃反应1～1.5h；

5）将步骤4中的金电极取出冲洗，加入10μL含1mM dNTP、0.2U phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应液(含50mM Tris,10mM氯化镁,33mM醋酸钾,1mM二硫苏糖醇,0.1%吐温-20，pH7.5)，37℃滚环扩增1～1.5h；

6）将步骤5中的金电极取出冲洗，加入用2×SSC杂交液配制的金纳米探针，37℃杂交1～1.5h，用DEA缓冲液清洗电极；所述的2×SSC杂交液含有0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸三钠，pH7.4；所述DEA缓冲液为含有0.1M二乙醇胺，1mM氯化镁，100mM氯化钾，pH9.6；

所述步骤3至6中金电极的冲洗按照如下步骤完成：先用含0.005%吐温20的Tris-HCl缓冲液冲洗三次，然后再用Tris-HCl缓冲液冲洗三次，Tris-HCl缓冲液含有0.1M氯化钠、5mM氯化镁、20mM Tris-HCl，pH7.4；

7）在步骤6中的金电极上加入用含有0.8%BSA的DEA缓冲液配制的1.25μg/mL的ST-AP，37℃反应30～45min，先用含有0.005%吐温20的DEA缓冲液冲洗三次，再用不含吐温20的DEA缓冲液冲洗三次，置入DEA缓冲液配制的0.75mg/mL的α-NP底物溶液中进行DPV信号检测，所得信号用标准曲线法或标准对照法即可得到待检样品中沙门菌的浓度。

电化学检测DPV信号，DPV信号和沙门菌invA基因的浓度线性关系图如图2所示，计算得到其线性关系为：ip(A)=0.14×lgC+0.72，其中ip为电流信号强度，C为沙门菌invA基因浓度。根据得到的电流信号强度值，即可换算得到待检样品中的沙门菌invA基因的浓度值。

为了研究传感器的特异性，非完全互补的合成DNAs被用来验证。使用该方法分别检测待检样品、非完全互补序列（序列为5’–AGCGCAGCTGCGCAATAGAATTGAAGAGGATTATGATGGCTACGTGAA–3’）和空白对照，得到利用该方法检测的传感器特异性考察图，如图3所示，从特异性考察图中可以看出非完全互补序列的DPV响应值明显低于靶DNA，信号值与空白信号相近。这些结果表明设计的传感器能有效区分不同的DNA序列，表现出良好的选择性。

Claims (8)

1.一种基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，包括以下步骤：

1）将裸金电极抛光,洗涤，然后浸入食人鱼溶液中10～15min，再取出清洗、干燥；

2）将巯基标记的捕获探针滴加于上述金电极上，置于4℃冰箱中过夜；

3）将步骤2中的金电极取出，冲洗，用6-巯基-1-己醇封闭1～1.5h，再次冲洗金电极，然后用鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液封闭金电极30～40min；

4）将步骤3中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加待测样品溶液，37℃反应1～1.5h，然后在金电极上滴加提前制备好的环化DNA，37℃反应1～1.5h；

5）将步骤4中的金电极取出冲洗，加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应液，37℃滚环扩增1～1.5h；

6）将步骤5中的金电极取出冲洗，加入用2×SSC杂交液配制的金纳米探针，37℃杂交1～1.5h，用DEA缓冲液清洗电极；

7）在步骤6中的金电极上加入含有0.8%BSA的DEA缓冲液配制的1.25μg/mL的ST-AP，37℃反应30～45min，用DEA缓冲液冲洗后，置入用DEA缓冲液配制的0.75mg/mL的α-NP底物溶液中进行示差脉冲伏安法DPV信号检测，所得信号用标准曲线法或标准对照法即可得到待检样品中沙门菌的浓度。

2.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:所述步骤1中金电极抛光用粒度为0.05μm的氧化铝粉，所述的食人鱼溶液为浓H₂SO₄:H₂O₂，体积比为3:1。

3.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:所述的巯基标记的捕获探针序列为：5’-SH-(CH₂)₆–TTTTTTTTTAATACC GGCCTTCAAATCGGCATC-3’，用于制备金纳米探针的用巯基标记的信号探针序列为：5’-SH-(CH2)6-TTTTTTTCAGAACTCACCTGTTAGTTTTTT-biotin-3’，制作环化DNA时所用的待环化模板DNA序列为：5’-p-CTCAGCTGTGTAACAACATGAAGATTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAACTGTGAAGATCGCTTATTATG TCCTATC-3′，探针2序列为：5’–AATACTCATCTGTTTACCGGGCATAAAAAAAAACACAGCTGAGGATAGGACAT-3’。

4.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:所述步骤3至6中金电极的冲洗按照如下步骤完成：先用含0.005%吐温20的Tris-HCl缓冲液冲洗三次，然后再用Tris-HCl缓冲液冲洗三次，Tris-HCl缓冲液为含有0.1M氯化钠、5mM氯化镁、20mM Tris-HCl，pH7.4。

5.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:所述步骤3中的鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液按浓度为10mg/ml的鲑鱼精DNA与2%BSA体积比为1:80混合配制。

6.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:所述步骤5中的滚环扩增反应液中含50mM Tris,10mM氯化镁,33mM醋酸钾,1mM二硫苏糖醇,0.1%吐温-20，pH7.5。

7.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:所述步骤6中的2×SSC杂交液为含有0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸三钠,pH7.4；所述DEA缓冲液为含有0.1M二乙醇胺，1mM氯化镁，100mM氯化钾,pH9.6。

8.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:沙门菌特异性的invA基因检测的线性范围为100aM～10pM，最低检测限为：100aM。

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