CN112444545B - 基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器及其制备方法和应用。该传感器包括三电极系统中用作工作电极的导电玻璃电极，导电玻璃电极的反应端表面修饰有苯环掺杂氮化碳纳米片，苯环掺杂氮化碳纳米片表面共价交联有双链DNA识别探针，双链DNA识别探针结合有PtNi纳米酶信号探针，PtNi纳米酶信号探针主要由PtNi纳米线组成。制备方法包括依次在导电玻璃电极反应端表面修饰苯环掺杂氮化碳纳米片、双链DNA识别探针和PtNi纳米酶信号探针。本发明的传感器具有较高的选择性、重复性和稳定性，制备方法工艺简单、成本低、且效率高，该传感器可用于检测抗生素，检测范围宽、检测限低。

Description

基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种光电化学适配体传感器及其制备方法和应用，具体涉及一种基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器及其制备方法和应用。
背景技术
由于仪器简单，低成本，响应快速和高灵敏度等优点，光电化学适配体传感器已经引起了越来越多的研究兴趣。为了提高光电化学适配体传感器的灵敏度，信号放大是必不可少的。在各种策略当中，酶介导的催化沉降是一种简单而有效的方法，它可以在电极表面诱导产生不溶性且不导电的产物，阻碍界面电子传递，进而影响光电流的变化。但是，天然酶(如辣根过氧化物酶)的分离提纯成本高、稳定性差以及储存条件苛刻，极大地限制了它们在生物传感领域中的应用。为了克服这一缺点，已经开发出了多种具有酶活性的纳米材料的人工模拟酶，即纳米酶，比如金属氧化物，贵金属和碳纳米材料等等。它们具有制备过程简单、高稳定性、低成本等优点，已经成为了人们重点研究的对象，并且已经出现关于具有类过氧化物酶功能的纳米材料应用于光电化学生物传感器产生催化沉降用于信号放大的报道。例如Fe3O4、CuS、Co3O4等。然而，它们的催化活性较低，导致信号放大作用较弱，不能显著的提高光电化学适配体传感器的灵敏度。
申请人发现，铂(Pt)基纳米材料虽被公认为具有强的过氧化物酶催化活性，然而贵金属Pt为稀有金属且成本高。为了解决这些问题，合理设计Pt基纳米材料的组成和结构以提高Pt原子的利用率和改善它的催化活性是十分重要的。另外，对于光电化学传感器来讲，光电活性材料扮演着重要的角色。非金属的石墨相氮化碳(g-C3N4)作为一种光活性材料，由于其优异的化学稳定性和低廉的制备成本引起人们的关注，然而纯的g-C3N4由于其量子产率不高而表现出较低的光电转换效率。为了提高光电性能，通常需要对其进行改性。另一方面，为了实现对检测对象产生特异性的光电响应，常将DNA、分子印迹聚合物、抗体、酶或适配体与光电极一起作为光电化学传感器中的识别元件，然而由这些识别元件构成的光电化学传感器存在结构复杂、稳定性差、使用寿命短、抗干扰能力差、检测范围和检测极限不足等问题，这严重限制了光电化学传感器的广泛应用。因此，亟需开发设计一种基于高催化活性的过氧化物模拟酶和高光电转换效率的光电活性材料的光电化学适配体传感器，使其能够直接快速且高灵敏度的检测环境样品中的污染物。
抗生素是一类具有抗菌活性的药物，它在动物源性食品中的残留是典型的食品安全问题之一，并且由于滥用和抗生素耐药性的增加而被视为重要的健康危害。氯霉素(CAP)是一种广谱抗生素，因其成本低、抗菌效率高，曾经被广泛应用于人类和畜牧业疾病的防治。但其对人体具有毒性和严重副作用。因此，CAP的应用目前已经被限制。然而，由于不合法的使用，现在在河流甚至动物源性食品如蜂蜜、鸡蛋和牛奶中都发现了CAP残留，严重威胁人类健康。目前测定CAP的方法包括：高效液相色谱法、酶联免疫吸附试验、毛细管电泳法、和电化学方法等等，这些方法中存在仪器设备复杂、操作繁琐、精确度和特异性较差、检测成本较高等问题。因此，迫切需要开发一种简单、高灵敏度和高选择性的方法来定量检测环境中的氯霉素。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种微型化、稳定性高、灵敏度高的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器，并相应提供一种工艺简单、操作便捷、安全、成本低廉、无污染、制作效率高的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的制备方法，同时还提供一种上述基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器在检测抗生素中的应用，特别地采用上述基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器检测氯霉素时具有抗干扰能力强、检测范围宽、检测限低等优点。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案。
一种基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器，包括三电极系统中用作工作电极的导电玻璃电极，所述导电玻璃电极的反应端表面修饰有苯环掺杂氮化碳纳米片，所述苯环掺杂氮化碳纳米片表面共价交联有双链DNA识别探针，所述双链DNA识别探针结合有PtNi纳米酶信号探针，所述PtNi纳米酶信号探针主要由PtNi纳米线组成。
上述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器，优选的，所述双链DNA识别探针由核酸适配体和互补DNA杂化构成，所述PtNi纳米酶信号探针结合于所述核酸适配体上。
上述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器，优选的，所述核酸适配体上修饰有生物素，所述PtNi纳米线为链霉亲和素杂化的PtNi纳米线。
上述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器，优选的，所述PtNi纳米线为超细PtNi纳米线，所述超细PtNi纳米线的平均直径为1nm～5nm。
上述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器，优选的，所述导电玻璃电极为氟掺杂二氧化锡导电玻璃电极。
上述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器，优选的，所述核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述互补DNA具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体如下：
5′-biotin-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3′；
互补DNA具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，具体如下：
5′-NH2-(CH2)6-CTACCACCGACTCGC-3′。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备苯环掺杂氮化碳纳米片；
(2)将苯环掺杂氮化碳纳米片分散制成苯环掺杂氮化碳纳米片悬浮液，然后涂覆于导电玻璃电极的反应端表面，得到苯环掺杂氮化碳纳米片修饰的导电玻璃电极；
(3)将互补DNA溶液滴加到步骤(2)所得苯环掺杂氮化碳纳米片修饰的导电玻璃电极进行反应，使互补DNA与苯环掺杂氮化碳纳米片共价交联，然后将反应后的导电玻璃电极采用牛血清蛋白溶液进行培养，再将核酸适配体溶液滴加到培养后的导电玻璃电极表面，使核酸适配体与互补DNA进行杂交反应，形成双链DNA识别探针，得到双链DNA识别探针和苯环掺杂氮化碳纳米片修饰的导电玻璃电极；
(4)将PtNi纳米酶悬浮液滴加到步骤(3)所得双链DNA识别探针和苯环掺杂氮化碳纳米片修饰的导电玻璃电极表面进行反应，使PtNi纳米酶被导入导电玻璃电极中并作为信号探针，得到基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器。
上述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的制备方法，优选的，所述步骤(1)中，所述苯环掺杂氮化碳纳米片主要由以下方法制备得到：
(1.1)将尿素和双酚S混合均匀，得到混合物，尿素和双酚S的质量比为500～1000∶1；
(1.2)将步骤(1.1)得到的混合物加热升温至530℃～550℃，焙烧4h～6h，得到苯环掺杂氮化碳粉体；
(1.3)将步骤(1.2)得到的苯环掺杂氮化碳粉体升温至500℃～520℃，焙烧1h～2h，得到苯环掺杂氮化碳纳米片。
上述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的制备方法，优选的，所述步骤(1)中，所述苯环掺杂氮化碳纳米片悬浮液中苯环掺杂氮化碳纳米片的浓度为2mg/mL～10mg/mL。
上述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的制备方法，优选的，所述步骤(2)中，所述苯环掺杂氮化碳纳米片分散至全氟磺酸溶液中得到苯环掺杂氮化碳纳米片悬浮液。
上述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的制备方法，优选的，所述步骤(3)中，所述互补DNA溶液的浓度为0.5μM～1μM，所述牛血清蛋白溶液的浓度为0.5wt％～1wt％，所述核酸适配体的浓度为0.5μM～1μM。
上述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的制备方法，优选的，所述步骤(4)中，所述PtNi纳米酶悬浮液由PtNi纳米酶分散于缓冲溶液中得到，所述PtNi纳米酶主要由PtNi纳米线和链霉亲和素杂化构成；所述PtNi纳米酶悬浮液的浓度为0.5mg/mL～1mg/mL。
上述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的制备方法，优选的，所述PtNi纳米线为超细PtNi纳米线，主要由以下方法制备得到：
将乙酰丙酮铂、乙酰丙酮镍和十六烷基三甲基溴化铵加入到液体油胺中，乙酰丙酮铂、乙酰丙酮镍、十六烷基三甲基溴化铵、液体油胺的比例为20mg～30mg∶10mg～15mg∶70mg～80mg∶5mL～10mL，在150℃～170℃下反应1h～2h，得到超细PtNi纳米线。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器或者上述的制备方法制得的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器在检测抗生素中的应用。
上述的应用，优选的，所述应用包括以下步骤：将不同浓度的抗生素溶液滴加到基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器中的导电玻璃电极的反应端进行反应，使光电化学适配体传感器中的识别探针对抗生素进行特异性识别，将特异性识别后的导电玻璃电极在含有过氧化氢(H2O2)和4-氯-1-萘酚(4-CN)的溶液中培养，再将培养后的导电玻璃电极作为工作电极，建立三电极系统，将三电极系统与电化学工作站连接，采用计时电流法在间歇光照下进行测试，根据抗生素浓度与光电流变化关系构建检测线性回归方程，根据检测线性回归方程计算待测溶液中抗生素的浓度。
上述的应用，优选的，所述抗生素为氯霉素，所述双链DNA识别探针由特异性识别氯霉素的核酸适配体和互补DNA组成，所述核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述互补DNA具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述过氧化氢的浓度为0.1mM～0.2mM，所述4-氯-1-萘酚溶液的浓度为1mM～1.5mM；所述氯霉素浓度与光电流变化关系的检测线性回归方程为：
I(nA)＝0.085 lg CCPA(pM)+0.186 (1)
式(1)中，I表示对应光电流值，单位为nA；CCPA为待测溶液中氯霉素的浓度，单位为pM，式(1)的相关系数R2＝0.9976，氯霉素检测线性范围为0.1pM～100nM，检测限为26fM。
本发明中，单位M指mol/L。
本发明的检测原理主要在于：在未检测目标污染物时，苯环掺杂氮化碳纳米片表面共价交联有双链DNA识别探针，双链DNA识别探针结合有PtNi纳米酶信号探针，信号探针在电极表面可通过催化过氧化氢和4-氯-1-萘酚氧化产生不溶且不导电的产物，阻碍界面的电子传递，显著降低由苯环掺杂氮化碳光照射下产生的光电流，起到信号放大作用。当目标污染物存在时，特异性双链DNA中的适配体由于与目标污染物的亲和性更强，因此特异性双链DNA结构解离，适配体带着信号探针从电极表面脱落，导致电极捕获PtNi纳米酶的量降低，即产生不溶性沉淀量减少，而引起光电流信号的升高，并且光电流信号随着目标物浓度的增加而增加，从而达到检测目标物的目的。本发明中，使用PtNi纳米酶作为过氧化物模拟酶在光电化学适配体传感器中诱导催化沉淀，实现了信号放大。此外，不同于以往的诱导信号“关”，本发明通过设计传感策略基于目标物诱导信号“开”，降低了传感器的背景噪音和假阳性概率，显著提高了光电化学适配体传感器的灵敏度。本发明光电化学适配体传感器具有稳定性高、使用寿命长、抗干扰能力强、检测范围宽、检测极限低等优点，可实现对水体和动物源性食品中的痕量污染物(如抗生素)的特异性检测，利用率高，且有着很好的使用价值和应用前景。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种光电化学适配体传感器，包括三电极系统中用作工作电极的导电玻璃电极(如氟掺杂的二氧化锡导电玻璃电极)，其中导电玻璃电极的反应端表面修饰有一层苯环掺杂氮化碳纳米片，该苯环掺杂氮化碳纳米片表面共价交联有特异性双链DNA识别探针以及PtNi纳米酶信号探针。本发明中，特异性双链DNA识别探针具有高特异性、结合能力强、高稳定性等优点，是一种抗干扰能力强的识别元件。
本发明中，苯环掺杂氮化碳纳米片具有超薄层状结构、比表面积大、孔径规整有序、分散性能好等优点，能够作为载体良好的固定双链DNA识别探针，并且捕获PtNi纳米酶作为信号探针用于信号放大。本发明中，将苯环结构平面整合到氮化碳分子结构的骨架上，扩大了π电子离域以及调整了能带结构。与纯氮化碳纳米片相比，苯环掺杂后的氮化碳的颜色发生显著变化，拓宽了对可见光的吸收范围，增强了对可见光的捕获能力，提高了光能利用率。本发明中，苯环掺杂氮化碳纳米片具有优异的光电转换效率，抑制了光生载流子的复合，促进电子和空穴分离，使得工作电极有更好的光生电子空穴对的分离效率与导电能力。因此，极大程度上提高了光电化学适配体传感器的灵敏度，从而使得光电化学适配体传感器具有宽的检测范围和低的检测极限。
本发明中，PtNi纳米酶衍生于一维超细PtNi纳米线，平均直径可低至1纳米。这种超细纳米线能够暴露更多的Pt晶面，大大提高Pt原子的利用率。另外，通过整合非贵金属Ni元素合成纳米材料，不仅可以降低制备成本，同时增加其稳定性。并且由于Pt和Ni之间的协同作用，极大促进了其催化活性。PtNi纳米线表现的类过氧化物酶活性远远高于天然辣根过氧化物酶以及其他Pt基纳米材料，并且对底物的亲和性比天然辣根过氧化物酶更高，可以作为有潜力的天然酶替代者。PtNi纳米酶作为高效的过氧化物模拟酶，能够在电极表面通过催化过氧化氢和4-氯-1-萘酚氧化产生不溶且不导电的产物，阻碍界面的电子传递，显著降低由苯环掺杂氮化碳光照射下产生的光电流，起到信号放大作用。当目标污染物存在时，特异性双链DNA中的适配体由于与目标污染物的亲和性更强，因此特异性双链DNA结构解离，适配体带着信号探针从电极表面脱落，导致电极捕获PtNi纳米酶的量降低，即产生不溶性沉淀量减少，而引起光电流信号的升高，并且光电流信号随着目标物浓度的增加而增加，从而达到检测目标物的目的。本发明中，使用PtNi纳米酶作为过氧化物模拟酶在光电化学适配体传感器中诱导催化沉淀，实现了信号放大。此外，通过设计传感策略基于目标物诱导信号“开”，降低了传感器的背景噪音和假阳性概率，显著提高了光电化学适配体传感器的灵敏度。本发明光电化学适配体传感器具有稳定性高、使用寿命长、抗干扰能力强、检测范围宽、检测极限低等优点，可实现对水体和动物源性食品中的痕量污染物(如抗生素)的特异性检测，利用率高，且有着很好的使用价值和应用前景。
(2)本发明光电化学适配体传感器的制备方法工艺简单、操作便捷、安全、成本低廉、无污染、制作效率高，苯环掺杂氮化碳纳米片作为功能型纳米材料用于制备光电化学适配体传感器的光电极，可减少工作电极制备步骤，提高光电化学适配体传感器的检测灵敏度。
(3)本发明制备方法中，还包括对苯环掺杂氮化碳纳米片的制备，由以下方法制得：通过简单的尿素与双酚S热共聚合方法合成。双酚S含有苯环结构，可以作为苯环的来源。在烧结的过程中会产生氨气，氨气在逸出的过程中会造成材料表面的不平整，能够增加材料的表面粗糙度，这在一定程度上能够增加材料的比表面积。为了获得片状结构，还需要通过热刻蚀，即在通入空气条件下，在高温下进行二次烧结。另外，加入双酚S的量很低，既可以使颜色发生显著改变，且所形成复合材料稳定性好，光电化学性能强。本发明苯环掺杂氮化碳纳米片的制备方法具有制备工艺简单、成本低、稳定性高、环境友好等优点，适合于大规模制备。
(4)本发明还提供了一种光电化学适配体传感器在检测抗生素中的应用，通过将抗生素溶液滴加到光电化学适配体传感器中导电玻璃电极(如氟掺杂的二氧化锡导电玻璃电极)的反应端表面进行反应，使光电化学适配体传感器中的识别探针对抗生素进行特异性识别和捕获，之后将特异性识别和捕获后的导电玻璃电极置于含过氧化氢和4-氯-1-萘酚的溶液中培养，再将所得电极作为工作电极，建立三电极系统，并通过三电极系统与电化学工作站连接，采用计时电流法在间歇光照下进行测试，建立抗生素浓度与光电流变化关系的检测线性回归方程，根据该检测线性回归方程计算待测溶液中抗生素的浓度。特别地，采用本发明光电化学适配体传感器检测氯霉素时，该光电化学适配体传感器能够检测水体和动物源性食品中的氯霉素，具有稳定性高、使用寿命长、检测范围宽、检测极限低、抗干扰能力强，便携易操作、响应迅速、灵敏度高、可替代天然酶等优点，应用范围广，应用价值高。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中苯环掺杂氮化碳纳米片(BR-CN)的透射电镜图。
图2为本发明实施例1中超细PtNi纳米线(PtNi NWs)的透射电镜图。
图3为本发明实施例1中评估超细PtNi纳米线(PtNi NWs)的类过氧化物酶活性的UV-vis图。其中，a为过氧化氢与3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的UV-vis吸收曲线(TMB-H2O2)，b为超细PtNi纳米线加入到过氧化氢与3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的UV-vis吸收曲线(TMB-H2O2-PtNi NWs)。
图4为本发明实施例1中氟掺杂导电玻璃电极逐次修饰苯环掺杂氮化碳纳米片、特异性双链DNA识别探针、PtNi纳米酶探针和实施例2在含有过氧化氢(H2O2)的4-氯-1-萘酚(4-CN)溶液中培养后四个阶段产物的阻抗图。其中，a为氟掺杂导电玻璃电极修饰有BR-CN(BR-CN/FTO)的阻抗曲线，b为修饰双链DNA识别探针(双链DNA/BR-CN/FTO)的阻抗曲线，c为修饰PtNi纳米酶探针(PtNi/双链DNA/BR-CN/FTO)的阻抗曲线，d为(PtNi/双链DNA/BR-CN/FTO培养后)在含有过氧化氢和4-氯-1-萘酚的溶液中培养后的阻抗曲线。
图5为本发明实施例2中不同浓度氯霉素与光电流变化关系的检测线性回归图。
图6为本发明实施例4中基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器检测不同抗生素时对应的光电流响应图，其中，A为氯霉素，B为氯霉素与卡那霉素，C为氯霉素与土霉素，D为氯霉素与链霉素，E为氯霉素与氧氟沙星，F为氯霉素、卡那霉素、土霉素、链霉素和氧氟沙星的混合物。
图7为本发明实施例5中评估基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器稳定性的对比图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中，若无特别说明，所采用的原料和仪器均为市售，所采用工艺为常规工艺，所采用设备为常规设备，且所得数据均是三次以上重复实验的平均值。
光源取自高亮度氙灯平行光源系统仪器，并以300W氙灯(北京泊菲莱)作为可见光源。电化学实验使用CHI660B电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)，利用传统的三电极体系：修饰的导电玻璃电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极(所有电位均相对于SCE)。
实施例1
一种本发明的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器，包括三电极系统中用作工作电极的导电玻璃电极，导电玻璃电极的反应端表面修饰有苯环掺杂氮化碳纳米片，苯环掺杂氮化碳纳米片表面共价交联有特异性双链DNA识别探针，双链DNA识别探针结合有PtNi纳米酶信号探针，PtNi纳米酶信号探针主要由PtNi纳米线与链霉亲和素杂化构成(也可认为主要由链霉亲和素杂化的PtNi纳米线构成)。其中，特异性双链DNA识别探针用于识别和捕获待测污染物，同时也可以特异性捕获PtNi纳米酶信号探针，PtNi纳米酶信号探针用于诱导催化沉淀生成，促进信号放大。
本实施例中，双链DNA识别探针由核酸适配体和互补DNA杂化构成，核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，核酸适配体上修饰有生物素，具体如下：
5′-biotin-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3′
互补DNA具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，具体如下：
5′-NH2-(CH2)6-CTACCACCGACTCGC-3′
本实施例中，PtNi纳米酶信号探针结合于双链DNA识别探针的核酸适配体上，具体通过修饰核酸适配体的生物素与修饰PtNi纳米线的链霉亲和素进行结合。
以上结构亦即苯环掺杂氮化碳纳米片表面先共价交联有互补DNA，互补DNA与核酸适配体杂化构成双链DNA，核酸适酸体5’端的生物素与PtNi纳米酶信号探针的链霉亲和素进行连接。
本实施例中，PtNi纳米线为超细PtNi纳米线，超细PtNi纳米线的平均直径为1.2nm。
本实施例中，导电玻璃电极为氟掺杂二氧化锡导电玻璃电极。
一种本实施例的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成苯环掺杂氮化碳纳米片
(1.1)将10g尿素与20mg双酚S研磨混合均匀，得到混合物；
(1.2)将混合物加热升温至530℃并维持4h，冷却至室温，得到的产物充分研磨成粉；
(1.3)将步骤(1.2)得到的粉体升温至500℃，维持2h，冷却至室温，得到苯环掺杂氮化碳纳米片，记为BR-CN。
如图1所示，对苯环掺杂氮化碳纳米片(BR-CN)进行透射电镜成像分析，其结果表明，苯环掺杂的氮化碳纳米片(BR-CN)的形貌与纯氮化碳纳米片(CN)类似，呈现有褶皱的片层结构，表面不光滑，具有大量的平面介孔结构，这些介孔结构将增大其比表面积，提供更多的附着位点。
(2)将步骤(1)中所得苯环掺杂氮化碳纳米片分散到全氟磺酸水溶液中，振荡均匀，得到苯环掺杂氮化碳纳米片悬浮液，将5mg/mL的苯环掺杂氮化碳纳米片悬浮液均匀涂覆在处理干净的氟掺杂二氧化锡(FTO)导电玻璃电极的反应端表面，形成苯环掺杂氮化碳纳米片的复合膜，干燥后，得到苯环掺杂氮化碳纳米片修饰的氟掺杂二氧化锡导电玻璃电极，记为BR-CN/FTO。
(3)将1μM的互补DNA溶液滴加到步骤(2)得到的苯环掺杂氮化碳纳米片修饰的氟掺杂二氧化锡导电玻璃电极的反应端面，反应12h，然后将1wt％牛血清蛋白溶液(BSA)滴加到反应后的修饰电极反应端面，培养1h，用于阻断非特异性结合位点，再将1μM的核酸适配体溶液(具体为特异性识别氯霉素的核酸适配体)滴加到培养后的修饰电极反应端面，杂交反应1h，形成双链DNA识别探针，得到双链DNA识别探针和苯环掺杂氮化碳纳米片修饰的导电玻璃电极，记为双链DNA/BR-CN/FTO；
核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，修饰有生物素，具体如下：
5′-biotin-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3′；
互补DNA具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，具体如下：
5′-NH2-(CH2)6-CTACCACCGACTCGC-3′。
(4)将1mg/mL PtNi纳米酶悬浮液滴到步骤(3)所得双链DNA识别探针和苯环掺杂氮化碳纳米片修饰的导电玻璃电极的反应端面，通过修饰核酸适配体的生物素与修饰PtNi纳米线的链霉亲和素之间的特异性反应，使PtNi纳米酶与双链DNA识别探针中的核酸适配体5’端连接结合，得到基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器，记为PtNi/双链DNA/BR-CN/FTO。
本实施例中，PtNi纳米酶悬浮液由PtNi纳米酶分散于Tris-Hcl缓冲溶液中得到，PtNi纳米酶主要由PtNi纳米线和链霉亲和素杂化构成。
本实施例中，PtNi纳米线为超细PtNi纳米线，超细PtNi纳米线由以下方法制备得到：将20mg乙酰丙酮铂、10mg乙酰丙酮镍和70mg十六烷基三甲基溴化铵加入到5mL液体油胺中，在150℃下反应2h，得到超细PtNi纳米线。
对超细PtNi纳米线的类过氧化物酶催化活性进行评估，方法如下：
(1)将5μg/mL的超细PtNi纳米线悬浮液加入到含有20mM H2O2的和100μM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)醋酸钠缓冲溶液(pH＝4)，反应5min。
(2)将步骤(1)反应后的溶液在紫外可见(UV-vis)分光光度计下扫描，测定波长652nm处的吸收值。
如图2所示，对上述制得的超细PtNi纳米线进行透射电镜成像分析，超细PtNi纳米线呈现一维纳米线结构，平均直径为1.2纳米，并且制得的超细PtNi纳米线的纯度很高。如图3所示，对上述制得的超细PtNi纳米线的类过氧化物酶活性进行UV–vis分析，无超细PtNi纳米线加入时，几乎没有吸收峰，当加入超细PtNi纳米线后，在波长652nm处有明显的吸收峰，说明超细PtNi纳米线具有高的类过氧化物酶活性，能够催化H2O2氧化TMB，产生显色反应。
实施例2
一种本发明的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器在检测抗生素中的应用，本实施例中，采用实施例1制备的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器，抗生素具体为氯霉素，光电化学适配体传感器中的核酸适配体对氯霉素分子具有特异性识别和捕获功能。
应用过程如下：
(a)将不同浓度的氯霉素溶液滴加到基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器中的导电玻璃电极的反应端表面，反应40min，使光电化学适配体传感器上的特异性适配体对氯霉素分子进行特异性识别和捕获，随后用Tris-Hcl缓冲溶液清洗修饰电极。
(b)将步骤(a)中清洗后的修饰电极培养在含有0.2mM过氧化氢(H2O2)和1mM 4-氯-1-萘酚(4-CN)的溶液中培养10min，记为PtNi/双链DNA/BR-CN/FTO培养后。
(c)将步骤(b)得到的修饰电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统。
(d)将三电极系统与电化学工作站连接，采用计时电流法在间歇光照下进行测试。
(e)根据氯霉素浓度与光电流变化关系构建检测线性回归方程，并根据检测线性回归方程计算待测溶液中氯霉素的浓度。
对实施例1中FTO导电玻璃电极逐次修饰苯环掺杂氮化碳纳米片(BR-CN)、特异性双链DNA识别探针、PtNi纳米酶指示探针和实施例2中在含有过氧化氢和4-氯-1-萘酚的溶液中培养后的四个阶段产物进行阻抗测试，测试环境为含有0.1M KCl的5.0mM铁氰溶液，结果如图4所示。由图4可知，随着特异性双链DNA识别探针修饰到BR-CN修饰的FTO导电玻璃电极上，电阻值增加，说明双链DNA识别探针成功修饰到了电极上；滴加PtNi纳米酶探针到电极上，电阻值进一步增加，说明已成功将PtNi纳米酶探针导入到传感器中；在含有过氧化氢和4-氯-1-萘酚的溶液中培养后，发现电阻值显著增加，说明PtNi纳米酶作为过氧化物模拟酶催化H2O2氧化4-CN生成了不溶和不导电的沉淀物，阻碍了界面电子传递，实现信号放大。
图5为本实施例中不同浓度氯霉素与光电流变化关系的检测线性回归图。图5中对应氯霉素溶液的浓度为0.1pM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM和100nM。由图5可知，光电流信号随着氯霉素浓度的增加而增加，且光电流值与氯霉素浓度的对数值呈现良好的线性关系。检测线性回归方程为：
I(nA)＝0.085 lg CCPA(pM)+0.186 (1)
式(1)中，I表示对应光电流值，单位为nA；CCPA为待测溶液中氯霉素的浓度，单位为pM；式(1)的相关系数R2＝0.9976，氯霉素检测线性范围为0.1pM～100nM，检测限为26fM。
由此可见，本发明的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器可以用来检测氯霉素，并可根据检测线性回归方程计算待测氯霉素的浓度。
实施例3
评估实施例1的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的检测精度，采用标准添加法将该光电化学适配体传感器用于实际样品中的目标物检测(测定方法参照实施例2)，进行回收率实验。
(1)采用实施例1制备的光电化学适配体传感器分别检测湘江水和牛奶中氯霉素的浓度，具体步骤为：将不同样品经过滤等预处理后，取上清液用Tris-Hcl缓冲溶液调节pH至7.4。样品(含有氯霉素)中目标物质的浓度参照表1，最后将实施例1的光电化学适配体传感器按照实施例2的方法检测待测溶液中的氯霉素，测定结果列于表1中。
表1待测溶液的回收率验证结果
Figure BDA0002186675320000111
Figure BDA0002186675320000121
从表1中可以看出，本发明的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器在可测定的浓度范围内，回收率基本在98.40％～101.90％之间，测定结果理想，相比传统的检测技术，采用本发明光电化学适配体传感器的检测方法操作简单快速。由表1可知，本发明的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器可用于检测水体中的氯霉素，能够获得较好的检测精度。
实施例4
评估实施例1的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的抗干扰能力，现用实施例1中的光电化学适配体传感器对浓度为100pM的氯霉素溶液、100pM氯霉素分别与1nM的卡那霉素、土霉素、链霉素、氧氟沙星的混合溶液、以及100pM氯霉素和1nM上述各种干扰抗生素的总混合溶液进行光电流测定(测定方法参照实施例2和实施例3)，分别编号为A、B、C、D、E和F，检测结果如图6所示。
图6为本实施例中光电化学适配体传感器检测不同抗生素时对应的光电流响应图。由图6可知，本发明的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器对氯霉素有较好的光电流响应，加入其它干扰抗生素光电流响应几乎不发生变化，这说明本发明的光电化学适配体传感器具有较好的抗干扰能力。
实施例5
评估实施例1的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的稳定性，将实施例1的光电化学适配体传感器在连续开/关光源条件下进行400s的光电流测定，测试结果如图7所示。由图7可知，在这期间响应的光电流几乎没有发生明显变化。另外，将光电化学适配体传感器置于4℃冰箱中2个星期重新测试，对比于最初检测氯霉素的光电流响应值仍有94％，说明本发明的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器稳定性好、使用寿命长。
由上述检测结果表明，本发明的基于PtNi纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器具有稳定性好、使用寿命长、检测范围宽、检测极限低、抗干扰能力强等优点。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(40)
<223> 根据实验要求而设计，以作为双链DNA识别探针中核酸适配体的核苷酸序列
<400> 1
acttcagtga gttgtcccac ggtcggcgag tcggtggtag 40
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> 根据实验要求而设计，以作为双链DNA识别探针中互补DNA的核苷酸序列
<400> 1
ctaccaccga ctcgc 15

Claims (10)

1.一种基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器，包括三电极系统中用作工作电极的导电玻璃电极，其特征在于，所述导电玻璃电极的反应端表面修饰有苯环掺杂氮化碳纳米片，所述苯环掺杂氮化碳纳米片表面共价交联有双链DNA识别探针，所述双链DNA识别探针结合有PtNi纳米酶信号探针，所述PtNi纳米酶信号探针主要由PtNi纳米线组成；
所述双链DNA识别探针由核酸适配体和互补DNA杂化构成，所述PtNi纳米酶信号探针结合于所述核酸适配体上；
所述PtNi纳米线为超细PtNi纳米线，所述超细PtNi纳米线的平均直径为1nm～5nm。
2.根据权利要求1所述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器，其特征在于，所述核酸适配体上修饰有生物素，所述PtNi纳米线为链霉亲和素杂化的PtNi纳米线；
和/或，所述导电玻璃电极为氟掺杂二氧化锡导电玻璃电极。
3.根据权利要求2所述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器，其特征在于，所述核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述互补DNA具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
4.一种如权利要求1～3中任一项所述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备苯环掺杂氮化碳纳米片；
(2)将苯环掺杂氮化碳纳米片分散制成苯环掺杂氮化碳纳米片悬浮液，然后涂覆于导电玻璃电极的反应端表面，得到苯环掺杂氮化碳纳米片修饰的导电玻璃电极；
(3)将互补DNA溶液滴加到步骤(2)所得苯环掺杂氮化碳纳米片修饰的导电玻璃电极进行反应，使互补DNA与苯环掺杂氮化碳纳米片共价交联，然后将反应后的导电玻璃电极采用牛血清蛋白溶液进行培养，再将核酸适配体溶液滴加到培养后的导电玻璃电极表面，使核酸适配体与互补DNA进行杂交反应，形成双链DNA识别探针，得到双链DNA识别探针和苯环掺杂氮化碳纳米片修饰的导电玻璃电极；
(4)将PtNi纳米酶悬浮液滴加到步骤(3)所得双链DNA识别探针和苯环掺杂氮化碳纳米片修饰的导电玻璃电极表面进行反应，使PtNi纳米酶被导入导电玻璃电极中并作为信号探针，得到基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器。
5.根据权利要求4所述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述苯环掺杂氮化碳纳米片主要由以下方法制备得到：
(1.1)将尿素和双酚S混合均匀，得到混合物，尿素和双酚S的质量比为500～1000∶1；
(1.2)将步骤(1.1)得到的混合物加热升温至530℃～550℃，焙烧4h～6h，得到苯环掺杂氮化碳粉体；
(1.3)将步骤(1.2)得到的苯环掺杂氮化碳粉体升温至500℃～520℃，焙烧1h～2h，得到苯环掺杂氮化碳纳米片。
6.根据权利要求4或5所述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述苯环掺杂氮化碳纳米片悬浮液中苯环掺杂氮化碳纳米片的浓度为2mg/mL～10mg/mL；
和/或，所述步骤(2)中，所述苯环掺杂氮化碳纳米片分散至全氟磺酸溶液中得到苯环掺杂氮化碳纳米片悬浮液；
和/或，所述步骤(3)中，所述互补DNA溶液的浓度为0.5μM～1μM，所述牛血清蛋白溶液的浓度为0.5wt％～1wt％，所述核酸适配体的浓度为0.5μM～1μM；
和/或，所述步骤(4)中，所述PtNi纳米酶悬浮液由PtNi纳米酶分散于缓冲溶液中得到，所述PtNi纳米酶主要由PtNi纳米线和链霉亲和素杂化构成；所述PtNi纳米酶悬浮液的浓度为0.5mg/mL～1mg/mL。
7.根据权利要求6所述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述PtNi纳米线为超细PtNi纳米线，主要由以下方法制备得到：
将乙酰丙酮铂、乙酰丙酮镍和十六烷基三甲基溴化铵加入到液体油胺中，乙酰丙酮铂、乙酰丙酮镍、十六烷基三甲基溴化铵、液体油胺的比例为20mg～30mg∶10mg～15mg∶70mg～80mg∶5mL～10mL，在150℃～170℃下反应1h～2h，得到超细PtNi纳米线。
8.一种如权利要求1～3中任一项所述的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器或者如权利要求4～7中任一项所述的制备方法制得的基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器在检测抗生素中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：将不同浓度的抗生素溶液滴加到基于纳米酶信号放大的光电化学适配体传感器中的导电玻璃电极的反应端进行反应，使光电化学适配体传感器中的识别探针对抗生素进行特异性识别，将特异性识别后的导电玻璃电极在含有过氧化氢和4-氯-1-萘酚的溶液中培养，再将培养后的导电玻璃电极作为工作电极，建立三电极系统，将三电极系统与电化学工作站连接，采用计时电流法在间歇光照下进行测试，根据抗生素浓度与光电流变化关系构建检测线性回归方程，根据检测线性回归方程计算待测溶液中抗生素的浓度。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗生素为氯霉素，所述双链DNA识别探针由特异性识别氯霉素的核酸适配体和互补DNA组成，所述核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述互补DNA具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述过氧化氢的浓度为0.1mM～0.2mM，所述4-氯-1-萘酚溶液的浓度为1mM～1.5mM；所述氯霉素浓度与光电流变化关系的检测线性回归方程为：
I(nA)＝0.085 lg CCPA(pM)+0.186 (1)
式(1)中，I表示对应光电流值，单位为nA；CCPA为待测溶液中氯霉素的浓度，单位为pM，式(1)的相关系数R2＝0.9976，氯霉素检测线性范围为0.1pM～100nM，检测限为26fM。
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