CN104880498A - 用于卡那霉素a检测的核酸适配体电化学传感器和制作及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于信号探针链取代反应的卡那霉素A核酸适配体电化学传感器和的制作及其应用方法。SD-EAB由一个巯基修饰的捕获探针(核酸适配体或短互补链)和一个与捕获探针互补杂交的，具有氧化还原标记的信号探针(短互补链或核酸适配体)组成。当卡那霉素A存在的时候，信号探针被取代并从电极表面释放，从而导致了电流的降低，电流的下降值与卡那霉素A浓度的对数成正比。本发明的信号传导仅仅是由于靶分子与短互补链与核酸适配体的亲和竞争引起的，与核酸适配体的构象状态不相关，从而大大提高了它的通用性。SD-EAB具有灵敏度高、特异性好、动力学区间宽、无需额外添加试剂和抗干扰能力强的优点。
Description
技术领域
本发明涉及用于卡那霉素A检测的基于信号探针链取代的核酸适配体电化学传感器(SD-EAB)和制作及其应用方法，属于生物分析技术领域。
背景技术
核酸适配体(Aptamer)是通过体外筛选获得的DNA(脱氧核糖核酸)或者RNA(核糖核酸)序列，能够与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，与抗体相比具有能够人工合成、稳定性好、方便化学修饰和工程设计等多种优势，因此在生物传感器领域具有很好的应用前景。
抗生素类药物在治疗感染性疾病方面发挥着极其重要的作用,但由于近些年来严重滥用,导致动物性食品的抗生素残留问题突出。这些残留的抗生素会在人体内蓄积,致使人体产生耐药菌株,或因大量蓄积而对机体产生毒害作用。2014年，世卫组织的一份新报告首次报道了全球的抗菌素耐药情况，其中包括抗生素的耐药性，表明这种严重的威胁不再是对未来的一种预测，而是目前世界上所有地区正在发生，有潜力影响每个人的，无论其年龄或国籍。当细菌发生变异时，抗生素对需要用这种药物治疗感染的人们不再有效，就称之为抗生素的耐药，现在这种情况已对公共卫生构成重大威胁。由于形势严峻，多个国家已经提出相关规定，食品与环境中抗生素残留的检测方法也得到发展。高效液相色谱、毛细管电泳等色谱分析法以及免疫测定的方法，尤其是酶联免疫吸附分析是定量检测和筛选抗生素使用最广泛的方法。其中色谱方法需要精密的仪器、有经验的实验人员、耗时长并且不适于现场检测。免疫测定的方法操作方便、灵敏度高、高特异性和耗时短的特性优于仪器测量的方法，以卡那霉素A为例，免疫方法可以检测到纳摩尔级的卡那霉素A。然而，免疫方法需要昂贵的抗体并且受到保质期的限制。因此，非常需要能够用于食品及环境中的抗生素快速、低廉现场检测的技术。
抗生素通常可根据作用机制、分子结构及光谱活性进行分类。卡那霉素A类属于氨基糖苷类抗生素，此类抗生素是目前使用最为广泛的抗生素，可影响细菌蛋白质合成的全过程，妨碍初始复合物的合成，诱导细菌合成错误蛋白以及阻抑已合成蛋白的释放，从而导致细菌死亡。抗生素滥用会导致严重的副作用，包括损失听力和损害肾脏。欧共体规定组织及牛奶中卡那霉素的最大残余限量为：牛奶0.15μg/g(318.5nM),肉类0.1μg/g,肝脏0.6μg/g,肾脏2.5μg/g。随着卡那霉素A核酸适配体的发现，基于核酸适配体的卡那霉素生物传感技术陆续被报道，其中包括比色传感器(Anal.Biochem.2011,415,175)、荧光传感器(Sens.Actuators,B2013,177,487)、电化学传感器(Eur.Food Res.Technol.2014,239,227)。然而，这些传感器的一些缺点限制了其实际应用，如灵敏度低，动力学区间窄，复杂的制备过程或者需要酶反应进行信号放大。
靶标诱导链取代是核酸传感器中应用最为广泛的信号传导方法，在荧光、比色、电化学检测蛋白质、离子、小分子中被广泛应用。在这些传感器中，短的互补DNA序列与DNA适配体杂交，靶标能够与适配体特异性结合，取代了其中的互补链，导致相应的信号变化，据此可以对靶标进行定量。在这些方法当中，电化学核酸类传感器由于其拥有许多可应用于现场检测所需的属性：如操作简单、灵敏度高、便于携带和低成本等，受到了广泛的关注。如Xiao课题组(J.Am.Chem.Soc.2005,127,17990)，第一次报道了靶标引发链取代诱导信号增加的电化学核酸传感器检测凝血酶，核酸适配体与电极相连，凝血酶适配体与标记有亚甲基蓝的寡核苷酸链部分杂交于有标记的一端，凝血酶与适配体结合引起亚甲基蓝修饰寡核苷酸链接近电极表面引起电流的增加。Fan课题组(J.Am.Chem.Soc.2007,129,1042)，更进一步简化了探针设计，他们设计两端分别标记有巯基及二茂铁的双重标记的三磷酸腺苷(ATP)核酸适配体在金电极表面自组装，而后其互补链与核酸适配体杂交形成刚性结构限制二茂铁与电极间的电子转移，形成了靶标响应式电化学核酸适配体开关。ATP与核酸适配体结合，释放出互补链，导致结构开关从复合物变成折叠结构，二茂铁基团靠近电极表面引起电流信号升高。此方法成功检测到了nM级的ATP。Willner课题组(J.Am.Chem.Soc.2006,128,13666)和Dong课题组(Chem.Commun.(Camb)2007,3780)分别报道了两种无标记链取代的电化学阻抗方法(EIS-AB)检测ATP的方法，探 针设计更为简单。Willner课题组将核酸适配体用巯基对其进行标记用作捕获探针，修饰到电极表面，设计较短互补序列作为信号探针与捕获探针杂交于电极表面。双链DNA的形成，使电极表面形成一定量的负电荷。当靶分子存在时，发生链取代，核酸适配体在电极表面发生折叠，信号探针被释放，负电荷减少，其对电解质溶液中带有荷负电的氧化还原探针的排斥力下降，界面电子转移电阻下降。通过对阻抗下降值得测量可以用来定量ATP。Dong课题组在此基础上，对其进行了优化，他们将短的互补序列标记上巯基作捕获探针，核酸适配体作信号探针，当靶标存在时，发生链取代，信号探针携带靶分子被释放。较长的核酸适配体探针从电极表面释放使得其检测较Willner课题组传感器更为灵敏且有利于传感器再生。其信号变化不依赖于靶分子的尺寸及适配体的构象变化，在一些靶标的检测上具有潜在的优势。但由于电化学阻抗的检测方法本身具有一定的局限性，非特异性吸附会对检测结果产生影响，该方法对其他靶分子的耐受性有待考证。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于卡那霉素检测的SD-EAB和制作方法及其应用方法，以实现对卡那霉素A低成本、高灵敏、准确、快速的检测。本发明包含两种基于信号探针链取代的用于卡那霉素A检测的核酸适配体电化学传感器。探针设计如图1所示：巯基修饰卡那霉素A的核酸适配体探针(图1A)或巯基修饰的短互补探针(图1B)作为捕获探针通过Au-S键被固定在金电极表面。二茂铁修饰的短互补探针(图1A)或二茂铁修饰的卡那霉素A的核酸适配体探针(图1B)作为信号探针与捕获探针杂交形成双链。二茂铁基团接近电极表面，从而能够有效地与电极表面发生电子交换产生高电流。当卡那霉素A存在时，由于卡那霉素A同短互补探针竞相与核酸适配体结合，信号探针被替代，远离电极表面，通过电化学方波伏安扫描测定其电流信号下降，由此可定量卡那霉素A的浓度。
本发明的SD-EAB设计简单，通用性强。与现有技术相比，具有很多优势。与靶标应答式电化学核酸适配体开关型传感器相比，本发明的SD-EAB的信号变化只由于靶分子与短互补链与核酸适配体的亲和竞争引起的，与核酸适配体和靶标结合前后的构象变化无关。而靶标应答式电化学核酸适配体开关型传感器 的信号变化往往高度依赖于核酸适配体与靶标结合前后的构象变化，其构象变化决定氧化还原基团与电极之间的距离，距离上很小的增加便可引起电子交换速率数量级上的减少，因此严重干扰传感器的灵敏度。靶标应答式电化学核酸适配体开关中，为保证靶标作用前，氧化还原基团是远离电极表面的，必须小心的在核酸适配体上选择一部分与互补链杂交，当适配体过长时，则需在核酸适配体内部标记上氧化还原基团。核酸适配体的内部标记可能会强烈影响核酸适配体与靶标的亲和力，而SD-EAB可以有效的避免这些问题。与基于链取代的核酸适配体电化学阻抗法(EIS-AB)相比，SD-EAB对方波伏安电流进行扫描，信号变化是由链取代发生后氧化还原基团与电极物理分离所引起，靶标及其他污染物的非特异性吸附影响不大，所以此传感器极为灵敏。相比之下，EIS-AB则会因为受到靶标及其他污染物的非特异性吸附导致干扰极强。
本发明中用于卡那霉素检测的SD-EAB的制作方法包括如下步骤：
(1)金电极的清洁
用超纯水冲洗金圆盘电极(直径为2mm)，依次用1μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉抛光电极表面(在抛光布上加少量超纯水和固体粉末打磨5-10分钟)，每次打磨后用超纯水冲洗后，在超纯水中超声5分钟，再进行下一个打磨步骤。打磨光滑的电极在多通道电位仪在0.5M H2SO4中以-0.4～1.2V范围以100mV/s作循环伏安扫描35圈，以饱和硫酸亚汞电极为参比电极，铂电极为对电极，直到循环伏安图基本稳定。如观察不到明显的金的氧化还原峰，重新上述步骤打磨金电极再进行活化。
(2)化学修饰的捕获探针固定在金电极的表面上
1μM末端巯基修饰的捕获探针(A-SH或C-SH，表1)在100μM三[2-羧乙基]膦(TCEP),缓冲液A(10mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl,5mM MgCl2,pH 7.0)中室温还原1小时。将干净的金电极浸入还原液，置于37℃，过夜反应。用缓冲液B(10mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl,pH 7.0)冲洗三遍，后放入2mM巯基己醇(MCH)中37℃封闭1小时。用缓冲液B冲洗三遍，备用。
(3)信号探针与捕获探针的杂交
标记二茂铁的寡核苷酸互补链用缓冲液A稀释成0.5μM，将组装好捕获探针的金电极浸泡其中，37℃孵育2小时，用缓冲液B冲洗三次。制得的传感器 在杂交液中4℃保存，备用。
本发明中SD-EAB检测卡那霉素A时的应用方法包括如下步骤：
用缓冲液A稀释成一定浓度的卡那霉素A，将组装好的金电极浸泡于其中，37℃，反应30min。缓冲液B洗三次。用带SWV分析方法的恒电位仪扫描并分析结果。
本发明的SD-EAB的制作方法及其应用方法，具有如下的技术效果：
1、本发明的SD-EAB的制作方法简单、易行。
2、应用本发的SD-EAB检测卡那霉素A时，操作简单，无需额外添加试剂，可以实现一步检测。
3、本发明的SD-EAB性能优良。比现有卡那霉素A的核酸适配体传感器具有跟高的灵敏度，更宽的动力学区间和更好的选择性。其对卡那霉素A的检测具有超宽的动力学区间，范围跨越7个数量级；信号非常灵敏，检出限可达到1nM；对于其类似物及其它抗生素具有很好的选择性，特别是首次实现对其类似物卡那霉素B的选择性检测，SD-EAB在卡那霉素A存在时电流降低，而在卡那霉素B存在时电流增加。
4、应用本发明可实现对真实湖水样品中卡那霉素A的测定，获得了很好的灵敏度曲线及工作曲线。此无试剂化、即用型核酸传感器的动力学范围已经囊括了抗生素最低限量及常见浓度范围，在现场检测方面具有非常重要的应用前景，具有实用价值。
5、与EIS-AB相比，本发明利用信号探针与电极的物理分离实现信号的检测，对非特异性吸附所引起的干扰有更好的耐受性，在灵敏度及选择性上均表现出了更优异的性能。EIS-AB的检测灵敏度仅为1μM，并且动态范围比较窄(1-100μM)。
6、与靶标应答式电化学适配体开关型传感器相比，本发明SD-EAB信号变化由于靶分子与短互补链与核酸适配体的亲和竞争引起的，与核酸适配体的构象状态不相关。而靶标应答式电化学核酸适配体开关型传感器的信号变化往往高度依赖于核酸适配体与靶标结合前后的构象变化，其构象变化决定氧化还原基团与电极之间的距离，距离上很小的增加便可引起电子交换速率数量级上的减少，因此严重干扰传感器的灵敏度。靶标应答式电化学核酸适配体开关中， 为保证靶标作用前，氧化还原基团是远离电极表面的，必须小心的在核酸适配体上选择一部分与互补链杂交，当适配体过长时，则需在核酸适配体内部标记上氧化还原基团。核酸适配体的内部标记可能会强烈影响核酸适配体与靶标的亲和力，而SD-EAB可以有效的避免这些问题，使其具有更强的通用性。
附图说明
图1A-图1B是SD-EAB制备和检测卡那霉素A的原理图。
图2A-图2B是本发明实施例中SD-EAB A(A)和SD-EAB B(B)分别检测卡那霉素A的SWV灵敏度曲线(左)及标准曲线(右)。
图3是本发明实施例中SD-EAB A靶标选择性的测试结果。所测试的抗生素分别是卡那霉素A(Kan A)、卡那霉素B(Kan B)、氨苄青霉素(Amp)、磺胺地索辛(Sul)、四环素(Tet)。
图4A-图4B是本发明SD-EAB A对真实湖水(颐和园湖水)样品中标准添加的卡那霉素A进行检测的SWV曲线(A)和工作曲线(B)。
图5A-图5B是与本发明探针设计和制备方法(两步法)一致的EIS-AB A(A)和EIS-AB B(B)分别检测卡那霉素A的阻抗谱。
图6A-图6B是与本发明探针设计一致，一步法制备的EIS-AB A′(A)和EIS-AB B′(B)分别检测卡那霉素A的阻抗谱。
具体实施方式
表1：本发明中使用的核酸探针序列。
Fc:二茂铁
实施例1:用于卡那霉素A检测的SD-EAB A和B的两步法制备。
SD-EAB A(图1A)的制备：1μM捕获探针1(A-SH)与100μM TCEP在缓冲液A(10mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl,5mM MgCl2,pH 7.0)中混匀，静置还原1小时。将洁净的电极浸入还原液，置于37℃，反应过夜。用缓冲液B(10mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl,pH 7.0)冲洗三遍，后放入2mM MCH中37℃封闭1小时。用缓冲液B冲洗三遍后，将其浸入含有0.5μM信号探针2(C-Fc)的缓冲液A中37℃孵育2小时，用缓冲液B冲洗三遍。制得的传感器在4℃下保存于杂交液中备用。
SD-EAB B(图1B)的制备：将上述捕获探针1(A-SH)换成捕获探针3(C-SH)，上述信号探针2(C-Fc)换成信号探针4(A-Fc)，其他步骤与制备SD-EAB A的方法一致。
实施例2:利用SD-EAB A和SD-EAB B分别检测不同浓度的卡那霉素。
使用电化学设备对两种传感器进行方波伏安扫描，对0.2V附近二茂铁对应的氧化峰进行测定，随着卡那霉素A浓度的增加，峰电流逐渐降低，实现对不同浓度卡那霉素A的检测。分别用SD-EAB A和SD-EAB B检测卡那霉素A。得到结果如图2所示，本发明中SD-EAB A传感器动力学区间为1nM到10mM，比现有报道中的卡那霉素A传感器的动力学区间宽2-5个数量级。卡那霉素A浓度对数与对应电流变化在1nM到100μM范围内呈良好的线性关系，相关系 数为0.996，检出限为1nM，比报道过的其他基于核酸适配体的卡那霉素A传感器灵敏5-10倍，与被用作标准方法的免疫及谱法相当。而SD-EAB B的检出限为0.5μM(图2B),比SD-EAB A差500倍，在卡那霉素A浓度范围为0.5μM-10mM时，其对数与对应电流变化之间的关系为非线性关系。SD-EAB A在灵敏度及工作曲线的线性关系上来讲都比SD-EAB B好。
实施例3:对本发明中SD-EAB A进行靶标选择性测定。
使用与卡那霉素A有相似或完全不同化学结构的抗生素以相同方法用SD-EAB A进行测试。SD-EAB A对卡那霉素A的结构类似物(卡那霉素B)及其他类型的抗生素包括氨苄青霉素,磺胺地索辛、四环素均具有优良的选择性。当所测抗生素的浓度为100μM时，相应的电流信号下降分别是：卡那霉素A 51.2％、磺胺地索辛0±9.4％、四环素2.2±6.8％。卡那霉素B和氨苄青霉素的存在时，检测到电流信号增加，对应电流信号分别上升9.8±1.0％和6.6±1.6％。即使在高浓度(1mM)下，SD-EAB对卡那霉素A仍具有高度的特异性识别。
SD-EAB A与卡那霉素A及其结构类似物卡那霉素B作用时，展示出完全相反的信号变化，可以很容易地将二者区分开来,这点很神奇，这在已有卡那霉素传感器中从未报道。经推断,这种特殊变化可能由以下两个因素引起。第一，短的互补探针占据核酸适配体中与卡那霉素结合的位点，有利于改善传感器的选择性。SD-EAB A所选用21个碱基的核酸适配体与卡那霉素A结合的离解常数为78.8nM，与其结构类似物卡那霉素B结合的离解常数为84.5nM，二者相比，核酸适配体与卡那霉素A具有更高的亲和力。核酸适配体与短互补探针杂交，自由能降低，从而使其亲和力的差异放大。第二,氨基苷类抗生素在电极表面的非特定吸附可以加速电子传递速率，使电活性增加从而导致电流升高。基于这两个特殊原因,SD-EAB A具有高度的选择性,能够将卡那霉素A与卡那霉素B区分开。
实施例4：应用SD-EAB A检测添加在湖水中的卡那霉素A。
卡那霉素A为常见抗生素，其水溶性好，容易造成水体污染。因此，传感器如能检测真实水样本中的卡那霉素A含量，将能在环境和食品样本中得到广泛应用，具有重要意义。因此我们选择真实湖水(颐和园湖水)样品进行检测。 结果如图4所示，卡那霉素A浓度范围为1nM-10mM时，其浓度对数与电流信号减少百分比呈线性关系，相关系数为0.994。所得工作曲线与图2A所得工作曲线相比，湖水中不同浓度卡那霉素A的信号下降百分比均略小于其在去离子水中的信号下降百分比，其工作曲线斜率非常接近。结果表明SD-EAB A传感器在实际样品检测中具有很好的潜在应用价值。
实施例5:用于卡那霉素A检测的EIS-AB A和B的两步法制备。
EIS-AB A的制备：1μM捕获探针1(A-SH)与100μM TCEP在缓冲液A(10mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl,5mM MgCl2,pH 7.0)中混匀，静置还原1小时。将洁净的电极浸入还原液，置于37℃，反应过夜。用缓冲液B(10mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl,pH 7.0)冲洗三遍，后放入2mM MCH中37℃封闭1小时。用缓冲液B冲洗三遍后，将其浸入含有0.5μM信号探针5(C)的缓冲液A中37℃孵育2小时，用缓冲液B冲洗三遍。制得的传感器在4℃下保存于杂交液中备用。
EIS-AB B的制备：将上述捕获探针1(A-SH)换成捕获探针3(C-SH)，上述信号探针5(C)换成信号探针6(A)，其他步骤与制备EIS-AB A的方法一致。
实施例6:用于卡那霉素A检测的EIS-AB A和B的一步法制备。
为保证电极表面达到高的杂交效率，实验中还采用一步法自组装制备得到EIS-AB A’及EIS-AB B’。一步法自组装即提前对核酸探针进行预处理，是核酸探针形成双链DNA复合物，对EIS-AB A’来说，将捕获探针1同信号探针5以1:5的比例在缓冲液A中混匀，95℃水浴10min后，缓慢冷却至室温，目的使捕获探针全部形成双链，以达到电极表面接近100％的双链杂交率。随后进行巯基还原、37℃过夜组装、MCH封闭等步骤。条件与SD-EAB传感器的制备相同。EIS传感器制备完成后置于缓冲液A中4℃备用。
实施例7：本发明SD-EAB与EIS-AB对卡那霉素A检测的直接对比。
为了与本发明SD-EAB A和B进行直接对比，我们首先分别构建了与SD-EAB探针和制备方法完全一致的EIS-AB A和EIS-AB B，分别用于卡那霉素A的。结果如图5所示，EIS-AB A和EIS-AB B在不同浓度卡那霉素A存在时，其阻抗谱均 出现重叠或随机的阻抗谱变化，无法定量卡那霉素A。
为保证电极表面达到高的杂交效率和降低探针密度，我们进一步采用一步法自组装制备得到EIS-AB A′及EIS-AB B′。与报道过的ATP电化学阻抗核酸传感器(J.Am.Chem.Soc.2006,128,13666，Chem.Commun.(Camb)2007,3780)结果类似，以较长的核酸适配体链作为信号探针的EIS-AB B′比以较短的互补链作为信号探针的EIS-AB A′相比更为灵敏。其中，EIS-AB A′在不同浓度卡那霉素A存在时，其阻抗谱出现重叠或随机的阻抗谱变化(图6A)，无法定量卡那霉素A。EIS-AB B′可以定量检测卡那霉素A，检出限为1μM，动力学区间为1到100μM(图6B)。我们认为两个传感器性能的差异主要由以下两种因素引起。首先，信号探针的释放会引起阻抗值减小，这使得以较长链为信号探针而被取代的EIS-AB B′在检测中会有更大的阻抗减小。其次，在检测条件下，卡那霉素A带正电，卡那霉素A会引起较强非特异性吸附，这种特异性吸附在电化学检测中表现为阻抗增加，使得传感器动力学区间较窄，灵敏度变差。且电极表面DNA探针密度越高，非特异性吸附越强。对传感器EIS-AB A和EIS-AB B来说，电极表面DNA探针密度较EIS-AB A′和EIS-AB B′高，因而卡那霉素A引起的非特异性吸附更强，因而无法实现对卡那霉素A的定量检测。显然，SD-EAB传感器与EIS-AB传感器相比，对非特异性吸附所引起的干扰有更好的耐受性，在灵敏度及选择性上均表现出了更优异的性能。
Claims (6)
1.一种用于卡那霉素A检测的核酸适配体电化学传感器，是包含两种基于信号探针链取代的用于卡那霉素A检测的核酸适配体电化学传感器，巯基修饰卡那霉素A的核酸适配体探针(图1A)或巯基修饰的短互补探针(图1B)作为捕获探针通过Au-S键被固定在金电极表面，二茂铁修饰的短互补探针(图1A)或二茂铁修饰的卡那霉素A的核酸适配体探针(图1B)作为信号探针与捕获探针杂交形成双链，二茂铁基团接近电极表面，从而能够有效地与电极表面发生电子交换产生高电流。
2.一种用于卡那霉素检测的核酸适配体电化学传感器的制作方法，包括如下步骤，第一步骤为金电极的清洁；第二步骤为化学修饰的捕获探针固定在金电极的表面上；第一步骤为化学修饰的捕获探针固定在金电极的表面上。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，第一步骤如下：用超纯水冲洗金圆盘电极(直径为2mm)，依次用1μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉抛光电极表面(在抛光布上加少量超纯水和固体粉末打磨5-10分钟)，每次打磨后用超纯水冲洗后，在超纯水中超声5分钟，再进行下一个打磨步骤，打磨光滑的电极在多通道电位仪在0.5M H2SO4中以-0.4～1.2V范围以100mV/s作循环伏安扫描35圈，以饱和硫酸亚汞电极为参比电极，铂电极为对电极，直到循环伏安图基本稳定，如观察不到明显的金的氧化还原峰，重新上述步骤打磨金电极再进行活化。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，第二步骤如下：1μM末端巯基修饰的捕获探针(A-SH或C-SH，表1)在100μM三[2-羧乙基]膦(TCEP),缓冲液A(10mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl,5mM MgCl2,pH 7.0)中室温还原1小时，将干净的金电极浸入还原液，置于37℃，过夜反应。用缓冲液B(10mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl,pH 7.0)冲洗三遍，后放入2mM巯基己醇(MCH)中37℃封闭1小时，用缓冲液B冲洗三遍，备用。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，第三步骤如下：标记二茂铁的寡核苷酸互补链用缓冲液A稀释成0.5μM，将组装好捕获探针的金电极浸泡其中，37℃孵育2小时，用缓冲液B冲洗三次，制得的传感器在杂交液中4℃保存，备用。
6.一种利用权利要求1或2中的核酸适配体电化学传感器检测卡那霉素A时的应用方法，包括如下步骤：
用缓冲液A稀释成一定浓度的卡那霉素A，将组装好的金电极浸泡于其中，37℃，反应30min，缓冲液B洗三次，用带SWV分析方法的恒电位仪扫描并分析结果。
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