CN102778492B - 一种用于汞离子检测的电化学传感器及其制作方法和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于寡核苷酸链的汞离子电化学传感器及其制作和检测方法，属于生物分析技术领域。该传感器的制作方法为将化学修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链固定在金电极上；将固定有全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链的金电极浸泡到含有全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链的杂交液中。本发明利用了Hg2+能特异性地与两条相邻全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链上的T碱基共价结合，形成稳定的分子间T-Hg2+-T结构，进而诱导与全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链杂交的互补链全腺嘌呤(A)寡核苷酸链的释放。汞离子会导致互补链的释放，使电化学信号降低，从而实现对汞离子的电化学检测。本发明大幅提高了检测灵敏度，具有很好的离子选择性。

Description

一种用于汞离子检测的电化学传感器及其制作方法和检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于寡核苷酸链的汞离子电化学传感器制作及其应用方法，属于生物分析技术领域。
背景技术
汞是高毒的全球性环境污染物，尤其是其具有高迁移性、持久性、甲基化作用性、生物富集性及食物链放大性的特点，即便是极微量的存在于环境中，对动植物及人类的健康也是极大的威胁。全世界的汞一年的排放量约1.5万吨，主要来源于汞矿、冶金、氯碱工业、电器工业和矿物燃料的燃烧。汞以多种形式存在与环境中，水溶性的二价汞离子(Hg2+)是汞污染最常见和最稳定的形式之一。
如何有效地进行环境中汞离子含量的测定，仍是广大分析工作者面临的挑战。目前传统的汞离子检测方法主要有：原子(吸收，发射，荧光)光谱法及电感耦合等离子质谱仪(Inductively coupled plasmamass spectrometry，ICP-MS)。尽管能够得到比较精确的检测结果，但这些方法依赖大型仪器设备、耗费耗时、需进行样品预处理，需要专门的技术人员进行操作，检测成本高，很难满足现场快速检测的要求。因此，迫切需要更加简便、快速、经济、准确的可以用于现场分析检测汞离子的方法。而目前国内外对汞离子进行现场检测的方法还不多，多数在灵敏度和专一性上不能够满足要求。
近来的研究表明，汞离子能特异性地与两个胸腺嘧啶碱基(T)共价结合形成稳定的T-Hg2+-T结构。基于汞离子的这一特殊的性质，已发展了各种Hg2+检测方法：如荧光法(A.Ono，H.Togashi，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2004，43，4300.)、纳米金聚集比色法(J.S.Lee，M.S.Han，C.A.Mirkin，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2007，46，4093.)，生物芯片法(J.S.Lee，C.A.Mirkin，，Anal.Chem.2008，80，6805.)等。这些方法普遍具有选择性好、特异性强等特点，但检测灵敏度普遍不高，操作繁琐，且多不适合现场检测。
电化学DNA传感器是近几年迅速发展起来的一种生物传感器，这种传感器以功能性的核酸链为识别分子，通过靶标存在时电信号的特征性变化来实现对靶标的检测。其主要特点是灵敏度高、响应快、操作简单和便携式，非常适合现场检测。汞离子的电化学DNA传感技术近些年来也有报道：如基于酶反应放大信号的电化学DNA传感器(Zhang，Z.；Tang，A.；Liao，S.；Chen，P.；Wu，Z.；Shen，G.；Yu，R.Biosens.Bioelectron.2011，26，3320-4.)基于结构转换的电化学DNA传感器(Wu，D.；Zhang，Q.；Chu，X.；Wang，H.；Shen，G.；Yu，R.Biosens.Bioelectron.2010，25，1025-1031.)和基于形成网状结构的电化学DNA传感器(Tang，X.；Liu，H.；Zou，B.；Tian，D.；Huang，H.Analyst 2012，137，309-11.)。这些传感器在灵敏度和选择性上有了很大的提高，但这些方法大多在检测时还需额外添加试剂，并不是一步检测的简单方法，灵敏度不够高或者检测范围窄。
发明内容
本发明的目的在于结合汞离子能特异性地与两个胸腺嘧啶碱基(T)共价结合形成稳定的T-Hg2+-T结构的这一特性以及电化学DNA传感器的优点，提供一种基于寡核苷酸链的Hg2+检测电化学传感器及其制作方法和检测方法，以实现对Hg2+低成本、高灵敏、准确、快速的检测。
为了实现上述目的，本发明的第一方面是提供一种用于汞离子检测的电化学传感器，其中，该传感器为一种金电极，该金电极具有固定在其上的化学修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链及与该全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链互补的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链。
进一步，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链固定在该金电极的表面上，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链为标记二茂铁的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链。
进一步，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链包被到纳米金表面。
进一步，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链为探针A，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链为探针B，其中所述探针A为5’-SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTT-3’，所述探针B  为5’-Fc-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’。
进一步，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链为探针C，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链为探针D，其中所述探针C为5’-TTTTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-SH-3’，所述探针D  为5’-Fc-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-(CH2)6-SH-3’。
进一步，所述探针C的密度为1.0X1011-1.0X1013链/cm2。
本发明的第二方面是提供一种用于汞离子检测的电化学传感器的制作方法，其中，包括如下步骤：第一步骤：将化学修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链固定在金电极上；第二步骤：将固定有全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链的金电极浸泡到含有与该全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链互补的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链的杂交液中。
进一步，在第一步骤中，所述化学修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链固定在金电极的表面上，在第二步骤中，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链为标记二茂铁的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链。
进一步，在第二步骤中，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链包被到纳米金表面。
进一步，利用探针A和探针B制作该电化学传感器，其中所述探针A为5’-sH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTT-3’，所述探针B为5’-Fc-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’。
进一步，利用探针C和探针D制作该电化学传感器，其中所述探针C为5’-TTTTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-SH-3’，所述探针D为5’-Fc-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-(CH2)6-SH-3’。
进一步，在第一步骤中，1μM的末端巯基修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链在100μM三[2-羧乙基]膦(TCEP)，10mM Tris，1.0MNaCl，pH＝8.0中室温下还原1h，将未经修饰的干净的金电极浸泡到其中，室温下过夜自组装，组装后的电极用10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0冲洗两遍，然后将电极放到含1mM巯基己醇(MCH)的水溶液中封闭30分钟，再用10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0冲洗三遍，吹干备用；在第二步骤中，标记二茂铁的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链用杂交液1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4稀释成50nM，将组装好全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链的金电极浸泡到其中，25℃，反应3h，然后用1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4洗三次，从而得到该传感器。
进一步，在第一步骤中，1μM的末端巯基修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链在100μM三[2-羧乙基]膦(TCEP)，10mM Tris，1.0MNaCl，pH＝8.0中室温下还原1h，将未经修饰的干净的金电极浸泡到其中，室温下过夜自组装，组装后的电极用10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0冲洗两遍，然后将电极放到含1mM巯基己醇(MCH)的水溶液中封闭30分钟，再用10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0冲洗三遍，吹干备用；在第二步骤中，将标记二茂铁的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链互补的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链，溶入到50mM二硫苏糖醇(DTT)，2％三乙胺(TEA)的水溶液中，室温，反应20min。使用NAP-5column过柱纯化，然后通过在260nm处紫外可见吸收峰值对全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链定量，加入到粒径为13nm的9nM纳米金溶液使DNA链与纳米金摩尔比例为100∶1，在室温下静置老化16小时，老化后在分子杂交仪中振荡下分多次加入1M PB，1M NaCl，pH＝7.4使NaCl终浓度为0.3M，振荡16h后，9000rpm离心20min，10mM PB，pH＝7.4洗涤三次，制得包被了标记二茂铁的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链的纳米金，置于4℃下备用；该纳米金用杂交液1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4稀释成2nM，将组装好全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链的金电极浸泡到其中，25℃，反应3h，然后用1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4洗三次，从而得到该传感器。
进一步，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链为探针A，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链为探针B，其中所述探针A为5’-SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTT-3’，所述探针B为5’-Fc-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’。
进一步，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链为探针C，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链为探针D，其中所述探针C为5’-TTTTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-SH-3’，所述探针D  为5’-Fc-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-(CH2)6-SH-3’。
本发明的第三方面是提供一种使用前述的用于汞离子检测的电化学传感器的检测方法，其中，包括如下步骤：将电化学传感器浸泡在待测样品中，取出电化学传感器，用溶液清洗，用恒电位仪进行电化学检测。
进一步，将电化学传感器浸泡在待测样品中30min，用1/15M PB，0.1M NaCl，pH＝7.4的溶液清洗电化学传感器3次，用多通道恒电位仪进行电化学检测。
本发明是首次利用Hg2+可特异性地与两条相邻全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链上的T碱基共价结合，形成稳定的分子间T-Hg2+-T结构，进而诱导与全T寡核苷酸链杂交的互补链全腺嘌呤(A)寡核苷酸链的释放。由于利用了两条相邻全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链上的T碱基与汞离子的配位，大幅减小了探针的长度，减小了分子识别的空间位阻，提高了检测方法设计上的灵活性。具体的说，将合成的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链通过自组装固定在金电极上；然后二茂铁标记的全腺嘌呤(A)的互补链与固定在电极上的全T寡核苷酸链杂交，形成双链结构，即制备好Hg2+检测传感器；再浸入待测样品一段时间，检测电化学信号。若待测样品中含Hg2+时，则Hg2+能特异性地与全T寡核苷酸链上的T碱基共价结合，介导两条全T寡核苷酸链间形成稳定的分子间T-Hg2+-T结构，从而诱导带有二茂铁基团的全A互补链的释放，导致方波伏安(SWV)扫描时的二茂铁氧化峰峰值电流的减小。从而可以通过峰值电流的变化来定量分析汞离子的浓度。由于空间位阻的大幅减小，还可以用二茂铁修饰的全腺嘌呤(A)寡核苷酸链修饰的纳米金探针来替代二茂铁标记的全腺嘌呤(A)探针来大幅提高检测的灵敏度。
本发明基于寡核苷酸链的Hg2+检测电化学传感器的制作方法及其应用方法，具有如下的技术效果：
1、本发明基于寡核苷酸链的Hg2+检测传感器的制作方法简单、易行。2、本发明基于寡核苷酸链的Hg2+检测传感器具有检测灵敏度很高(10pM)、专一性高(对常见其它金属离子均无明显响应)、检测的浓度范围极宽(0.01nM-100μM)的优点。
3、应用本发明基于寡核苷酸链的Hg2+检测传感器检测Hg2+时，操作简单，无需额外添加试剂，可以实现一步检测。
4、由于利用了两条相邻全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链上的T碱基与汞离子的配位，与现有技术中使用分子内T-Hg2+-T配位不同，大幅减小了探针的长度，减小了分子识别的空间位阻，提高了检测方法设计上的灵活性。比如本发明中可以使用方便地使用纳米金探针来提高检测的灵敏度。
5、本发明提出的汞离子检测方法的电信号变化的百分比与全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链在电极上的密度密切相关，高探针密度下有利于相邻全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链上的T碱基与汞离子的配位，电信号变化的百分比显著高于低探针密度的情况。但是由于解链或其它因素造成的电化学信号的降低，具有不同密度的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链的传感器应该有类似的电信号变化。因此上述在相同汞离子浓度电信号变化的百分比受探针密度影响的现象可以用于排除汞离子检测时假阳性的情况，从而解决了信号减(turn-off)的电化学传感器可能出现假阳性的情况。
6、应用本发明检测的结果用普通的恒电位仪扫描及分析即可，不需要复杂昂贵的大型设备，有利于实现分析的微型化，使现场检测更方便、易行。
附图说明
图1(A)-图1(B)是金电极上基于寡核苷酸链电化学检测汞离子的原理图。
图2是本发明一个实施例中基于寡核苷酸链电化学检测1nM汞离子的时间动力学。纵坐标是扣除了基线电流值之后的峰值电流。
图3(A)-图3(B)是本发明一个实施例中基于寡核苷酸链电化学检测的传感器(基于方法A)检测Hg2+的SWV峰型图及标准曲线(0.1-100nM范围内R2＝0.999)。SWV峰型图中氧化峰对应的Hg2+浓度自上而下依次是：0，0.1nM，1nM，10nM，100nM，1μM，10μM，50μM，100μM。标准曲线的纵坐标是扣除了基线电流值之后的峰值电流。
图4(A)-图4(B)是本发明一个实施例中基于寡核苷酸链电化学检测的传感器检(基于方法B)测Hg2+SWV峰型图及标准曲线(R2＝0.99)。SWV峰型图中氧化峰对应的Hg2+浓度自上而下依次是：0，0.01nM，0.05nM，0.1nM，1nM，10nM，50nM，100nM，1μM，10μM，100μM。标准曲线的纵坐标是扣除了基线电流值之后的峰值电流。
图5(A)-图5(B)是本发明一个实施例中基于寡核苷酸链电化学检测的传感器(基于方法B)考察电极表面探针密度对其检测Hg2+的电信号输出的影响。图5(A)中a是全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链自组装30min构建的传感器对不同浓度Hg2+的峰值电流变化，b是全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链过夜自组装构建的传感器对不同浓度Hg2+的峰值电流变化。曲线的纵坐标是扣除了基线电流值之后的峰值电流。图5(B)中是全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链自组装30min构建的传感器对不同浓度Hg2+的电流信号减小的百分比，
Figure BDA00001886868100072
是全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链过夜自组装构建的传感器对不同浓度Hg2+的电流信号减小的百分比。
图6是本发明一个实施例中基于寡核苷酸链电化学检测的传感器(基于方法B)检测Hg2+和其他可能存在的干扰离子的结果。离子浓度是：Hg2+浓度分别100nM和1μM，(图中是10μM)其他离子浓度均为10μM。
具体实施方式
本发明的用于汞离子检测的电化学传感器为一种金电极，化学修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链固定在该金电极的表面上，同时，该金电极具有固定在其上的与该全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链互补的标记二茂铁的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链。所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链可以包被到纳米金表面。
为了制作上述用于汞离子检测的电化学传感器，有两种方法，第一种方法A包括两个步骤，其中第一步骤是：将化学修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链固定在金电极上，在该第一步骤中，所述化学修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链固定在金电极的表面上，即1μM的末端巯基修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链在100μM三[2-羧乙基]膦(TCEP)，10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0中室温下还原1h，将未经修饰的干净的金电极浸泡到其中，室温下过夜自组装。组装后的电极用10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0冲洗两遍，然后将电极放到含1mM巯基己醇(MCH)的水溶液中封闭30分钟，再用10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0冲洗三遍，吹干备用；第二步骤是：将固定有全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链的金电极浸泡到含有与该全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链互补的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链的杂交液中，即全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链与全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链的杂交，将标记二茂铁的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链用杂交液1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4稀释成50nM，将组装好全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链的金电极浸泡到其中，25℃，反应3h，然后用1/15M PB，0.3MNaCl，pH＝7.4洗三次，得到传感器。最好，得到的传感器使用前于4℃下保存。
制作上述用于汞离子检测的电化学传感器的第二种方法B如下：其包括两个步骤，其中第一步骤与上述第一种方法的第一步骤相同，是将化学修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链固定在金电极上，在该第一步骤中，所述化学修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链固定在金电极的表面上，即1μM的末端巯基修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链在100μM三[2-羧乙基]膦(TCEP)，10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0中室温下还原1h，将未经修饰的干净的金电极浸泡到其中，室温下过夜自组装。组装后的电极用10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0冲洗两遍，然后将电极放到含1mM巯基己醇(MCH)的水溶液中封闭30分钟，再用10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0冲洗三遍，吹干备用；第二步骤是将固定有全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链的金电极浸泡到含有与该全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链互补的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链的杂交液中，在第二步骤中，将标记二茂铁的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链互补的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链，溶入到50mM二硫苏糖醇(DTT)，2％三乙胺(TEA)的水溶液中，室温，反应20min。使用NAP-5column过柱纯化，然后通过在260nm处紫外可见吸收峰值对全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链定量，加入到粒径为13nm的9nM纳米金溶液使DNA链与纳米金摩尔比例为100∶1，在室温下静置老化16小时，老化后在分子杂交仪中振荡下分多次加入1M PB，1M NaCl，pH＝7.4使NaCl终浓度为0.3M，振荡16h后，9000rpm离心20min，10mM PB，pH＝7.4洗涤三次，制得包被了标记二茂铁的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链的纳米金，置于4℃下备用；该纳米金用杂交液1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4稀释成2nM，将组装好全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链的金电极浸泡到其中，25℃，反应3h，然后用1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4洗三次，从而得到传感器。最好，得到的传感器使用前于4℃下保存。
具体来说，前述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链为探针A，前述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链为探针B。前述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链也可以为探针C，前述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链为探针D。下面的表1为本发明中使用的核酸探针序列。
表1
  核酸探针名称   序列
  探针A   5’-SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTT-3’
  探针B   5’-Fc-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’
  探针C   5’-TTTTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-SH-3’
  探针D   5’-Fc-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-(CH2)6-SH-3’
在前述电化学传感器的制作方法中，可以利用探针A和探针B制作该电化学传感器，其中所述探针A为5’-sH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTT-3’，所述探针B  为5’-Fc-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’；也可以利用探针C和探针D制作该电化学传感器，其中所述探针C为5’-TTTTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-SH-3’，所述探针D为5’-Fc-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-(CH2)6-SH-3’。
另外，得到前述电化学传感器后，将电化学传感器浸泡在待测样品中，取出电化学传感器，用溶液清洗，用恒电位仪进行电化学检测。最好，将电化学传感器浸泡在待测样品中30min，用1/15M PB，0.1M NaCl，pH＝7.4的溶液清洗电化学传感器3次，用多通道恒电位仪进行电化学检测。最好，用用带SWV分析方法的恒电位仪扫描并分析结果。
实施例1：利用探针A和探针B制备Hg2+检测电化学传感器(基于方法A)。
1μM探针A(末端巯基修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链)在100μM三[2-羧乙基]膦(TCEP)，10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0中室温下还原1h，将未经修饰的干净的金电极浸泡到其中，室温下过夜自组装。组装后的电极用10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0冲洗两遍，然后将电极放到含1mM巯基己醇(MCH)的水溶液中封闭30分钟，再用10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0冲洗三遍，吹干备用；将标记二茂铁的探针B(全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链)用杂交液1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4稀释成50nM，将组装好全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链的金电极浸泡到其中，25℃，反应3h，然后用1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4洗三次，得到传感器。最好，得到的传感器使用前于4℃下保存。
实施例2：利用探针C和探针D制备Hg2+检测电化学传感器(基于方法B)。
1μM探针C(末端巯基修饰的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链)在100μM三[2-羧乙基]膦(TCEP)，10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0中室温下还原1h，将未经修饰的干净的金电极浸泡到其中，室温下过夜自组装。组装后的电极用10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0冲洗两遍，然后将电极放到含1mM巯基己醇(MCH)的水溶液中封闭30分钟，再用10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0冲洗三遍，吹干备用；将标记二茂铁的探针D(全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链互补的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链)，溶入到50mM二硫苏糖醇(DTT)，2％三乙胺(TEA)的水溶液中，室温，反应20min。使用NAP-5column过柱纯化，然后通过在260nm处紫外可见吸收峰值对全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链定量，加入到粒径为13nm的9nM纳米金溶液使DNA链与纳米金摩尔比例为100∶1，在室温下静置老化16小时，老化后在分子杂交仪中振荡下分多次加入1M PB，1M NaCl，pH＝7.4使NaCl终浓度为0.3M，振荡16h后，9000rpm离心20min，10mM PB，pH＝7.4洗涤三次，制得包被了标记二茂铁的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互补链的纳米金，置于4℃下备用；该纳米金用杂交液1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4稀释成2nM，将组装好全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链的金电极浸泡到其中，25℃，反应3h，然后用1/15M PB，0.3MNaCl，pH＝7.4洗三次，从而得到传感器。最好，得到的传感器使用前于4℃下保存。
实施例3：利用探针A和B制备的电化学传感器考察Hg2+的反应时间动力学。
将用探针A和B制备的电化学传感器浸泡到含1nM Hg2+的缓冲溶液中(1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4)浸泡室温下每反应5min取出电极，用1/15M PB，0.1M NaCl，pH＝7.4的溶液清洗3次，用多通道恒电位仪(VMP3)做SWV扫描并分析结果(图2)。
结果表明，Hg2+诱导探针B的释放是个相对快速的过程，与1nM的Hg2+20min内基本完成了反应。至25min时SWV峰值电流不再减小。
实施例4：利用探针A和B制备的电化学传感器检测不同浓度的Hg2+。
在1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4的溶液中制备不同浓度的Hg2+溶液，将传感器浸泡到Hg2+溶液中，室温下反应30min。然后用1/15MPB，0.1M NaCl，pH＝7.4的溶液清洗3次，用多通道恒电位仪(VMP3)做SWV扫描并分析结果，重复以上步骤检测由低浓度到高浓度Hg2+溶液，建立该传感器的工作曲线(图3A，图3B)。
结果表明，在Hg2+离子存在的情况下，SWV峰值电流会减小，当Hg2+浓度为10nM时，与缓冲液组的峰值电流相比减小17％，随着Hg2+浓度增加，电化学信号逐渐减弱。该传感器检测Hg2+的检测限为0.1nM。
实施例5：利用探针C和D制备的电化学传感器检测不同浓度的Hg2+。
在1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4的溶液中制备不同浓度的Hg2+溶液，将传感器浸泡到Hg2+溶液中，室温下反应30min。然后用1/15MPB，0.1M NaCl，pH＝7.4的溶液清洗3次，用多通道恒电位仪(VMP3)做SWV扫描并分析结果，重复以上步骤检测由低浓度到高浓度Hg2+溶液，建立该传感器的工作曲线(图4A，图4B)。
结果表明，在Hg2+离子存在的情况下，SWV峰值电流会减小，当Hg2+浓度为10nM时，与缓冲液组的峰值电流相比减小29％，随着Hg2+浓度增加，电化学信号逐渐减弱。该传感器检测Hg2+的检测限为0.01nM。
实施例6：考察金电极表面组装的探针C的密度的不同对Hg2+检测的输出信号的影响。
将两根同一规格未经修饰的干净的金电极分别浸泡到已用TCEP还原1h的1μM探针C溶液中，置于室温下，分别自组装30min和过夜自组装。组装后的电极用10mM Tris，1.0M NaCl，pH＝8.0冲洗两遍，然后将电极放到含1mM MCH的水溶液中封闭30分钟，再用10mMTris，1.0M NaCl，pH＝8.0冲洗三遍，再与2nM的包被探针D的纳米金在1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4的溶液中反应3h，25℃，然后用1/15M PB，0.1M NaCl，pH＝7.4的溶液清洗电极三次，再在1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4的溶液中制备不同浓度的Hg2+溶液，将传感器浸泡到Hg2+溶液中，室温下反应30min。然后用1/15M PB，0.1M NaCl，pH＝7.4的溶液清洗3次，用多通道恒电位仪(VMP3)做SWV扫描并分析结果，重复以上步骤检测由低浓度到高浓度Hg2+溶液，比较上述不同条件制备的传感器的信号变化并分析结果(图5)。上述两个传感器在空白溶液中的电流信号基本相同。
结果表明，检测相同浓度的Hg2+溶液时，在1μM探针C溶液中自组装30min构建的传感器在整个汞离子浓度范围的信号减弱强度都大大低于在1μM探针C溶液中过夜自组装构建的传感器，而且汞离子的可准确定量检测区间由0.01nM-10μM减小为1nM-1μM。这是因为在自组装过程中保持同样的探针C和NaCl浓度的条件下可以通过改变自组装时间来控制电极表面探针密度(Peterson，A.W.；Heaton，R.J.；Georgiadis，R.M.Nucl.Acid.Res.2001，29，5163-5168.)，也进一步证明了该传感器是基于两条相邻全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链上的T-T配对引起电化学信号改变来检测Hg2+的。高探针密度下有利于相邻全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链上的T碱基与汞离子的配位，相应的检测的灵敏度显著高于低探针密度的情况。由于解链或其它因素造成的电化学信号的降低，具有不同密度的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链的传感器应该有类似的电信号变化。因此上述检测灵敏度受探针密度影响的现象可以用于排除汞离子检测时假阳性的情况。根据经典的库伦积分电化学方法测定，上述实施例图5(A)中a是全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链探针C自组装30min构建的传感器，其中探针C的密度为1.4X1012链/cm2；上述实施例图5(A)中b是全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链探针C过夜自组装构建的传感器，其中探针C的密度为2.8X1012链/cm2。由于各种探针表面密度测试方法在测定结果上存在差异，本发明传感器探针C的密度在1.0X1012-1.0X1013链/cm2范围内均能够实现对汞离子的灵敏检测。最好，所述探针C的密度为1.4X1012-2.8X1012链/cm2。
实施例7：考察探针C和D制备的传感器对Hg2+检测的特异性。
在1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4的溶液中制备10μM的Hg2+溶液和其他不同的金属离子的溶液，，将传感器分别浸泡到各离子溶液中，室温下反应30min。用1/15M PB，0.1M NaCl，pH＝7.4的溶液清洗3次，用多通道恒电位仪(VMP3)做SWV扫描并分析结果(图6)。结果表明，只有在Hg2+存在的情况下，电信号大大减小，我们定义10μM Hg2+离子使电信号减小强度为100，10μM其他金属离子电信号减小相对很微弱，在0.8％～10％左右。说明该传感器对Hg2+检测具有很好的特异性。
实施例8：用探针C和D制备的传感器检测掺入在湖水中的Hg2+。从北京玉渊潭公园收集的湖水经过滤后，向其中掺入一定体积的汞存储液，配制成含0，10nM，100nM的Hg2+溶液，然后用1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4的溶液稀释十倍，将传感器浸泡到低浓度的Hg2+溶液中，室温，反应30min。用1/15M PB，0.1M NaCl，pH＝7.4的溶液清洗3次，用多通道恒电位仪(VMP3)做SWV扫描并分析结果，再根据传感器的工作曲线计算测得的Hg2+浓度(见表2)。
表2：添加的到湖水中Hg2+浓度与该传感器测得的Hg2+浓度值对比。
Figure BDA00001886868100141
结果显示，用该传感器检测掺入在湖水中的Hg2+并通过该传感器工作曲线计算得的Hg2+浓度与掺入的Hg2+浓度值基本吻合，说明用该传感器可以检测湖水中的Hg2+。

Claims (5)

1.一种用于汞离子检测的电化学传感器，其特征在于，该传感器为一种金电极，该金电极具有固定在其表面上的探针C及与该探针C互补的包被到纳米金表面的探针D，其中所述探针C为5’-TTTTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-SH-3’，所述探针D为5’-Fc-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-(CH2)6-SH-3’。
2.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，所述探针C的密度为1.0X1012-1.0X1013链/cm2。
3.一种用于汞离子检测的电化学传感器的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步骤：将化学修饰的探针C固定在金电极的表面上，所述探针C为5’-TTTTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-SH-3’；第二步骤：将固定有探针C的金电极浸泡到含有与该探针C互补的探针D的杂交液中，所述探针D为5’-Fc-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-(CH2)6-SH-3’，所述探针D包被到纳米金表面。
4.一种使用权利要求1或2中所述的用于汞离子检测的电化学传感器的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将电化学传感器浸泡在待测样品中，取出电化学传感器，用溶液清洗，用恒电位仪进行电化学检测。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，将电化学传感器浸泡在待测样品中30min，用1/15M PB，0.1M NaCl，pH＝7.4的溶液清洗电化学传感器3次，用多通道恒电位仪进行电化学检测。
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