CN102912011A

CN102912011A - 基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg2+检测芯片及方法

Info

Publication number: CN102912011A
Application number: CN2012103063978A
Authority: CN
Inventors: 赵建龙; 娄新徽; 杜娟; 徐元森
Original assignee: Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology of CAS
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2013-02-06

Abstract

本发明涉及一种基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg²⁺检测芯片及方法，其特征在于利用了Hg²⁺能特异性地与两条相邻全胸腺嘧啶（T）寡核苷酸链上的T碱基共价结合，形成稳定的分子间T–Hg²⁺-T结构，进而诱导与全T寡核苷酸链杂交的互补链的释放。制备包括三个步骤：首先将检测探针固定在经化学修饰的玻片上，然后将荧光标记以及淬灭基团标记的互补链分别与其杂交。使用芯片时只需将待测样品添加到芯片上并保持一段时间，冲洗后利用荧光芯片信号分析系统扫描芯片，通过分析荧光信号的变化即可实现对Hg²⁺的检测。样品中Hg²⁺浓度越高，荧光信号增强得越多。检测的Hg²⁺的浓度范围是10nM-100μM。具有很好的离子选择性。

Description

基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg2+检测芯片及方法

技术领域

本发明涉及一种基于寡核苷酸链的荧光增强型汞离子检测芯片和方法，属于生物分析技术领域。

背景技术

汞是高毒的全球性环境污染物,尤其是其具有高迁移性、持久性、甲基化作用性、生物富集性及食物链放大性的特点，即便是极微量的存在于环境中，对动植物及人类的健康也是极大的威胁。全世界的汞一年的排放量约1.5万吨，主要来源于汞矿、冶金、氯碱工业、电器工业和矿物燃料的燃烧。汞以多种形式存在与环境中，水溶性的二价汞离子（Hg²⁺）是汞污染最常见和最稳定的形式之一。

如何有效地进行环境中汞离子含量的测定，成为摆在广大分析工作者面前的一个问题。目前传统的汞离子检测方法主要有：原子（吸收，发射，荧光）光谱法及电感耦合等离子质谱仪（Inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS）。尽管能够得到比较精确的检测结果，但这些技术依赖大型仪器设备、耗费耗时、需进行样品预处理，需要专门的技术人员进行操作，检测成本高,很难满足产地现场快速检测的要求，并且其中有些方法还需要用到有毒试剂，难以被分析人员接受。因此，人们迫切需要简便、快速、经济、准确的分析检测汞离子的方法。目前，国内外对汞离子进行现场检测的方法在灵敏度和专一性上不能够满足要求。

近来的研究表明，汞离子能特异性地与两个胸腺嘧啶碱基（T）共价结合形成稳定的T-Hg²⁺-T结构。基于汞离子的这一特殊的性质，已发展了各种Hg²⁺检测方法：如荧光法(A.Ono,H.Togashi,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2004,43,4300.)、纳米金聚集比色法(J.S.Lee,M.S.Han,C.A.Mirkin,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2007,46,4093.电化学法（Z.Zhu,Y.Su,J.Li,D.Li,J.Zhang,S.Song,Y.Zhao,G.Li,C.Fan,Anal.Chem.2009,81,7660.）等。这些方法普遍具有选择性好、特异性强等特点,但多不适合现场检测。

生物芯片是本世纪八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他物质的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化，能够实现对微量样品快速、准确的检测。本发明人在“基于寡核苷酸链的汞离子荧光检测芯片、制作及使用方法”的申请中（专利申请号：201010533018.x）报道的汞离子检测芯片随着汞离子浓度增加，荧光信号减小。这种signal-off的工作模式容易引起假阳性。本发明在此基础上拟作出进一步改进，克服引起假阳性的缺点，提供一种Hg²⁺检测芯片方法及应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg²⁺检测芯片及方法，本发明的特征在于结合汞离子能特异性地与两个胸腺嘧啶碱基（T）共价结合形成稳定的T–Hg²⁺–T结构的这一特性以及生物芯片的优点，以实现对Hg²⁺低成本、高灵敏、准确、快速的检测。其特征在于：利用Hg²⁺可特异性地与DNA的两个相邻胸腺嘧啶碱基（T）共价结合，介导T-T配对形成稳定的T-Hg²⁺-T结构，进而诱导与全T寡核苷酸链杂交的互补链的释放。通过在全T寡核苷酸链的一端引入一段随机序列，并预先用荧光标记的互补链与之杂交，再用荧光淬灭基团标记的聚腺苷酸链与全T寡核苷酸链片段杂交，荧光基团与淬灭基团之间发生荧光共振能量转移使得荧光淬灭，这样当Hg²⁺诱导T-Hg²⁺–T结构形成而使得聚腺苷酸链被释放，就会引起荧光信号增强（图1）。具体的说，首先将合成的含有富T寡核苷酸链片段以及随机序列片段的单链DNA固定在经修饰的玻片上；然后将荧光基团标记的随机序列互补链以及淬灭基团标记的聚腺苷酸链分别与单链DNA中的随机序列片段以及富T寡核苷酸链片段杂交，形成双链结构，制备好低荧光值的Hg²⁺检测芯片；使用所制作的检测芯片检测样品中Hg²⁺浓度时，则只需将待测样品添加到芯片上并保持一段时间，冲洗后利用荧光芯片信号分析系统扫描芯片，通过分析荧光信号的变化，实现对Hg²⁺的检测。若待测样品中含Hg²⁺时，则Hg²⁺能特异性地与单链DNA中富T寡核苷酸链片段上的T碱基共价结合，介导两条富T寡核苷酸链片段上的T–T配对形成稳定的分子间T–Hg²⁺–T结构，从而诱导带有淬灭基团的聚腺苷酸链的释放，导致芯片斑点处荧光增强。荧光强度可通过荧光扫描仪定量分析。

本发明基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg²⁺检测芯片的制作方法，其特征在于：

本发明中Hg²⁺检测芯片的制作方法包括如下步骤：

（1）化学修饰的含有富T寡核苷酸链片段以及随机序列片段的单链DNA固定在化学修饰的玻片上

2-20μM化学修饰的单链DNA按1:1（V/V）的比例加入2×点样缓冲液。通过以接触式Cartesian microarray制作系统点阵于化学修饰的载玻片。点样完毕，将玻片置于一定湿度，比如70％湿度、室温条件下48～72h进行固定。分别用0.2％SDS（十二烷基硫酸钠）、去离子水洗2次，每次2min，然后用醛基封闭液（0.1g硼氢化钠，30mL PBS,10mL99%乙醇）封闭15min。再依次用0.2％SDS、去离子水各洗2次，每次2min，吹干，备用。

（2）随机序列互补链与单链DNA中的随机序列片段杂交

标记了荧光基团的随机序列互补链用杂交液稀释成1-10μM。将稀释好的溶液加在芯片的斑点处，盖上盖玻片。芯片置于湿盒中，25℃，过夜。次日早上，将芯片置于4℃，30min，再25℃，15min。然后依次用10mMMOPS（3-吗啉丙磺酸）,100mM NaNO₃,pH7.2洗5-10min，吹干，备用。

（3）聚腺苷酸链与单链DNA中的富T寡核苷酸链片段杂交

标记了淬灭基团的聚腺苷酸链与单链DNA的杂交方法同（2）所述。本发明制备的Hg²⁺检测芯片的检测方法包括如下步骤：

用杂交液稀释制备好不同浓度的Hg²⁺，加不同浓度的Hg²⁺溶液于芯片斑点处，室温，反应10-60min。10mM MOPS,100mM NaNO₃,pH7.2洗3次，吹干。用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描并分析结果。

本发明基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg²⁺检测芯片、制作方法及其应用方法，具有如下的技术效果：

1、本发明基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg²⁺检测芯片的制作方法简单易行。

2、本发明基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg²⁺检测芯片灵敏度和专一性高。

3、应用本发明检测Hg²⁺时，检测结果随着Hg²⁺浓度提高表现为荧光信号增强，从而避免了假阳性，易于理解和表达。

4、应用本发明检测Hg²⁺时，样品、试剂消耗量少，成本低。

5、本发明的检测结果用普通的扫描仪扫描观察及分析即可，不需要复杂的昂贵设备，使现场检测更简单方便。

6、通过分析荧光信号的变化，即可实现对Hg²⁺的检测。样品中Hg²⁺浓度越高，荧光信号增强的越多。该方法可以检测的Hg²⁺的浓度范围是10nM-100μM。该芯片具有很好的离子选择性，其它常见金属离子对其没有响应。

附图说明

图1是基于寡核苷酸链的荧光增强型汞离子芯片检测原理图。

图2（A）-图2（D），是本发明实施例2中利用荧光增强型检测芯片检测Hg²⁺的分步荧光扫描照片。图A为检测探针A固定到玻片后的扫描照片，图B为探针B与探针A杂交后芯片的扫描照片，图C为探针C与探针A杂交后芯片的扫描照片，图D为利用芯片检测100nM Hg²⁺的扫描照片。荧光强度指示条指示了不同颜色代表的荧光强弱。荧光扫描照片中荧光强度平均值依次是：图（A）0，图（B）65535，图（C）7129，图（D）25832。

图3（A）-图3（B），是本发明实施例3中利用荧光增强型检测芯片检测Hg²⁺的荧光扫描照片及标准曲线。图3（A）依次为检测缓冲液、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM Hg²⁺的荧光扫描照片，照片中荧光强度平均值依次是：缓冲液组7978，10nM Hg²⁺组13880，100nM Hg²⁺组26202，1μMHg²⁺组33572，10μM Hg²⁺组55940,100μM Hg²⁺组65535；图3（B）为分析结果。

图4（A）-图4（B），是本发明实施例4中利用荧光增强型检测芯片检测Hg²⁺和其他二价离子的荧光扫描照片及结果。图4（A）依次为检测缓冲液、10μM Hg²⁺、10μM Pb²⁺、10μM Zn²⁺、10μM Ca²⁺、10μM Cu²⁺、10μMNi²⁺、10μM Mg²⁺的荧光扫描照片。照片中荧光强度平均值依次是：缓冲液组7035，Hg²⁺组56186，Pb²⁺组11307，Zn²⁺组9905，Ca²⁺组10292，Cu²⁺组10823，Ni²⁺组10744，Mg²⁺组9990。图4（B）为分析结果。

图5（A）–图5（C），是本发明实施例5中利用荧光增强型检测芯片检测相同浓度的标准缓冲液中Hg²⁺和饮用水中掺入的Hg²⁺荧光扫描照片及结果。图5（A）中依次为检测标准缓冲液中掺入0、500nM、5μM Hg²⁺的荧光扫描照片，图5（B）中依次为检测饮用水中掺入入0、500nM、5μM Hg²⁺的荧光扫描照片。图5（C）为分析结果。

具体实施方式

表1：本发明中使用的核酸探针序列。

探针名称	序列
		探针A	5’NH2-C12AGCGTATCGACGAAATTTTTTTTTTTTTT-3'
探针B	5'Cy5-CGTCGATACGCT-3'
		探针C	5’AAAAAAAAAAAAAA-BHQ33'

实施例1:利用探针A、探针B和探针C制备Hg²⁺检测芯片。

将探针A配成浓度为10μM的溶液，然后与相同体积的点样液混合，用Cartesian公司的微阵列芯片制作系统点阵在醛基修饰的载玻片表面，置于室温下，70％相对湿度保存48-72h进行固定，然后，室温下将玻片浸入0.2％SDS中振荡数分钟，再浸入纯水中振荡数分钟，再浸入0.2％SDS两次，每次2min，再浸入纯水中两次，每次2min，晾干。用杂交液（10mM MOPS,100mM NaNO₃,pH7.2）将探针B稀释，终浓度为2-5μM，滴于芯片上，盖上盖玻片，室温杂交过夜。次日早上，将芯片置于4℃，30min，再25℃，15min。然后依次用0.2％SDS，2×SSC，0.2×SSC洗3min，吹干备用。再用杂交液（10mM MOPS,100mM NaNO₃,pH7.2）将探针C稀释，终浓度为2-5μM，滴于芯片上，盖上盖玻片，室温杂交过夜。次日早上，将芯片置于4℃，30min，再25℃，15min。然后依次用0.2％SDS，2×SSC，0.2×SSC洗3min，吹干备用。

实施例2：利用探针A、B、C制备芯片检测100nM Hg²⁺溶液，并分步扫描荧光强度照片。

芯片制备方法同实例1，分别在探针A固定后、探针B杂交后、以及探针C杂交后用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描照片（图2A-C）。再用10mM MOPS,100mM NaNO₃,pH7.2稀释制备好100nM的Hg²⁺溶液，将Hg²⁺溶液加在制备好的芯片斑点处。室温反应1h取出芯片，用10mM MOPS,100mM NaNO₃,pH7.2缓冲液洗3次，吹干，再用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描照片（图2D）。

结果表明，探针A固定后芯片无荧光；探针B杂交后，荧光强度达到饱和值；探针C杂交后，荧光强度大幅度下降；加100nM的Hg²⁺溶液反应后，荧光强度增强。

实施例3：利用探针A、B、C制备的芯片检测不同浓度的Hg²⁺。

用10mM MOPS,100mM NaNO₃,pH7.2分别稀释配制10nM、100nM、1μM、10μM、100μM的Hg²⁺，加不同浓度的Hg^2＋溶液于制备好的芯片斑点处，室温，反应1h。用10mM MOPS,100mM NaNO₃,pH7.2缓冲液洗3次，吹干。用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描照片（图3A）并分析结果（图3B）。

结果表明，在Hg²⁺离子存在的情况下，芯片斑点处荧光强度增强，且当Hg²⁺浓度越高时，荧光强度增强越多。当Hg²⁺浓度为100nM时，与缓冲液组的荧光强度相比，斑点处荧光强度增强30％，随着Hg²⁺浓度增加，荧光信号逐渐增强。按照空白标准偏差的三倍计算，该芯片检测Hg²⁺的检测限为10nM。

实施例5：考察探针A、B、C制备的芯片对Hg²⁺检测的特异性。

用10mM MOPS,100mM NaNO₃,pH7.2稀释制备10μM的不同的二价金属离子，加不同二价金属离子溶液于制备好的芯片斑点处，室温，反应1h。用10mM MOPS,100mM NaNO₃,pH7.2缓冲液洗3次，吹干。用GeneralScanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描照片（图4A）并分析结果（图4B）。

结果表明，只有在Hg²⁺存在的情况下，芯片斑点处荧光强度大大增强，Hg²⁺为10μM时，与缓冲液组的荧光强度相比，荧光强度增强了75％。而当加入10μM其他二价金属离子，荧光强度只有微小的增强，在4.4％～6.5％左右。说明该芯片对Hg²⁺检测具有很好的特异性。

实施例5：用探针A、B、C制备的芯片检测掺入在饮用水中的Hg²⁺。

用饮用水配制含10mM MOPS,pH7.2,100mM NaNO₃的缓冲液，再向其中掺入一定体积的汞存储液，使汞离子的浓度为5μM、500nM。将制备好的汞离子溶液加入芯片斑点处，同时设立饮用水缓冲液对照。并同时检测标准缓冲液中相同浓度的汞离子。室温反应1h，用10mM MOPS,pH7.2,100mM NaNO₃缓冲液洗3次，每次2min，吹干。用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描照片（图5A、5B）并分析结果（图5C）。

结果显示，用该芯片检测相同浓度的掺入在饮用水中的Hg²⁺及标准缓冲液中的Hg²⁺时，荧光信号增强的程度无明显差别，说明用该芯片可以检测掺入在饮用水中的Hg²⁺。

Claims

1.一种基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg²⁺检测芯片，其特征在于利用Hg²⁺可特异性地与DNA的两个相邻胸腺嘧啶碱基（T）共价结合，介导T–T配对形成稳定的T–Hg²⁺–T结构，进而诱导与全T寡核苷酸链杂交的互补链的释放。

2.按权利要求1所述的检测芯片，其特征在于所述诱导进而诱导与全T寡核苷酸链杂交的互补链的释放是在全T寡核苷酸链的一端引入一段随机序列，并预先用荧光标记的互补链与之杂交，再用荧光淬灭基团标记的聚腺苷酸链与全T寡核苷酸链片段杂交，荧光基团与淬灭基团之间发生荧光共振能量转移使得荧光淬灭；当Hg²⁺诱导T–Hg²⁺–T结构形成而使得聚腺苷酸链被释放，引起荧光信号增强。

3.制备如权利要求1或2所述的检测芯片的方法，其特征在于首先将合成的含有富T寡核苷酸链片段以及随机序列片段的单链DNA固定在经修饰的玻片上；然后将荧光基团标记的随机序列互补链以及淬灭基团标记的聚腺苷酸链分别与单链DNA中的随机序列片段以及富T寡核苷酸链片段杂交，形成双链结构，制备低荧光值的Hg²⁺检测芯片。

4.按权利要求3所述的方法，其特征在于制备步骤包括：

2-20μM化学修饰的单链DNA按体积比为1:1的比例加入2×点样缓冲液，通过以接触式Cartesian microarray制作系统点阵于化学修饰的载玻片，点样完毕，将玻片置于70%湿度，室温条件下48～72h进行固定；并分别用质量百分数为0.2％SDS和去离子水洗2次，每次2min，然后用醛基封闭液封闭15min；再依次用质量百分数为0.2％SDS和去离子水各洗2次，每次2min，吹干，备用；

（2）随机序列互补链与单链DNA中的随机序列片段杂交

标记了荧光基团的随机序列互补链用杂交液稀释成1-10μM。将稀释好的溶液加在芯片的斑点处，盖上盖玻片；芯片置于湿盒中，25℃，过夜。次日早上，将芯片置于4℃，30min，再25℃，15min；然后依次用10mMMOPS,100mM NaNO₃,pH7.2洗5-10min，吹干，备用；

（3）聚腺苷酸链与单链DNA中的富T寡核苷酸链片段杂交

标记了淬灭基团的聚腺苷酸链与单链DNA的杂交方法如步骤（2）所述。

5.按权利要求4所述的方法，其特征在于：

步骤（1）使用的探针A的序列为

5’NH2-C12 AGCGTATCGACGAAATTTTTTTTTTTTTT-3'；

步骤（2）使用的探针B的序列为

5'Cy5-CGTCGATACGCT-3'；

步骤（3）使用的探针C的序列为

5’AAAAAAAAAAAAAA-BHQ33'。

6.如权利要求1或2所述的检测芯片的使用方法，其特征在于只需将待测样品添加到芯片上保持一段时间，冲洗后利用荧光芯片信号分析系统扫描芯片，通过分析荧光信号的变化，实现对Hg²⁺的检测。

7.按权利要求6所述的使用方法，其特征在于：

①所述的芯片的Hg²⁺的检测范围为10nM~100μM；

②所述的芯片对Hg²⁺具有离子选择性，除Hg²⁺外的其他常见的金属离子没有响应性。