CN106383101A - 基于“off‑on‑off ”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针芯片 - Google Patents

基于“off‑on‑off ”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针芯片 Download PDF

Info

Publication number
CN106383101A
CN106383101A CN201610795978.0A CN201610795978A CN106383101A CN 106383101 A CN106383101 A CN 106383101A CN 201610795978 A CN201610795978 A CN 201610795978A CN 106383101 A CN106383101 A CN 106383101A
Authority
CN
China
Prior art keywords
concentration
chip
solution
fluorescence
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610795978.0A
Other languages
English (en)
Inventor
何苗
韩世同
施汉昌
周小红
汪用志
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tsinghua University
Original Assignee
Tsinghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tsinghua University filed Critical Tsinghua University
Priority to CN201610795978.0A priority Critical patent/CN106383101A/zh
Publication of CN106383101A publication Critical patent/CN106383101A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明公开了基于“off‑on‑off”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针芯片。该方法中，随着待测样品中的Hg2+的浓度逐渐增加，Hg2+首先与杂交液中的TQ形成T–Hg2+–T结构，与TQ配对的带荧光标记的AC以游离状态存在，随后AC与芯片表面固定的探针TP发生杂交反应而被捕获，表现为荧光逐渐增强，即“off–on”模式”；然后，随着Hg2+的浓度继续增加，剩余Hg2+与芯片上的探针TP形成T–Hg2+–T结构，而原在芯片上捕获的AC被取代，从荧光探针表面离开，表现为荧光逐渐衰减，即“on–off”模式”；根据荧光探针芯片所检测得到的荧光强度确定待测溶液中Hg2+的浓度。本发明基于T‑T错配原理，借助于两次目标诱导的构象变化，结合光纤的倏逝波荧光检测平台，可实时检测Hg2+。

Description

基于“off-on-off”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针 芯片
技术领域
本发明涉及基于“off-on-off”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针芯片。
背景技术
近年来我国已发生了多起重金属汞的污染事件，严重威胁着广大人民群众的身体健康和生态安全。为控制汞离子(Hg2+)经摄入进入人体内，《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)严格限定饮用水中汞离子(Hg2+)的浓度不能高于0.001mg/L，并基于原子荧光光谱(ACS)、电感耦合等离子体质谱(ICP/MS)等仪器开发了检测痕量Hg2+的标准方法(GB/T4470-1998、GB/T 23362.4-2009等)。尽管标准的仪器方法检测饮用水中Hg2+具有灵敏、准确等优点，但也存在着样品前处理复杂，仪器设备昂贵，检测时间长等问题，难以实现快速现场检测或对突发水污染事件做出快速响应。
近年来研究发现汞离子(Hg2+)能够与胸腺嘧啶(T)特异结合，形成T-Hg2+-T错配结构，这就为汞离子(Hg2+)的快速、特异识别提供一条便捷的途径。目前基于错配原理的生物传感器得到快速发展并已应用于Hg2+离子的现场和在线检测之中。
在这些方法中，由于具有高灵敏度，选择性强，检测速度快等特点，使基于目标诱导构象转变(Target-induced conformational switching)检测策略的生物传感器受到更多的关注。Long等人利用目标诱导靶诱导结构转换开发了一种“Turn off”模式的光纤生物传感器。该生物传感器可以高灵敏度检测Hg2+，检出限低至1.2nm，在数分钟内可以检测浓度在1.2nm到10μM范围的Hg2+。Du等人设计了一种荧光双探针的芯片基生物传感器，该传感器使用“Turn on”检测模式对Hg2+的检测限可达8.6nM，但检测需要两个费时的DNA杂交过程。可见上述研究还存着易产生假信号或者检测时间长的问题，并不能满足实际检测的需要。因此，研制适合汞离子(Hg2+)检测的快速、灵敏和宽范围的检测方法已成为防治汞离子(Hg2 +)污染的迫切需求。
发明内容
本发明的目的是提供基于“off-on-off”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针芯片，该方法的检测限为0.4nM，检测范围为0.4nM-50μM，检测时间在15min以内。
本发明提供的一种用于检测汞离子的荧光探针芯片的制备方法，它包括如下步骤：
a)将基片表面的羟基进行活化；
b)将经步骤a)处理的基片表面进行硅烷化；
c)将经步骤b)处理的基片表面进行偶联化；
d)将名称为TP的单链DNA探针固定在经步骤c)处理的基片表面，所述固定的步骤如下：将经步骤c)处理的基片在名称为TP的单链DNA探针溶液中浸泡16～20小时，取出基片，依次进行清洗和干燥；所述TP为含有聚脱氧胸苷酸的单链DNA，所述单链DNA的端部修饰有氨基。
上述的制备方法，
步骤a)中，所述基片可表面具有二氧化硅膜的基片，如为硅片、石英片、玻璃片或光纤基片。所述活化的步骤可如下：将所述基片浸泡于硫酸-过氧化氢溶液，在70～110℃(如80℃)下静置45～90分钟(如60分钟)，取出基片进行洗涤和干燥，然后100～120℃(如120℃)静置3～12h(如3小时)。所述硫酸-过氧化氢溶液的制备方法可如下：将3体积份浓硫酸和1体积份30％过氧化氢混合。所述硫酸-过氧化氢溶液的制备方法具体如下：将3体积份浓硫酸(即质量分数为98.3％的硫酸溶液)和1体积份30％过氧化氢(即质量分数为30％的过氧化氢溶液)混合。
步骤b)中，所述硅烷化的步骤可如下：将经步骤a)处理的基片浸泡于硅烷化剂溶液中，室温静置10～60min(如10min)，取出基片进行洗涤和干燥，在130℃～200℃(如180℃)下烘烤1～12h(如1h)，得到表面硅烷化的基片。所述硅烷化溶液的溶质可为3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，溶剂可为无水乙醇或丙酮，APTES体积百分含量可为2％～10％(如6％)。
步骤c)中，所述偶联化的步骤如下：将经步骤b)处理的基片浸泡于戊二醛偶联剂溶液中，室温静置30～120min(如60min)，取出基片进行洗涤和干燥，得到表面偶联化的基片。所述戊二醛偶联剂溶液的溶剂可为Tris-HCl缓冲液，体积百分含量为0.4％～5％(如2％)。
步骤d)中，所述名称为TP的单链DNA探针溶液由名称为TP的单链DNA、NaCl和Tris-HCl缓冲液组成，其中，所述名称为TP的单链DNA探针的浓度为200～400nM(如300nM)，所述NaCl的浓度为50～200mM(如200mM)，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10～50mM(如50mM)。
所述浸泡的时间具体可为16小时；所述浸泡在室温条件下，湿度为55～75％的密闭环境中进行。所述干燥具体可为在室温条件用氮气吹干。
所述氨基通常可修饰在所述名称为TP的单链DNA的任意一端，如5’端。
所述方法在所述固定之后还包括将所述基片表面上的DNA进行封闭的步骤。所述封闭可采用浓度为10～50μM(如20μM)的甘氨酸水溶液，封闭时间可为1～5h(如1h)。
上述的制备方法中，所述聚脱氧胸苷酸中脱氧胸苷酸的个数可为14～18，优选为16。所述氨基具体可来自NH2-(CH2)6。
由上述任一项所述的制备方法制备得到的荧光探针芯片，也在本发明的保护范围内，该荧光探针芯片可实现基于“off-on-off”模式的汞离子的检测。
包括上述的荧光探针芯片在内的用于检测汞离子的生物传感器，也在本发明的保护范围内。所述生物传感器可为全光纤倏逝波生物传感器。
本发明进一步提供了一种基于“off-on-off”模式的汞离子的荧光检测方法，该检测方法中，随着待测样品中的Hg2+的浓度逐渐增加，Hg2+首先与名称为TQ的标记了荧光淬灭基团的单链DNA形成T–Hg2+–T结构，与TQ配对的名称为AC的标记了荧光基团的单链DNA以游离状态存在，随后所述AC(称之为靶标)与芯片表面固定的名称为TP的单链DNA探针发生杂交反应而被捕获，表现为芯片表面荧光逐渐增强，即“off–on”模式”；然后，随着Hg2+的浓度继续增加，剩余Hg2+与所述芯片上的探针TP形成T–Hg2+–T结构，而原在所述芯片上捕获的所述AC被取代，并从所述芯片表面离开，表现为荧光逐渐衰减，即“on–off”模式”；根据所述芯片所检测得到的荧光强度确定所述待测溶液中Hg2+的浓度。
上述的检测方法中，所述方法可包括如下步骤：
1)制备含有AC-TQ的杂交液；所述AC-TQ是由名称为AC的标记了荧光基团的单链DNA和名称为TQ的标记了荧光淬灭基团的单链DNA杂交而成的双链DNA，所述杂交液中不含游离状态AC；所述AC为含有聚脱氧腺苷酸的单链DNA，所述TQ为含有聚脱氧胸苷酸的单链DNA；
2)将待测样品与所述含有AC-TQ的杂交液进行Hg2+诱导形成T–Hg2+–T结构反应，得到反应液，将所述反应液与所述的固定了DNA探针的荧光芯片进行杂交反应或者进行Hg2+诱导表面探针形成T–Hg2+–T的结构变化，检测反应后芯片的荧光强度，根据所述荧光强度确定所述待测样品中汞离子的浓度。
上述的检测方法中，步骤1)中，所述含有AC-TQ的杂交液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为pH 7.2～7.4，浓度为10～50mM的Tris-HAc缓冲液；所述溶质为所述AC-TQ和NaNO3，所述AC-TQ在所述含有AC-TQ的杂交液中的浓度为20～50nM，NaNO3在所述含有AC-TQ的杂交液中的浓度为30～300mM(如50mM)。
所述荧光基团在所述AC中的位置和所述荧光淬灭基团在所述TQ中的位置满足所述AC与所述TQ能形成所述AC-TQ，并使荧光淬灭。
所述AC中的脱氧腺苷酸的个数和所述TQ中的脱氧胸苷酸个数满足在液体中能形成所述AC-TQ；所述TP中的脱氧胸苷酸的个数满足在液体中与所述AC中的脱氧腺苷酸形成杂交双链。
所述荧光基团为羧基荧光素FAM、花青素荧光染料Cy3、花青素荧光染料Cy5和花青素荧光染料Cy5.5中任一种；所述荧光淬灭基团为荧光淬灭基团BHQ1，荧光淬灭基团Dabcyl、荧光淬灭基团BHQ2和荧光淬灭基团BHQ3中任一种。
步骤2)可采用标准曲线法或标准加入法进行检测；所述标准曲线法的步骤如下：(注，这是实验室测纯水样品中汞离子的方法)配制一系列不同浓度的Hg2+的标准溶液Ⅰ，建立荧光强度与Hg2+浓度的标准曲线；根据待测样品的荧光强度和所述标准曲线即可得到所述待测样品中Hg2+的浓度；所述标准加入法的步骤如下(注，这是实验室测真实水样的方法)：以不含汞离子的待测样品为溶剂，配制一系列所述不同浓度的Hg2+的标准溶液Ⅱ，建立荧光强度与Hg2+浓度的标准加入法曲线，即可得到所述含汞离子的待测样品中Hg2+的浓度。
上述的方法中，所述标准溶液Ⅰ中Hg2+的浓度和所述准溶液Ⅱ中加入的Hg2+的浓度为0～50μM；当浓度为0～10μM时，荧光强度与Hg2+浓度呈正相关；当浓度10～40μM时，荧光强度不变；当浓度为40～50μM时，荧光强度与Hg2+浓度呈负相关；所述方法还包括根据杂交时间(荧光信号达到最大值时对应的时间)判断Hg2+所在的浓度范围的步骤。
上述的方法中，所述待测样品可为环境水样，如饮用水。
本发明方法中，根据T-Hg2+-T配位化学，高亲和力的T-T错配可能取代低亲和力的A-T杂交。随着Hg2+加入到缓冲液中，带荧光标记的AC被取代并被释放到缓冲液中，从而被TP探针所捕获，表现为荧光逐渐增强(“off–on”模式)。当加入Hg2+的量持续增加，使光纤表面的TP之间形成T-T错配，并使待荧光标价的AC从表面离去，可观察到并荧光逐渐衰减(“on–off”模式)。
本发明具有如下有益效果：
本发明基于T-T错配原理，借助于两次目标诱导的构象变化，结合光纤的倏逝波荧光检测平台，开发出一种具有“off–on–off”检测模式实时检测Hg2+的检测方法。由于双模检测方式的使用，降低了背景噪声的影响，避免虚假信号，提高了灵敏度(检测限至0.4nM)，扩大了检测范围(0.4nM-50μM)。而其他金属离子干扰可以忽略不计。同时该传感器成功用于对湖泊水中Hg2+的检测，上述结果均表明该传感器具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明“off–on–off”模式宽范围检测Hg2+的原理图。
图2为实施例2中“off–on–off”模式宽范围检测Hg2+的检测结果图，图2(a)为0-10μM Hg2+与荧光信号的关系曲线；图2(b)为40-50μM Hg2+与荧光信号的关系曲线；图2(c)为0-50μM Hg2+与对应荧光信号的线性拟合关系曲线。
图3为“off–on–off”模式Hg2+检测生物传感器对不同金属离子的选择性检测结果图。
图4为“off–on–off”模式Hg2+检测生物传感器对浓度为10nM的汞离子(Hg2+)溶液的重复性检测结果图。
图5为“off–on–off”模式Hg2+检测生物传感器对饮用水中不同浓度的汞离子(Hg2 +)的检测结果图，图5(a)为0-10μM Hg2+与对应荧光信号的线性拟合关系曲线；图5(b)为40-50μM Hg2+与对应荧光信号的线性拟合关系曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为sigma-aldrich公司的产品,CAS号为919-30-2。
下述实施例中的AC：(3’-AAAAAAAAAAAAAAAA-F-5’)(其中F为花青素荧光染料Cy3)为生工生物工程(上海)股份有限公司的产品。
下述实施例中的TQ：(5’-TTTTTTTTTTTTTTTT-Q-3’)(其中Q为荧光淬灭基团BHQ2)为生工生物工程(上海)股份有限公司的产品。
下述实施例中的TP：(5’-NH2-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTTT-3’)为生工生物工程(上海)股份有限公司的产品。
全光纤倏逝波生物传感器为本实验室自行开发，中国专利ZL 200610089497.4(CN1873450A)。
光纤为南京春辉科技实业有限公司的产品，产品型号为HCS。
实施例1、制备用于检测Hg2+的荧光探针芯片及生物传感器
一、用于检测Hg2+的荧光探针芯片
1、光纤基片表面羟基活化
将光纤基片浸泡于硫酸-过氧化氢溶液，80℃静置1h，取出浸泡后的光纤基片，采用超纯水冲洗3次后用N2吹干，然后120℃静置3h，得到表面羟基活化的光纤基片，将表面羟基活化的光线基片置于干燥器中冷却和保存。
硫酸-过氧化氢溶液的制备方法：将质量百分含量为98.3％的浓硫酸和质量百分含量为30％的过氧化氢按照体积比3:1进行混合，得到硫酸-过氧化氢溶液。
2、表面硅烷化
将步骤1得到的表面羟基活化的光线基片浸泡于硅烷化剂溶液中，室温静置10min，取出浸泡后的光纤基片，依次用无水乙醇和水冲洗各3次，然后用N2吹干，180℃烘烤1h，得到表面硅烷化的光纤基片，将表面硅烷化的光纤基片置于干燥器中冷却和保存。
硅烷化剂溶液的制备方法：将3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解于无水乙醇，每6mL APTES溶于100mL无水乙醇中，形成体积百分含量为6％的硅烷化剂溶液。
3、表面偶联化
将步骤2得到的表面硅烷化的光纤基片浸泡于戊二醛偶联剂溶液中，室温静置60min，取出浸泡后的光纤基片，依次用高纯水和浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)各冲洗3次，然后用N2吹干，得到表面偶联化的光线基片，将表面偶联化的光线基片置于干燥器中冷却和保存。
偶联剂溶液：含2％(体积百分含量)戊二醛的浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)。
4、TP探针的固定
在室温环境下，将在步骤3得到的表面偶联化的光纤基片浸入名称为TP的单链DNA探针溶液中16小时，然后放入湿度为55-75％，最佳湿度为65％的密闭环境中室温静置20h，依次用0.2％(质量百分含量)的SDS溶液和超纯水各冲洗3次，然后用浓度为20μM的甘氨酸水溶液进行封闭1h，然后再用0.2％(质量百分含量)的SDS溶液和超纯水各冲洗3次，每次1min，用N2吹干，得到表面固定有名称为TP的单链DNA探针的芯片，命名为TP探针芯片。
名称为TP的单链DNA探针溶液的制备方法：将名称为TP的单链DNA探针和NaCl溶于浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中，使名称为TP的单链DNA探针的浓度为300nM，NaCl的浓度为200mM。
名称为TP的单链DNA探针：5’-NH2-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTTT-3’。
实施例2、汞离子(Hg2+)的检测
一、制备TP探针芯片
制备方法同实施例1。
二、汞离子(Hg2+)的检测
如图1所示，随着待测样品中的Hg2+的浓度逐渐增加，Hg2+首先与名称为TQ的标记了荧光淬灭基团的单链DNA形成T–Hg2+–T结构，与TQ配对的名称为AC的标记了荧光基团的单链DNA以游离状态存在，随后AC(称之为靶标)与芯片表面固定的名称为TP的单链DNA探针发生杂交反应而被捕获，表现为芯片表面荧光逐渐增强，即“off–on”模式”；然后，随着Hg2+的浓度继续增加，剩余Hg2+与芯片上的探针TP形成T–Hg2+–T结构，而原在芯片上捕获的AC被取代，从芯片表面离开，表现为荧光逐渐衰减，即“on–off”模式”；根据芯片所检测得到的荧光强度确定待测溶液中Hg2+的浓度。
进一步地，检测的具体步骤如下：
1、制备含有AC-TQ的杂交液
AC(靶标1)：3’-AAAAAAAAAAAAAAAA-F-5’(其中F为花青素荧光染料Cy3)，
TQ(靶标2)：5’-TTTTTTTTTTTTTTTT-Q-3’(其中B为荧光淬灭基团BHQ2)。
含有AC-TQ的杂交液的制备：由溶剂和溶质组成，溶剂可为pH7.4，浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液，溶质为AC-TQ和NaNO3，AC-TQ在杂交液中的浓度为30nM；NaNO3在杂交液中的浓度为50mM。
2、将汞离子(Hg2+)溶液用浓度为0.1M硝酸溶液稀释成如下浓度(μM)：0.021、0.21、0.42、0.83、3.34、6.67、10.0与33.33、40.0、43.33、46.67、48.34、50.0；分别向1-13号试管中各加入300μL的含有AC-TQ的杂交液，然后将上述不同浓度的汞离子(Hg2+)溶液依次加入到1-13号含有300μL的含有AC-TQ的杂交液的试管中，其中各浓度汞离子(Hg2+)溶液的加入体积均相同且≤1％的含有AC-TQ的杂交液的体积，室温(20-30℃)静置8min进行液相杂交反应，分别得到1-13号液相杂交反应后的溶液，9号为对照管，将等体积的0.1M HNO3替代不同浓度的汞离子(Hg2+)溶液，其它不变。Hg2+能够与AC-TQ中的TQ形成T–Hg2+–T结构，使得AC-TQ中的AC以游离状态存在。
3.分别将1-14号液相杂交反应后的溶液通入TP探针芯片中，测定0-500s时间范围内液相杂交反应后的溶液与TP探针芯片作用产生的荧光信号，液相杂交反应后的溶液中以游离状态存在的AC能够与TP探针芯片表面固定的TP探针杂交，形成TP-AC的双链，利用全光纤倏逝波生物传感器进行汞离子(Hg2+)检测。在激光引起的倏逝波激发下，结合在TP探针芯片表面的TP-AC的双链产生荧光信号，并为仪器所检测，将不同时间产生的荧光信号进行收集。
4、检测完成后分别用饱和尿素溶液、0.2％(质量百分含量)SDS水溶液洗涤使用后的TP探针芯片以去除靶标，使用高纯水和浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液(pH＝7.4)再生芯片。
结果如图2所示，图2(a)为浓度为0、0.021、0.21、0.42、0.83、3.34、6.67和10.0μM的Hg2+的实际检测图，随着汞离子浓度的增加，每个浓度的Hg2+检测的最强荧光信号值是逐渐增大直至稳定。图2(b)为浓度为33.33、40.0、43.33、46.67、48.34和50.0μM的Hg2+的实际检测图，随着汞离子浓度的增加，每个浓度的Hg2+检测的最强荧光信号值是逐渐减小直至衰减到零。
Hg2+浓度值作为横坐标，对应荧光强度百分比为纵坐标拟合得到趋势线，见图2(c)(当Hg2+浓度在0–10μM范围时，y＝10.73x+5.55，R2＝0.98；当Hg2+浓度值为40-50μM范围内时，y＝-8.48x+36.28，R2＝0.98)。根据最低检测限为仪器信噪比3倍的原则，计算出Hg2+的最低检测限为0.4nM。图2(a)-图2(c)的纵坐标为荧光强度百分比(荧光强度百分比＝该浓度下的荧光强度/10.0μM下的荧光强度(最大荧光强度)×100％)。
需要指出：由于荧光强度表现为先增加后衰减的模式，当测定未知样品的荧光强度对应两个Hg2+浓度时，可采用杂交时间来判断Hg2+浓度。如图2(a)和图2(b)所示，对于“off–on”模式7min内(10μM Hg2+)可以达到平衡，而“on–off”模式，需要13min(40μM Hg2+)才能达到平衡。但更为方便的方法是通过简单的稀释或浓缩，利用本生物传感器确定其浓度。
三、不同金属离子的选择性检测
检测步骤：
1、分别向1-11号试管中各加入300μL的含有AC-TQ的杂交液，然后将11种常见金属离子(Ag+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Cd2+、Mn2+、Mg2+、Pb2+、Fe3+、Al3+)依次加入到1-11号试管中，这11种金属离子加入后的最终浓度为10μM，各金属离子溶液的加入体积均相同且≤1％的含有AC-TQ的杂交液的体积，室温(20-30℃)静置8min进行液相杂交反应。所获得信号强度，与Hg2+液加入后浓度为1μM时，获得的信号强度进行对比。其中Hg2+母液为硝酸汞溶液，Fe2+母液为硝酸亚铁溶液，Mn2+母液为硝酸锰溶液，Al3+母液为硝酸铝溶液，Fe3+母液为硝酸铁溶液，Ag+母液为硝酸银溶液，Cd2+母液为氯化镉溶液，Cu2+母液为硝酸铜溶液，Pb2+母液为草酸铅溶液，Zn2+母液为硝酸铅溶液，Mg2+母液为硝酸镁溶液，Ca2+母液为硝酸钙溶液。
2.将1-11号液相杂交反应后的溶液分别通入TP探针芯片中，利用全光纤倏逝波生物传感器进行检测TP探针芯片对不同金属离子的选择性，收集荧光信号，并进行结果分析，利用最强荧光信号值计算百分比信号值。百分比信号值(％)＝(待测金属离子的最强荧光信号值/1μM Hg2+的最强荧光信号值)×100％。
3、检测完成后分别用饱和尿素溶液、0.2％(质量百分含量)SDS水溶液洗涤使用后的TP探针芯片以去除靶标，使用高纯水和浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液(pH＝7.4)再生芯片。
结果如图3所示，发现11种金属离子相对于Hg2+的百分比信号值均小于10％，干扰性可以忽略，该探针芯片对于Hg2+检测具有良好的选择性。
四、浓度为10nM的汞离子(Hg2+)溶液的重复性检测
检测步骤如下：
1、将浓度为10μM的汞离子(Hg2+)溶液加入到含有300μL的含有AC-TQ的杂交液的试管中，其中浓度为10nM的汞离子(Hg2+)溶液的加入体积≤1％的含有AC-TQ的杂交液的体积，室温(20-30℃)静置8min进行液相杂交反应，得到液相杂交反应后的溶液，对照为加入等体积的蒸馏水替代浓度为10nM的汞离子(Hg2+)溶液。
2.将液相杂交反应后的溶液的通入TP探针芯片中，利用全光纤倏逝波生物传感器进行TP探针芯片对于汞离子(Hg2+)检测的重复性实验，共进行15次检测，收集荧光信号，并进行结果分析，利用最强荧光信号值计算百分比信号值。百分比信号值(％)＝(单次信号值/信号的平均值)×100％。
3、检测完成后分别用饱和尿素溶液、0.2％(质量百分含量)SDS水溶液洗涤使用后的TP探针芯片以去除靶标，使用高纯水和浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液(pH＝7.4)再生芯片。
结果如图4所示，TP探针芯片对于汞离子(Hg2+)检测具有很好的重复性。按上述检测步骤，重复对于浓度为10nM的Hg2+进行检测，18次实验的分析结果表明，数据具有良好的一致性，该探针芯片重复性好。
实施例3、饮用水中汞离子(Hg2+)的检测
一、制备TP探针芯片及生物传感器
制备方法同实施例1。
二、TP探针芯片的应用
含有AC-TQ的的杂交液的制备方法同实施例2。
含汞离子(Hg2+)饮用水的配制：取丹江口水库水，将其过0.22μm的过滤膜，得到过滤水；在1000mL过滤水加入浓度为1M的HNO3溶液调节pH至1，得到HNO3酸化水样，将浓度为100mg/L的汞离子(Hg2+)标准溶液(采用浓度为0.1M的硝酸溶液配制的汞离子(Hg2+)标准溶液)加入到HNO3酸化水样中，配置成汞离子(Hg2+)浓度梯度分别为0.21、0.41、0.83、1.67、3.34、6.67、10.0、13.34μM的HNO3酸化水样与33.33、40.0、43.33、46.67、50.0μM的HNO3酸化水样。
检测步骤：
1、分别向1-13号试管中各加入300μL的含有AC-TQ的杂交液，将含不同浓度汞离子(Hg2+)的HNO3酸化水样依次加入到1-13号含有300μL的含有AC-TQ的杂交液的试管中，其中含不同浓度汞离子(Hg2+)的HNO3酸化水样的加入体积均相同且≤1％的含有AC-TQ的杂交液的体积，室温(20-30℃)静置8min进行液相杂交反应，分别得到1-7号液相杂交反应后的溶液；14号为对照管，将等体积的HNO3酸化水样替代含不同浓度汞离子(Hg2+)的HNO3酸化水样，其它不变。
2、将1-14号液相杂交反应后的溶液分别通入TP探针芯片中，利用全光纤倏逝波生物传感器检测含不同浓度汞离子(Hg2+)的HNO3酸化水样中汞离子(Hg2+)的浓度，收集荧光信号，利用最强荧光信号值进行结果分析。
3、检测完成后分别用饱和尿素溶液、0.2％(质量百分含量)SDS水溶液洗涤使用后的TP探针芯片以去除靶标，使用高纯水和浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液(pH＝7.4)再生芯片。
结果如图5所示，以Hg2+浓度为0.21、0.41、0.83、1.67、3.34、6.67、10.0、13.34μM的HNO3酸化水样为横坐标，对应的荧光强度百分比为纵坐标拟合得到趋势线：在Hg2+的浓度在0nM to 10μM时，Y＝8.89x+5.01，R2＝0.98)；以Hg2+浓度为33.33、40.0、43.33、46.67、50.0μM的HNO3酸化水样为横坐标，对应的荧光强度百分比为纵坐标拟合得到趋势线：在Hg2+的浓度在40μM to 50μM时，表现为负相关线性关系(Y＝-7.58x+394.36，R2＝0.98)，具有很好的线性关系，表明该方法适用于实际水样检测。荧光强度百分比＝该浓度下的荧光强度/10.0μM下的荧光强度(最大荧光强度)×100％。使用实际水样，取得的结果与高纯水一致，并且利用ICP-MS检测该水样中Hg2+的含量，与本发明方法的实测结果一致。

Claims (9)

1.一种用于检测汞离子的荧光探针芯片的制备方法，包括如下步骤：
a)将基片表面的羟基进行活化；
b)将经步骤a)处理的基片表面进行硅烷化；
c)将经步骤b)处理的基片表面进行偶联化；
d)将名称为TP的单链DNA探针固定在经步骤c)处理的基片表面，所述固定的步骤如下：将所述经步骤c)处理的基片在名称为TP的单链DNA探针溶液中浸泡16～20小时，取出基片，依次进行清洗和干燥；所述TP为含有聚脱氧胸苷酸的单链DNA，所述单链DNA的端部修饰有氨基。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b)中，所述硅烷化的步骤如下：将经步骤a)处理的基片浸泡于硅烷化剂溶液中，室温静置10～60min，取出基片进行洗涤和干燥，在130℃～200℃下烘烤1～12h，得到表面硅烷化的基片；和/或，所述硅烷化溶液的溶质为3-氨丙基三乙氧基硅烷，溶剂为无水乙醇或丙酮，体积百分含量为2％～10％。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤d)中，所述名称为TP的单链DNA探针溶液由名称为TP的单链DNA、NaCl和Tris-HCl缓冲液组成，其中，所述名称为TP的单链DNA探针的浓度为200～400nM，所述NaCl的浓度为50～200mM，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10～50mM。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述聚脱氧胸苷酸中脱氧胸苷酸的个数为14～18，优选为16。
5.权利要求1-4中任一项所述的制备方法制备得到的荧光探针芯片。
6.一种用于检测汞离子的生物传感器，其特征在于：它包括权利要求5所述的荧光探针芯片。
7.一种基于“off-on-off”模式的汞离子的荧光检测方法，其特征在于：随着待测样品中的Hg2+的浓度逐渐增加，Hg2+首先与名称为TQ的标记了荧光淬灭基团的单链DNA形成T–Hg2 +–T结构，与TQ配对的名称为AC的标记了荧光基团的单链DNA以游离状态存在，随后所述AC与芯片表面固定的名称为TP的单链DNA探针发生杂交反应而被捕获，表现为芯片表面荧光逐渐增强，即“off–on”模式”；然后，随着Hg2+的浓度继续增加，剩余Hg2+与所述芯片上的探针TP形成T–Hg2+–T结构，而原在所述芯片上捕获的所述AC被取代，并从所述芯片表面离开，表现为荧光逐渐衰减，即“on–off”模式”；根据所述芯片所检测得到的荧光强度确定所述待测溶液中Hg2+的浓度。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)制备含有AC-TQ的杂交液；所述AC-TQ是由名称为AC的标记了荧光基团的单链DNA和名称为TQ的标记了荧光淬灭基团的单链DNA杂交而成的双链DNA，所述杂交液中不含游离状态AC；所述AC为含有聚脱氧腺苷酸的单链DNA，所述TQ为含有聚脱氧胸苷酸的单链DNA；
2)将待测样品与所述含有AC-TQ的杂交液进行Hg2+诱导形成T–Hg2+–T结构反应，得到反应液，将所述反应液与权利要求4所述的固定了DNA探针的荧光芯片进行杂交反应或者进行Hg2+诱导表面探针形成T–Hg2+–T结构变化，检测反应后芯片的荧光强度，根据所述荧光强度确定所述待测样品中汞离子的浓度。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述待测样品为环境水样。
CN201610795978.0A 2016-08-31 2016-08-31 基于“off‑on‑off ”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针芯片 Pending CN106383101A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610795978.0A CN106383101A (zh) 2016-08-31 2016-08-31 基于“off‑on‑off ”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针芯片

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610795978.0A CN106383101A (zh) 2016-08-31 2016-08-31 基于“off‑on‑off ”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针芯片

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106383101A true CN106383101A (zh) 2017-02-08

Family

ID=57938888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610795978.0A Pending CN106383101A (zh) 2016-08-31 2016-08-31 基于“off‑on‑off ”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针芯片

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106383101A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107162930A (zh) * 2017-06-13 2017-09-15 黄淮学院 用于识别超氧阴离子的荧光探针及其制备方法和应用、光纤探头及其制备方法
CN109182457A (zh) * 2018-09-25 2019-01-11 清华大学 制备高可再生核酸生物芯片的成套试剂及其在汞离子检测中的应用
CN112285078B (zh) * 2020-10-14 2023-04-25 安庆师范大学 一种基于智能dna水凝胶的汞离子现场检测新方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102031306A (zh) * 2010-11-04 2011-04-27 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于寡核苷酸链的汞离子荧光检测芯片、制作及使用方法
CN102912011A (zh) * 2012-08-24 2013-02-06 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg2+检测芯片及方法
CN104342760A (zh) * 2013-08-05 2015-02-11 清华大学 一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用
CN105087791A (zh) * 2015-08-11 2015-11-25 清华大学 基于t-t错配原理的汞离子的荧光检测方法及其应用
CN105296598A (zh) * 2015-12-08 2016-02-03 清华大学 基于8-17DNAzyme原理的铅离子荧光检测方法及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102031306A (zh) * 2010-11-04 2011-04-27 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于寡核苷酸链的汞离子荧光检测芯片、制作及使用方法
CN102912011A (zh) * 2012-08-24 2013-02-06 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg2+检测芯片及方法
CN104342760A (zh) * 2013-08-05 2015-02-11 清华大学 一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用
CN105087791A (zh) * 2015-08-11 2015-11-25 清华大学 基于t-t错配原理的汞离子的荧光检测方法及其应用
CN105296598A (zh) * 2015-12-08 2016-02-03 清华大学 基于8-17DNAzyme原理的铅离子荧光检测方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUAN DU 等: "Highly Sensitive and Selective Chip-Based Fluorescent Sensor for Mercuric Ion: Development and Comparison of Turn-On and Turn-Off Systems", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
SHITONG HAN: "Practical,highly sensitive,and regenerable evanescent-wave biosensor for detection of Hg2+ and Pb2+ in water", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107162930A (zh) * 2017-06-13 2017-09-15 黄淮学院 用于识别超氧阴离子的荧光探针及其制备方法和应用、光纤探头及其制备方法
CN109182457A (zh) * 2018-09-25 2019-01-11 清华大学 制备高可再生核酸生物芯片的成套试剂及其在汞离子检测中的应用
CN109182457B (zh) * 2018-09-25 2021-08-24 清华大学 制备高可再生核酸生物芯片的成套试剂及其在汞离子检测中的应用
CN112285078B (zh) * 2020-10-14 2023-04-25 安庆师范大学 一种基于智能dna水凝胶的汞离子现场检测新方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105087791B (zh) 基于t‑t错配原理的汞离子的荧光检测方法及其应用
Xu et al. Fluorescent ion-imprinted sensor for selective and sensitive detection of copper (II) ions
CN105296598B (zh) 基于8-17DNAzyme原理的铅离子荧光检测方法及其应用
Lu et al. Rapid and reliable determination of p-nitroaniline in wastewater by molecularly imprinted fluorescent polymeric ionic liquid microspheres
Chen et al. Random dsDNA-templated formation of copper nanoparticles as novel fluorescence probes for label-free lead ions detection
CN106383101A (zh) 基于“off‑on‑off ”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针芯片
Li et al. Colorimetric sensor strips for lead (II) assay utilizing nanogold probes immobilized polyamide-6/nitrocellulose nano-fibers/nets
CN102153700A (zh) 一种基于荧光比色变化检测汞离子的亲水性聚合物的制备及其应用
PL357431A1 (en) Method of obtaining a reagent-coated substrate, a reagent-coated substrate obtained thereby, analytical system for determining concentration of an analyte in a physiological specimen, as well as method of and set of equipment for detrmining concentration of an analyte in a physiological specimen
CN108398409B (zh) 一种荧光比率检测次氯酸根的方法
CN103709321A (zh) 增色检测Cu2+的罗丹明B基亲水聚合物探针及制备方法与应用
CN103389293B (zh) 一种二价汞离子的检测方法
CN106350069A (zh) 一种双发射比率荧光探针的构建方法及其应用
Güney et al. Metal ion templated chemosensor for metal ions based on fluorescence quenching
CN108152258A (zh) 一种检测待测溶液中氨基糖苷类抗生素的含量的方法
CN103087346A (zh) 一种Hg2+检测用印迹膜的制备方法
CN105319192A (zh) 一种水溶性荧光硅纳米粒子检测次氯酸根的方法
CN112782253A (zh) 一种定量检测高铁酸钾的方法
CN111635552A (zh) 腈菌唑分子印迹反蛋白石光子晶体水凝胶传感器的制备方法及应用
CN106872682A (zh) 一种检测汞离子的比色生物传感器及其制备方法
CN110273182B (zh) 一种三维反蛋白石聚合物光子晶体材料及其制备方法和应用
CN106518763A (zh) 一种高选择性比率式检测氰根离子的荧光探针及其合成方法与应用
CN106957321B (zh) 快速检测硫离子的络合物及其定量分析方法和应用
Qin et al. A novel chemosensor with visible light excitability for sensing CN− in aqueous medium and living cells via a Cu 2+ displacement approach
CN107501591B (zh) 一种双酚a分子印迹聚合物膜的制备与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170208

RJ01 Rejection of invention patent application after publication