CN103389293B

CN103389293B - 一种二价汞离子的检测方法

Info

Publication number: CN103389293B
Application number: CN201310319387.2A
Authority: CN
Inventors: 龙峰
Original assignee: Renmin University of China
Current assignee: Beijing Institute Of Collaborative Innovation; Yiwu Collaborative Innovation Holding Co.,Ltd.
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2013-07-26
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2033-07-26
Also published as: CN103389293A

Abstract

本发明公开了一种二价汞离子的检测方法。该方法检测汞离子的原理如下：荧光素修饰的单链DNA分子B含有与固定于探头表面的DNA捕捉探针（即单链DNA分子A）的互补序列，同时含有可与二价汞离子结合的T-T碱基错配结构。在检测时，荧光素修饰的单链DNA分子B与汞离子同时输入到倏逝波光纤传感探头表面，DNA捕捉探针将与二价汞离子通过竞争的方式与荧光素修饰的单链DNA分子B相结合。二价汞离子浓度越高，与倏逝波光纤传感探头上的DNA捕捉探针结合的荧光素修饰的单链DNA分子B越少，所以倏逝波光学检测平台检测到的荧光强度信号越小。本发明为食品、医学和环境领域的重金属汞离子的现场实时快速检测提供了一种有效手段。

Description

一种二价汞离子的检测方法

技术领域

本发明涉及一种二价汞离子的检测方法。

背景技术

汞是一种在自然界广泛存在的高毒性重金属污染物，如大气、水体及土壤等各种介质中都可能含有汞。环境中的汞来源于天然释放和人类活动。从局部污染来看，人为来源是相当重要的，主要包括：汞矿和其它金属的冶炼、固体废物的焚烧、氯碱工业和电器工业中的使用及矿物燃料的燃烧。环境中的汞主要以无机态和有机结合态两类形态存在，不同形态的汞毒性不同，其中甲基汞的毒性最大。汞可通过呼吸吸入、皮肤吸附或食物摄入等方式进入人体，造成脑肾损伤、细胞分裂障碍及中枢神经损害等。人类历史上最严重的汞中毒事件就是20世纪中叶发生在日本的水误病事件，加拿大、挪威及美国等也都发生由于环境中高浓度的汞而造成的汞中毒事件。为减少汞对公众的危害，美国环保局(USEPA)对饮用水的汞含量设定了一个强制标准，即10nM。

传统检测水体中汞离子的方法包括冷原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱法等。这些方法虽然检测结果准确、灵敏度高，但是需要昂贵而复杂的设备，样品处理耗时费力，使得它们不适合在线或实时现场检测。为克服这些限制，发展廉价、可现场快速检测汞离子的研究方兴未艾，其中各种传感分析技术最受关注，如基于小分子有机荧光分子、功能化薄膜、蛋白质、折叠式分子、核酸及金属纳米颗粒的色度传感器、电化学传感器及光学汞离子传感器等。然而，这些方法要么灵敏度不够高、特异性不足，要么设计和操作繁琐而不适宜汞离子的快速现场检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种二价汞离子（Hg²⁺）的检测方法，具有检测快速、操作简单等优点。

本发明所提供的检测Hg²⁺浓度的方法，包括如下步骤：

1）将表面修饰了单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头甲伸入到含一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B的系列不同浓度Hg²⁺的标准溶液中进行反应，使Hg²⁺与所述一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B上的T-T碱基错配结构通过离子键形成T-Hg²⁺-T复合物，并使未形成T-Hg²⁺-T复合物的所述一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B通过碱基互补配对的方式与所述单链DNA分子A相结合；

检测所述探头甲收集到的所述与所述单链DNA分子A相结合的所述一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B发出的荧光强度信号值；

建立所述标准溶液中Hg²⁺浓度与所述荧光强度信号值的函数关系式；

2）将所述表面修饰了单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头乙伸入到含一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B的待测溶液中进行反应，使Hg²⁺与所述单链DNA分子B上的T-T碱基错配结构通过离子键形成T-Hg²⁺-T复合物，并使未形成T-Hg²⁺-T复合物的所述一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B通过碱基互补配对的方式与所述单链DNA分子A相结合；

检测所述探头乙收集到的所述与所述单链DNA分子A相结合的所述一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B发出的荧光信号强度值X；

3）将所述荧光信号强度X代入所述函数关系式中，计算得到所述待测溶液中Hg²⁺浓度；

所述单链DNA分子B能与所述单链DNA分子A通过碱基互补配对而结合；所述单链DNA分子B上还含有能与Hg²⁺通过离子键形成T-Hg²⁺-T复合物的T-T碱基错配结构，形成T-Hg²⁺-T复合物的DNA分子B不能与单链DNA分子A通过碱基互补配对而结合。

所述倏逝波光纤传感探头为一种激发光以全反射的方式在其内传播、并在其界面产生倏逝波、激发结合到探头表面的荧光分子的探头。本发明的实施例中使用的倏逝波光纤传感探头是专利200610144103.0中实施例1制备得到的组合锥型光纤探头，也可为其它的倏逝波光纤传感探头。

在上述方法中，所述单链DNA分子B为序列表序列1所示的单链DNA分子。

在上述方法中，所述单链DNA分子A为序列表序列2和/或3所示的单链DNA分子。

在上述方法中，所述标准溶液和所述待测溶液中的所述一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B的浓度为10～50nmol/L（如10、20或50nmol/L）。

在上述方法中，所述反应的时间为2—10分钟（如2、4或10分钟）。

在上述方法中，所述标准溶液和所述待测溶液的溶剂为水。

在上述方法中，在步骤1）后、步骤2）前，还包括将所述表面修饰了单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头甲上的与所述单链DNA分子A相结合的所述一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B去除的步骤，获得所述探头乙；

所述去除具体可包括用pH为1.9的5g/L的SDS溶液清洗所述探头甲的步骤。

在上述方法中，所述表面修饰了单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头甲是按照包括如下步骤的方法得到的：

将所述倏逝波光纤传感探头表面硅烷化后，浸入含一末端经NH₂-(CH₂)_n-修饰的所述单链DNA分子A的溶液Ⅰ中，4℃反应；

所述倏逝波光纤传感探头侧壁的表面积与所述溶液Ⅰ中所述一末端经NH₂-(CH₂)_n-修饰的所述单链DNA分子A的浓度之比为41.4mm²:0.5μmol/L；

所述n为3—10，具体可为6。

本发明还提供一种检测Hg²⁺的试剂或试剂盒，含有序列表序列1所示的单链DNA分子，或含有一末端经荧光素修饰的序列表序列1所示的单链DNA分子。

在上述试剂或试剂盒中，还可含有序列表序列2和/或3所示的单链DNA分子,或含有一末端经NH₂-(CH₂)_n-修饰的序列表序列2和/或3所示的单链DNA分子，所述n为3—10，具体可为6。

在上述方法、试剂或试剂盒中，所述荧光素具体可为Cy5.5。

在上述方法、试剂或试剂盒中，所述一末端可为5’末端或3’末端。

本发明所提供方法检测汞离子的原理如下：荧光素修饰的单链DNA分子B含有与固定于探头表面的DNA捕捉探针（即单链DNA分子A）的互补序列，同时含有可与汞离子结合的T-T碱基错配结构。在检测时，荧光素修饰的单链DNA分子B与汞离子同时输入到光纤传感探头表面，DNA捕捉探针将与汞离子通过竞争的方式与荧光素修饰的单链DNA分子B相结合。汞离子浓度越高，与光纤传感探头上的DNA捕捉探针结合的荧光素修饰的单链DNA分子B越少，所以倏逝波光学检测平台检测到的荧光强度信号越小。

本发明将二价汞离子（Hg²⁺）能与DNA中错配的胸腺嘧啶-胸腺嘧啶（thymine-thymine，T-T）结构特异结合形成T-Hg²⁺-T复合物和便携式倏逝波光纤生物传感分析平台相结合，发明了一种基于DNA结构竞争的重金属汞离子生物传感器，其可以为食品、医学和环境领域的重金属汞离子的现场实时快速检测提供一种有效手段。由于其它金属不能与DNA错配T-T的结构结合形成特定的复合物，因此这种基于T-Hg²⁺-T复合物结构的传感器对汞检测具有高选择性。在便携式倏逝波光纤生物传感分析平台系统中，由于激发光以全反射的方式在光纤内传播，在其界面产生倏逝波，倏逝波随离界面的距离而成指数衰减，有效距离约为几十纳米至数百纳米。因此倏逝波可以激发结合到光纤传感探头表面的荧光分子（如标记在DNA或抗体上的荧光分子）。由于倏逝波渗入深度限制，其可以区分结合的荧光分子和未结合的荧光分子，因此在检测的过程中无须像其它检测方法所需的冲洗步骤。

实验证明，使用本发明方法检测汞离子的检测限最低为1.8nmol/L，其定量范围最大可达20—1000nmol/L，检测汞离子的回收率在90%以上，标准偏差为3.1%—5.3%，具有良好的准确性和精密度，可以用于实际样品Hg²⁺浓度的检测。

附图说明

图1为本发明实施例2检测二价汞离子的反应原理图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的倏逝波光纤传感探头为按照专利200610144103.0中实施例1制备得到的组合锥型光纤探头。

下述实施例中所用的倏逝波光纤传感分析平台的型号为JQ TPRA-P,购自北京金达清创环境科技有限公司。

下述实施例中所用的荧光素为Cy5.5。

实施例1、DNA捕捉探针的固定

DNA捕捉探针1：5’-NH₂-(CH₂)₆-TACAAACA-3’（序列表序列2）；

DNA捕捉探针2：5’-NH₂-(CH₂)₆-TACAAACAAA-3’（序列表序列3）；

将所述DNA捕捉探针1和2分别按照包括如下步骤的方法修饰于倏逝波光纤传感探头上：

1、探头的清洗

将倏逝波光纤传感探头浸入piraha溶液（浓H₂SO₄与H₂O₂水的体积比为3:1）中30min；然后放入超声波清洗仪中洗涤，并用超纯水进行充分清洗，直到清洗液的pH值为中性，最后在室温下用氮气吹干，保存于真空干燥箱中备用。

2、将经步骤1处理过的探头表面按照包括如下步骤的方法硅烷化：

将经步骤1处理过的探头放入含2％（体积百分含量）3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTS）的丙酮溶液中反应1h后，用99％（体积百分含量）的丙酮溶液清洗3次，放入5.0%（体积百分含量）的戊二醛溶液中，在37℃下反应1h后，用超纯水冲洗3次。

3、固定DNA捕捉探针

将经步骤2处理过的探头放入0.5μmol/L的DNA捕捉探针溶液中，浸入长度为6cm（由于探头的直径为220μm，浸入的侧表面积为41.4mm²），4℃反应过夜，用PBS冲洗后，用N₂吹干，获得表面修饰了序列表序列2或3所示单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头，将该探头在4℃冰箱保存备用。在使用前，为减少非特异性吸附，应将光纤传感探头放入2mg/mL牛血清白蛋白溶液中封闭30min。

实施例2、Hg²⁺的检测

一、Hg²⁺浓度与荧光信号强度的函数关系式的建立

1、将实施例1获得的表面修饰了序列表序列2所示单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头装入倏逝波光纤传感分析平台；

2、将已知Hg²⁺浓度分别为0、10、30、100、300和1000nmol/L的标准溶液（溶剂为水）中分别加入终浓度为20nmol/L的5’末端被荧光素修饰的序列表序列1所示的单链DNA分子B，再以300μL/min泵入样品池（池中装有表面修饰了序列表序列2所示单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头），时间为30s，并进一步反应4min；其反应原理如图1所示；

3、采集并记录荧光强度信号；

4、使用5g/L SDS溶液（用0.1M盐酸调pH至1.9）浸泡经步骤2处理过的探头1min，以去除探头表面结合的5’末端被荧光素修饰的序列表序列1所示的单链DNA分子B；并使用PBS缓冲液彻底清洗样品池，以进行下一个样品的检测。

5、以Hg²⁺浓度为自变量X（单位：nmol/L），荧光强度信号值为因变量Y（单位：mV），建立的函数关系式为：Y=1.1429-0.2938log₁₀(X)，R²=0.9901。以3倍信噪比计算，从函数关系式得到Hg²⁺检测限为2.0nmol/L，其定量范围分别10～600nmol/L。

二、检测待测溶液中的Hg²⁺浓度

为验证步骤一方法检测的效果，取实际水样（清华大学自来水）加入100nmol/L的Hg²⁺作为加标样品进行Hg²⁺浓度检测，具体方法和结果如下：

1、将300μL加标样品与300μL含40nmol/L的5’末端被荧光素修饰的序列表序列1所示的单链DNA分子B水溶液混合,以300μL/min泵入样品池（池中装有表面修饰了序列表序列2所示单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头），时间为30s，并进一步反应4min；

2、采集并记录荧光强度信号；

3、根据所获得的荧光强度信号和步骤一所获得的函数关系式，三次测得加标样品中Hg²⁺平均浓度为90nmol/L,即样品回收率为90％，平均标准偏差为3.5%。

实施例3、Hg²⁺的检测

一、Hg²⁺浓度与荧光信号强度的函数关系式的建立

1、将实施例1获得的表面修饰了序列表序列3所示单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头装入倏逝波光纤传感分析平台；

2、将已知Hg²⁺浓度分别为0、10、30、100、300和1000nmol/L的标准溶液（溶剂为水）中分别加入终浓度为20nmol/L的5’末端被荧光素修饰的序列表序列1所示的单链DNA分子B，再以300μL/min泵入样品池（池中装有表面修饰了序列表序列3所示单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头），时间为30s，并进一步反应4min；

3、与实施例2中步骤一中的3相同；

4、与实施例2中步骤一中的4相同；

5、以Hg²⁺浓度为自变量X（单位：nmol/L），经步骤2和3得到的对应荧光强度信号值为因变量Y（单位：mV），建立的函数关系式为：Y=1.2829-0.3348log₁₀(X)，R²=0.98073。以3倍信噪比计算，从函数关系式得到Hg²⁺检测限为5.2nmol/L，其定量范围分别20～1000nmol/L。

二、检测待测溶液中的Hg²⁺浓度

为验证步骤一方法检测的效果，取实际水样（清华大学自来水）加入200nmol/L的Hg²⁺作为加标样品进行Hg²⁺浓度检测，具体方法和结果如下：

1、将300μL加标样品与300μL含40nmol/L的5’末端被荧光素修饰的序列表序列1所示的单链DNA分子B水溶液混合,以300μL/min泵入样品池（池中装有表面修饰了序列表序列3所示单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头），时间为30s，并进一步反应4min；

2、采集并记录荧光强度信号；

3、根据所获得的荧光强度信号和步骤一所获得的函数关系式，三次测得样品中Hg²⁺平均浓度为188nmol/L,即样品回收率为94％，平均标准偏差为3.1%。

实施例4、Hg²⁺的检测

一、Hg²⁺浓度与荧光信号强度的函数关系式的建立

2、将已知Hg²⁺浓度分别为0、10、30、100、300和1000nmol/L的标准溶液（溶剂为水）中分别加入终浓度为10nmol/L的5’端被荧光素修饰的序列表序列1所示的单链DNA分子B，再以300μL/min泵入样品池（池中装有表面修饰了序列表序列2所示单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头），时间为30s，并进一步反应4min；

3、与实施例2中步骤一中的3相同；

4、与实施例2中步骤一中的4相同；

5、以Hg²⁺浓度为自变量X（单位：nmol/L），荧光强度信号值为因变量Y（单位：mV），建立的函数关系式为：Y=1.1148-0.2246log₁₀(X)，R²=0.9818。以3倍信噪比计算，从函数关系式得到汞离子检测限为1.8nmol/L，其定量范围分别10～400nmol/L。

二、检测待测溶液中的Hg²⁺浓度

1、与实施例2中步骤二中的1相同；

2、与实施例2中步骤二中的2相同；

3、根据所获得的荧光强度信号和步骤一所获得的函数关系式，三次测得样品中Hg²⁺平均浓度为196nmol/L,即样品回收率为98％，平均标准偏差为4.5%。

实施例5、Hg²⁺的检测

一、Hg²⁺浓度与荧光信号强度的函数关系式的建立

2、将已知Hg²⁺浓度分别为0、10、30、100、300和1000nmol/L的标准溶液（溶剂为水）中分别加入终浓度为50nmol/L的5’末端被荧光素修饰的序列表序列1所示的单链DNA分子B，再以300μL/min泵入样品池（池中装有表面修饰了序列表序列2所示单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头），时间为30s，并进一步反应4min；

3、与实施例2中步骤一中的3相同；

4、与实施例2中步骤一中的4相同；

5、以Hg²⁺浓度为自变量X（单位：nmol/L），荧光强度信号值为因变量Y（单位：mV），建立的函数关系式为：Y=1.4859-0.3418log₁₀(X)，R²=0.9806。以3倍信噪比计算，从函数关系式得到汞离子检测限为9.2nmol/L，其定量范围分别40～700nmol/L。

二、检测待测溶液中的Hg²⁺浓度

为验证步骤一方法检测的效果，取实际水样（清华大学自来水）加入300nmol/L的Hg²⁺作为加标样品进行Hg²⁺浓度检测，具体方法和结果如下：

1、与实施例2中步骤二中的1相同；

2、与实施例2中步骤二中的2相同；

3、根据所获得的荧光强度信号和步骤一所获得的函数关系式，三次测得样品中Hg²⁺平均浓度为290nmol/L,即样品回收率为96.7％，平均标准偏差为5.1%。

实施例6、Hg²⁺的检测

一、Hg²⁺浓度与荧光信号强度的函数关系式的建立

2、将已知Hg²⁺浓度分别为0、10、30、100、300和1000nmol/L的标准溶液（溶剂为水）中分别加入终浓度为20nmol/L的5’末端被荧光素修饰的序列表序列1所示的单链DNA分子B，再以300μL/min泵入样品池（池中装有表面修饰了序列表序列2所示单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头），时间为30s，并进一步反应2min；

3、与实施例2中步骤一中的3相同；

4、与实施例2中步骤一中的4相同；

5、以Hg²⁺浓度为自变量X（单位：nmol/L），荧光强度信号值为因变量Y（单位：mV），建立的函数关系式为：Y=1.1109-0.1239log₁₀(X)，R²=0.9923。以3倍信噪比计算，从函数关系式得到汞离子检测限为9.2nmol/L，其定量范围分别30～400nmol/L。

二、检测待测溶液中的Hg²⁺浓度

1、与实施例2中步骤二中的1相同；

2、与实施例2中步骤二中的2相同；

3、根据所获得的荧光强度信号和步骤一所获得的函数关系式，三次测得样品中Hg²⁺平均浓度为180nmol/L,即样品回收率为90％，平均标准偏差为3.7%。

实施例7、Hg²⁺的检测

一、Hg²⁺浓度与荧光信号强度的函数关系式的建立

2、将已知Hg²⁺浓度分别为0、10、30、100、300和1000nmol/L的标准溶液（溶剂为水）中分别加入终浓度为50nmol/L的5’末端被荧光素修饰的序列表序列1所示的单链DNA分子B，再以300μL/min泵入样品池（池中装有表面修饰了序列表序列2所示单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头），时间为30s，并进一步反应10min；

3、与实施例2中步骤一中的3相同；

4、与实施例2中步骤一中的4相同；

5、以Hg²⁺浓度为自变量X（单位：nmol/L），荧光强度信号值为因变量Y（单位：mV），建立的函数关系式为：Y=1.3536-0.2367log₁₀(X)，R²=0.9912。以3倍信噪比计算，从函数关系式得到汞离子检测限为2.5nmol/L，其定量范围分别15～600nmol/L。

二、检测待测溶液中的Hg²⁺浓度

1、与实施例2中步骤二中的1相同；

2、与实施例2中步骤二中的2相同；

3、根据所获得的荧光强度信号和步骤一所获得的函数关系式，三次测得样品中Hg²⁺平均浓度为280nmol/L,即样品回收率为93.3％，平均标准偏差为5.3%。

实施例1—7的结果表明，本发明的方法具有良好的准确性和精密度，可以用于实际样品Hg²⁺浓度的检测。

Claims

1.一种检测Hg²⁺浓度的方法，包括如下步骤：

1)将表面修饰了单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头甲伸入到含一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B的系列不同浓度Hg²⁺的标准溶液中进行反应，使Hg²⁺与所述一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B上的T-T碱基错配结构通过离子键形成T-Hg²⁺-T复合物，并使未形成T-Hg²⁺-T复合物的所述一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B通过碱基互补配对的方式与所述单链DNA分子A相结合；

2)将所述表面修饰了单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头乙伸入到含一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B的待测溶液中进行反应，使Hg²⁺与所述单链DNA分子B上的T-T碱基错配结构通过离子键形成T-Hg²⁺-T复合物，并使未形成T-Hg²⁺-T复合物的所述一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B通过碱基互补配对的方式与所述单链DNA分子A相结合；

3)将所述荧光信号强度X代入所述函数关系式中，计算得到所述待测溶液中Hg²⁺浓度；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述单链DNA分子B为序列表序列1所示的单链DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述单链DNA分子A为序列表序列2和/或3所示的单链DNA分子。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述标准溶液和所述待测溶液中的所述一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B的浓度为10～50nmol/L。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述反应的时间为2—10分钟。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述标准溶液和所述待测溶液的溶剂为水。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在步骤1)后、步骤2)前，还包括将所述表面修饰了单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头甲上的与所述单链DNA分子A相结合的所述一末端经荧光素修饰的单链DNA分子B去除的步骤，获得所述探头乙；

所述去除为用pH为1.9的5g/L的SDS溶液清洗所述探头甲的步骤。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述表面修饰了单链DNA分子A的倏逝波光纤传感探头甲是按照包括如下步骤的方法得到的：

所述n为3-10。

9.一种检测Hg²⁺的试剂或试剂盒，其特征在于：含有一末端经荧光素修饰的序列表序列1所示的单链DNA分子。

10.根据权利要求9所述的试剂或试剂盒，其特征在于：含有序列表序列2和/或3所示的单链DNA分子，或含有一末端经NH₂-(CH₂)_n-修饰的序列表序列2和/或3所示的单链DNA分子，所述n为3-10。