CN113933281B

CN113933281B - 一种基于光纤倏逝波荧光生物传感器的外泌体检测方法

Info

Publication number: CN113933281B
Application number: CN202111521834.3A
Authority: CN
Inventors: 朱龙佼; 许文涛; 李舒婷; 杜再慧
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-12-14
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2041-12-14
Also published as: CN113933281A

Abstract

本发明提供一种基于光纤倏逝波荧光生物传感器的外泌体检测方法，包括：（1）外泌体‑信号探针结合体系，（2）S‑EWFB检测分析体系。本发明对信号探针进行双标记，一端修饰信号分子，一端修饰疏水分子，通过疏水相互作用将双标记的信号探针嵌入外泌体膜上，使得一个外泌体表面连接多个信号分子，进一步利用光纤表面修饰了特异性适配体的倏逝波传感平台对反应样品进行荧光信号的实时监测与分析。本发明以光纤倏逝波荧光检测仪为终端检测平台，实现了对外泌体的简单、快速、实时、高灵敏的连续定量检测。不仅如此，本发明提供的光纤检测平台具有良好的表面再生能力。

Description

一种基于光纤倏逝波荧光生物传感器的外泌体检测方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于光纤倏逝波荧光生物传感器的外泌体检测方法。

背景技术

外泌体被认为是一种很有前途的生物标志物，用于疾病的无创诊断和治疗。外泌体纳米级的粒径以及在体液中的低浓度使得外泌体的定量检测具有挑战性。目前，商业化方法（酶联免疫吸附试验、免疫印迹和聚合酶链式反应）需要复杂的程序或昂贵的仪器。而各种新型的生物传感平台，如表面增强拉曼散射、表面等离子体共振等，仍然受到繁琐的步骤、复杂的技术、无法用于连续的现场实时检测的限制。侧流层析法虽然操作简便，但检出限高。因此，构建简单、灵敏、便携、易于使用的外泌体定量检测方法是十分必要的。

倏逝波荧光生物传感器（EWFBs）利用倏逝波来激发与指定目标成比例的表面荧光基团的荧光。EWFB的检测包括表面再生过程在内只需要几分钟，这使得EWFBs适合连续检测。由于倏逝波的穿透深度有限，EWFBs具有很高的灵敏度和直接检测光纤表面生物分子相互作用的能力。此外，EWFBs还具有抗电磁干扰、高度集成和现场测量便携性等优点。迄今为止，EWFBs已被用于检测环境污染物、病原体和其他各种靶标，但尚未有关于外泌体检测的报道。

发明内容

本发明的目的是开发一种基于光纤倏逝波荧光生物传感器的外泌体检测方法。

为了实现本发明目的，设计了外泌体-信号探针结合体系进行外泌体与信号分子的一对多结合，并在锥形光纤表面修饰外泌体特异性适配体序列，将结合有信号探针的外泌体与锥形光纤孵育，通过光纤倏逝波荧光检测仪进行实时检测，最终成功构建了一种基于光纤倏逝波荧光生物传感器的外泌体检测新方法。

一方面，本发明提供一种基于光纤倏逝波荧光生物传感器的外泌体检测方法，包括：（1）外泌体-信号探针结合体系，（2）S-EWFB检测分析体系。

所述外泌体-信号探针结合体系是指信号探针与外泌体通过相互作用结合；

优选地，相互作用为疏水相互作用；

所述信号探针为双标记的信号探针；

所述S-EWFB检测分析体系包括锥形石英光纤以及光纤倏逝波荧光检测仪；

所述锥形石英光纤表面通过共价键修饰了外泌体特异性适配体序列和短链核酸序列；

所述锥形石英光纤可再生；

所述外泌体特异性适配体序列用来特异性捕获带有信号探针的外泌体，进而通过光纤倏逝波荧光检测仪实现检测；

优选地，适配体序列为外泌体膜上CD63蛋白特异性序列；

所述短链核酸序列用来调整所述外泌体特异性适配体序列在光纤表面的修饰密度。

另一方面，本发明提供外泌体检测方法用到的双标记的信号探针，包括：信号分子、寡核苷酸序列和疏水分子；

所述信号分子是能在倏逝波的激发下产生强的荧光信号的分子；

优选地，在675 nm激发波长激发下可以发射荧光的物质；

优选地，Cy5.5荧光基团；

所述寡核苷酸序列能够发挥连接作用，两端分别标记信号分子和疏水分子；

优选地，寡核苷酸序列为SEQ ID NO：1；

所述疏水分子包括可以通过疏水相互作用嵌入到磷脂双层膜内的小分子物质；

优选地，胆固醇分子。

另一方面，本发明提供上述外泌体检测方法的检测条件：

外泌体-信号探针结合体系中，双标记的信号探针的浓度为50~150 nM；具体地，为100 nM；

外泌体-信号探针结合反应过程包括：25~37℃、避光孵育30~120 min；具体地，所述外泌体-信号探针结合反应过程包括：37℃、避光孵育60 min。

S-EWFB检测分析过程包括：先将缓冲液通入所述光纤倏逝波荧光检测仪10~15 s、反应5~10 s进行基线校准，随后通入外泌体-信号探针结合反应产物25~30 s、反应40~45 s进行样品测定，随后通入再生液 (0.5% SDS，pH为1.9) 20~25 s进行光纤表面再生，最后通入缓冲液20~25 s进行清洗。具体地，所述S-EWFB检测分析过程包括：先将缓冲液通入所述光纤倏逝波荧光检测仪10 s、反应5 s进行基线校准，随后通入外泌体-信号探针结合反应产物25 s、反应40 s进行样品测定，随后通入再生液 (0.5% SDS，pH为1.9) 20 s进行光纤表面再生，最后通入缓冲液20 s进行清洗。

另一方面，本发明提供了一种利用前述检测方法对外泌体进行定量检测的方法，包括如下步骤：

SI：制作标准曲线：

将外泌体溶液10倍梯度稀释，构建具有不同外泌体浓度的外泌体-信号探针结合体系，结合与S-EWFB检测分析步骤与前述检测步骤相同；

以外泌体浓度的对数为横坐标，阳性样品的荧光信号强度与空白对照样品的荧光信号强度的比值为纵坐标，绘制标准曲线；

SII：按照前述检测方法对待测样品进行检测，将获得的待测样品的荧光信号强度与空白对照样品的荧光信号强度的比值代入标准曲线，计算得到待测样品中外泌体的含量，实现对外泌体的定量检测。

SIII：实验中用到的核酸序列为：

双标记的信号探针：5’-Cy5.5-CTCTCTCTCTCTCTCTTTTT-Cholesteryl-3’（SEQ IDNO.1）；

外泌体特异性适配体序列：5’-NH₂-(CH₂)₆-CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA-3’（SEQ ID NO.2）

短链核酸序列：5’-NH₂-AAAAAAAAAA-3’（SEQ ID NO.3）

其中，NH₂为核酸序列上修饰的与光纤表面共价结合的分子，(CH₂)₆为间隔分子。

SIIII：确定线性范围为47.5~4.75×10⁶ 粒子/mL，y = 0.1045x + 1.0153，R² =0.9908，检测限为7.66 粒子/mL，从而可实现对外泌体的定量检测。

另一方面，本发明还提供与上述方法配套的检测试剂盒。

包括：（1）外泌体-信号探针结合体系；（2）S-EWFB检测分析体系；

所述外泌体-信号探针结合体系是信号探针与外泌体通过疏水相互作用结合；

优选的，信号探针为双标记的信号探针；

优选的，S-EWFB检测分析体系包括锥形石英光纤以及光纤倏逝波荧光检测仪；

进一步优选的，锥形石英光纤表面通过共价键修饰了外泌体特异性适配体序列和短链核酸序列；

进一步优选的，锥形石英光纤可再生；

优选的，双标记的信号探针包括：信号分子、寡核苷酸序列和疏水分子；

进一步优选的，信号分子是能在倏逝波的激发下产生强的荧光信号的分子；

进一步优选的，寡核苷酸序列能够发挥连接作用，两端分别标记信号分子和疏水分子；

进一步优选的，疏水分子包括可以通过疏水相互作用嵌入到磷脂双层膜内的小分子物质。

进一步优选的，S-EWFB检测分析体系为，先将缓冲液通入光纤倏逝波荧光检测仪10~15 s、反应5~10 s进行基线校准，随后通入双标记的信号探针结合反应产物25~30 s、反应40~45 s进行样品测定，随后通入再生液20~25 s进行光纤表面再生，最后通入缓冲液20~25 s进行清洗。

进一步优选的，外泌体特异性适配体序列如SEQ ID NO：2所示；优选的，所述短链核酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明试剂盒的检测分析原理：首先外泌体与双标记的信号探针共孵育，双标记的信号探针通过疏水相互作用插入到外泌体膜上，使得外泌体表面连接上多个信号分子；将反应后的样品通入光纤倏逝波荧光检测仪中，检测仪样品池中的锥形石英光纤表面修饰的外泌体特异性适配体序列与外泌体特异性识别并结合，将带有大量信号分子的外泌体捕获在光纤表面，形成外泌体@信号探针-适配体夹心结构，进而使得外泌体表面的信号分子靠近光纤表面，在倏逝波的激发下产生强的荧光信号，并被仪器实时测定。

具体检测方法如下：

1）外泌体-信号探针结合：向浓度为50~150 nM的双标记的信号探针溶液中加入外泌体溶液于25~37 ℃条件下避光孵育30~120 min；

2）S-EWFB检测分析：向光纤倏逝波荧光检测仪的样品池中依次通入缓冲液10-15s、反应5-10 s进行基线校准，通入反应样品溶液25-30 s、反应40-45 s进行样品测定，通入再生液20~25 s进行光纤表面再生，最后通入缓冲液20~25 s进行清洗。整个过程的荧光信号变化都被仪器实时测定。

其中，步骤2）所述S-EWFB检测分析体系缓冲液的配方为：1×PBS缓冲液（含137 mMNaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na₂HPO₄、1.4 mM KH₂PO₄,），pH为7.38；所述再生液配方为：0.5%SDS，pH为1.9。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明通过建立一种基于光纤倏逝波荧光生物传感器的外泌体检测方法，用于外泌体的简单、快速、实时、高灵敏的连续定量检测。通过胆固醇分子与磷脂双层膜之间的疏水相互作用将双标记的信号探针连接在外泌体表面，反应产物直接通入光纤倏逝波荧光检测仪的样品池中（含外泌体特异性适配体序列修饰的锥形石英光纤）进行荧光信号的实时测定，提供了一种外泌体定量检测的新方法。使外泌体的检测操作更加简单快速、要求更低、灵敏度更高、且不依赖于大型仪器、并可以连续的在线实时检测。

（一）本方法利用疏水相互作用将双标记的信号探针与外泌体相连，与适配体-配体相互作用相比，疏水相互作用不受外泌体膜表面特定配体数量的限制，并且胆固醇是一种小分子物质，可以减少适配体与配体相互作用造成的空间位阻，允许一个外泌体连接更多的探针，实现更强的信号放大，提高检测灵敏度。另外，疏水相互作用所需的反应条件比适配体-配体相互作用所需的反应条件要求更低更温和。

（二）光纤表面特异性适配体的修饰使反应过程无需分离纯化，简化了操作步骤。

（三）光纤倏逝波荧光检测仪功能集成、结构微缩，基于光纤倏逝波荧光生物传感器的方法，可以实现外泌体的在线实时测定，且不依赖于大型仪器。

（四）光纤具有良好的表面再生能力，可以实现外泌体的连续检测。

（五）本方法整个检测过程只需两步：孵育和测定，耗时约1小时，操作简单、快速。

附图说明

图1为外泌体检测原理。

图2为锥形石英光纤表面共价修饰外泌体特异性适配体序列的过程。

图3为外泌体检测可行性。

图4为检测条件优化结果；图A为阳性样品与空白对照荧光信号强度的比值随双标记的信号探针浓度的变化；图B为阳性样品与空白对照荧光信号强度的比值随外泌体特异性适配体与短链核酸浓度比值的变化；图C为荧光信号强度随双标记的信号探针与外泌体孵育时间的变化。

图5为对10倍浓度梯度稀释的外泌体进行检测的结果；图A为荧光信号曲线随外泌体浓度的变化；图B为阳性样品与空白对照荧光信号强度的比值随外泌体浓度对数的变化的线性拟合曲线。

图6为光纤可再生性验证结果。

图7为检测方法选择性验证结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中，缓冲液配方为：1×PBS缓冲液（含137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mMNa₂HPO₄、1.4 mM KH₂PO₄,），pH为7.38；再生液配方为：0.5% SDS，pH为1.9。

实施例1 一种基于光纤倏逝波荧光生物传感器的外泌体检测方法的建立

1、实验材料

冻干外泌体标准品、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS）、柠檬酸、柠檬酸钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、牛血清白蛋白（BSA）、戊二醛等。

实验中用到的核酸序列如下：

注：NH₂为核酸序列上修饰的与光纤表面共价结合的分子；

(CH₂)₆为间隔分子。

2、一种基于光纤倏逝波荧光生物传感器的外泌体检测方法的设计原理

通过胆固醇分子与磷脂双层膜之间的疏水相互作用将双标记的信号探针连接在外泌体表面，反应产物直接通入光纤倏逝波荧光检测仪的样品池中，锥形石英光纤表面修饰的外泌体特异性适配体序列与外泌体特异性识别并结合，将带有大量信号分子的外泌体捕获在光纤表面，进而使得外泌体表面的信号分子靠近光纤表面，在倏逝波的激发下产生强的荧光信号，并被仪器实时测定（图1）。

3、光纤表面外泌体特异性适配体序列的修饰

首先将锥形石英光纤浸泡在新鲜配制的食人鱼溶液 (V浓H₂SO₄：VH₂O₂=3：1) 中1h，去除可能的污染物并引入羟基；随后将光纤浸泡在2% (v/v) 的APTS/甲苯溶液中2 h，使光纤表面形成氨基；然后在1% v/v的戊二醛水溶液中浸泡过夜，引入醛基；再将光纤浸入200 nM外泌体特异性适配体序列和200 nM短链核酸序列溶液中 (短链核酸序列用来调整适配体序列在光纤表面的修饰密度，避免适配体序列在光纤表面修饰不均一) 3 h，将适配体共价固定在光纤表面（图2）。

4、对外泌体检测可行性的验证

将浓度为100 nM的双标记的信号探针分别与含有一定浓度外泌体的阳性样品、1×PBS缓冲液（含137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na₂HPO₄、1.4 mM KH₂PO₄，pH为7.38）、不含外泌体的阴性样品进行混合，于37℃条件下避光孵育60 min，获得反应产物，将反应产物通入光纤倏逝波荧光检测仪中进行荧光信号的测定。由图可知PBS缓冲液无特定的荧光信号产生，阴性样品产生较弱的荧光信号响应，阳性样品荧光信号显著增强，结果表明，所建立的检测方法用于检测外泌体具有可行性（图3）。

实施例2 检测条件优化结果

将不同浓度的双标记的信号探针与浓度为2.4×10³ 粒子/mL的外泌体混合，于37℃条件下避光孵育90 min后，通入光纤倏逝波荧光检测仪中进行荧光信号的测定。由图可知双标记的信号探针浓度为100 nM时，阳性样品与空白对照样品的荧光信号强度的比值是最高的（图4A）。保持外泌体特异性适配体序列与短链核酸序列的总浓度 (400 nM) 不变，用含不同浓度比例的外泌体特异性适配体序列与短链核酸序列的溶液修饰锥形光纤后，依次放入光纤倏逝波荧光检测仪的样品池中；将浓度为100 nM的双标记的信号探针与浓度为2.4×10³ 粒子/mL的外泌体混合，于37℃条件下避光孵育90 min后，通入光纤倏逝波荧光检测仪中进行荧光信号的测定。由图可知外泌体特异性适配体序列浓度与短链核酸序列的浓度均为200 nM (1：1) 时，阳性样品与空白对照样品的荧光信号强度的比值是最高的（图4B）。将浓度为100 nM的双标记的信号探针与浓度为2.4×10³ 粒子/mL的外泌体混合，于37℃条件下避光孵育不同的时间后，通入光纤倏逝波荧光检测仪中进行荧光信号的测定。由图可知孵育时间为60 min时，荧光信号值是最高的（图4C）。因此，最优的检测条件为：双标记的信号探针浓度为100 nM、外泌体特异性适配体与短链核酸浓度比为1：1、双标记的信号探针与外泌体的孵育时间为60 min。

实施例3 检测方法的灵敏度测定

根据上述优化体系，将外泌体溶液10倍浓度梯度稀释，将浓度为100 nM的双标记的信号探针与不同浓度的外泌体混合，于37℃条件下避光孵育60 min后，通入光纤倏逝波荧光检测仪中进行荧光信号的测定。由图可知荧光信号随外泌体浓度的升高而升高（图5A），以外泌体浓度的对数为横坐标，阳性样品的荧光信号强度与空白对照样品的荧光信号强度的比值为纵坐标，绘制标准曲线：y = 0.1045x + 1.0153，R² = 0.9908（图5B），对外泌体检测的线性范围为47.5 - 4.75×10⁶ 粒子/mL，检测限为7.66 粒子/mL。

实施例4 光纤的可再生性验证

根据上述优化体系，将浓度为100 nM的双标记的信号探针与浓度为2.4×10⁶ 粒子/mL的外泌体混合，于37℃条件下避光孵育60 min后，通入光纤倏逝波荧光检测仪中进行荧光信号的测定；将同一光纤进行连续60次的测定（每一次测定都重复相同的过程：先将缓冲液通入光纤倏逝波荧光检测仪10 s、反应5 s进行基线校准，随后通入外泌体-信号探针结合反应产物25 s、反应40 s进行样品测定，随后通入再生液20 s进行光纤表面再生，最后通入缓冲液20 s进行清洗）。由图可知即使经过60次表面再生循环，检测信号仍保持稳定，说明光纤具有杰出的表面再生能力和可重复利用性（图6）。

实施例5 检测方法的选择性验证

根据上述优化体系，分别将等体积的HepG2和AML-12细胞上清液稀释1000倍后作为待测样品与浓度为100 nM的双标记的信号探针混合，于37℃条件下避光孵育60 min后，通入光纤倏逝波荧光检测仪中进行荧光信号的测定。由图可知正常细胞和癌细胞的荧光信号均高于空白对照，并且癌细胞的荧光信号高于正常细胞，说明癌细胞和正常细胞都能分泌外泌体，而癌细胞分泌的更多，这与理论相符，结果表明，所建立的检测方法能很好的区分癌细胞和非癌细胞来源的外泌体，具有良好的选择性（图7）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种基于光纤倏逝波荧光生物传感器的外泌体检测方法

<130> KHP181111559.2

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctctctctct ctctcttttt 20

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caccccacct cgctcccgtg acactaatgc ta 32

<210> 3

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaaaaaaaa 10

Claims

1.一种基于光纤倏逝波荧光生物传感器的外泌体检测方法，其特征在于，包括：（1）外泌体-信号探针结合体系；（2）S-EWFB检测分析体系；

所述外泌体-信号探针结合体系是指信号探针与外泌体通过疏水相互作用结合，允许一个外泌体连接更多的信号探针，实现外泌体与信号探针的一对多结合，放大输出信号；

所述信号探针为双标记的信号探针；

双标记的信号探针包括：信号分子、寡核苷酸序列和疏水分子；

所述疏水分子包括可以通过疏水相互作用嵌入到磷脂双层膜内的小分子物质;

所述锥形石英光纤可再生；

所述外泌体特异性适配体序列用来特异性捕获带有信号探针的外泌体，形成夹心结构，进而通过光纤倏逝波荧光检测仪直接实现外泌体的检测，无需分离纯化；

2.根据权利要求1所述的外泌体检测方法，其特征在于，双标记的信号探针浓度为50~150 nM。

3.根据权利要求1所述的外泌体检测方法，其特征在于，双标记的信号探针结合反应条件为25~37 ℃、避光孵育30~120 min。

4.根据权利要求1所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述S-EWFB检测分析体系为，先将缓冲液通入光纤倏逝波荧光检测仪10~15 s、反应5~10 s进行基线校准，随后通入双标记的信号探针结合反应产物25~30 s、反应40~45 s进行样品测定，随后通入再生液20~25 s进行光纤表面再生，最后通入缓冲液20~25 s进行清洗。

5.根据权利要求1-4任一所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述外泌体特异性适配体序列如SEQ ID NO：2所示。

6.根据权利要求1-4任一所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述短链核酸序列如SEQ ID NO：3所示。

7.根据权利要求5所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述短链核酸序列如SEQ IDNO：3所示。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的外泌体检测方法在荧光生物传感器中检测外泌体的应用。

9.一种外泌体检测试剂盒，包含根据权利要求1-7任一所述的外泌体检测方法所使用的试剂。