CN111521782A - 一种高特异性的外泌体分离、检测及富集方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物体检测技术领域，具体是一种高特异性的外泌体分离、检测及富集方法：构建一种只有当外泌体膜上的磷脂双分子层和相应膜蛋白同时存在才能触发的核酸扩增反应，实现高特异性的外泌体检测，并借助磁珠将其富集。优点为：1、解决了传统基于适配体或者抗原抗体的外泌体检测方法，在实际应用过程中均有可能被外界环境中游离的外泌体膜蛋白，如CD63蛋白，CD9蛋白等所触发，使得最终所检测的信号并不一定能够完全真是反应外泌体的数量的问题。2、显著提高了外泌体检测和分离的特异性，降低了外界环境中游离的外泌体膜蛋白对外泌体检测的干扰，同时保证了外泌体检测的较高灵敏度。

Description

一种高特异性的外泌体分离、检测及富集方法

技术领域

本发明涉及生物体检测技术领域，具体地说，是一种高特异性的外泌体分离、检测及富集方法。

背景技术

外泌体是细胞内溶酶体微粒(endolysosomal vesicle)内陷形成多囊泡体(multi-vesicular body)与细胞膜融合后，向胞外分泌的大小均一、直径在40～100nm的囊泡。外泌体可携带多种蛋白质、mRNA、miRNA、胆固醇和鞘磷脂等物质，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。外泌体由于具有能反应其亲本细胞的生理和功能状态，在血液、尿液等体液中含量较为丰富且高度稳定，容易无创获取标本等优点，是理想的潜在生物标志物分子源。正因如此，基于外泌体的检测技术引起了越来越多研究者的关注。

目前为止，关于外泌体检测的方法可以大致分为基于抗原抗体的外泌体检测技术和基于适配体技术的外泌体检测技术。

基于抗原抗体反应的外泌体检测技术主要包括ELISA和免疫亲和捕获法。这两种方法均是基于外泌体膜上常见的特异性表面蛋白(抗原)和体外加入的标记抗体之间高度特异性免疫亲和相互作用的检测外泌体数量的技术。多种外泌体膜上的蛋白包括：CD63，CD9，热休克蛋白(HSC70,HSP90)等均可用于进行标记外泌体。在这些标记物中，CD63抗体由于在外泌体表面高效表达而广泛运用于外泌体的分离。基于此，Yoon-Tae Kang构建了一种能够从人血液样本中捕获和释放循环外泌体的微流体装置。这个微流控由两个截然不同的免疫模式层组成，能够通过产生机械涡流来增加抗体与外泌体之间结合的机会，从而实现高通量的外泌体高分离度特异性。这个方法阐明外泌体在癌症患者中功能方面的巨大潜力，可应用于基于外泌体的癌症研究，增强了外泌体在癌症诊断中的临床意义。

基于适配体的外泌体检测技术同样是基于适配体与外泌体膜表面的蛋白之间的高特异性识别来实现检测。与免疫方法相比，基于适配体的外泌体检测技术能够将蛋白信号转换成核酸信号，从而依靠核酸扩增手段或者其他核酸信号方法提高外泌体检测的灵敏度。例如基于适配体和外泌体的特异性结合关系，Dong,H.L及其课题组使用PSMA(前列腺特异性膜抗原)适配体-磁珠生物结合物来捕获源自LNCaP(人前列腺癌细胞)的外泌体，然后将外泌体检测转换为核酸检测。因为在电极表面上直接使用适配体很难将检测外泌体的信号进行放大处理。所以该课题组将三种信使DNA(mDNA)与在磁珠上修饰的PSMA适配体杂交，用来捕获源自LNCaP细胞的肿瘤外泌体。在目标外泌体存在下，适配体识别并结合外泌体膜上的PSMA，并释放mDNA。磁分离后，释放的mDNA留在上清液中。然后，基于循环酶促扩增的电化学方法被用于检测释放的mDNA。因为一个适配体与三个mDNA杂交，所以一个外泌体/适配体杂交体会释放三个mDNA，外泌体检测信号也会放大三倍。此外，将核酸外切酶Ⅲ辅助的靶标回收策略与多信使DNA(mDNA)相结合，也可以进一步地放大信号，外泌体的数量与mDNA的数量呈正相关函数关系。此测定法可用于检测复杂生物样品中的肿瘤外泌体，并且，灵敏度极高，最低可以在浓度为70粒每微升的溶液中检测到信号。同样的，Huang,L及其课题组通过适配体特异性结合从而将外泌体检测转化为荧光检测，进而通过双重信号放大实现了外泌体高精度精准测量。首先，该课题组开发了一个荧光生物传感平台，即双信号放大，用于超敏检测白血病细胞来源的外泌体。该方案包括三个步骤:首先，用抗CD63抗体修饰磁珠偶联物(MB-CD63)捕获含有CD63和核苷的白血病衍生外泌体；然后，一个包含核蛋白识别适配体(AS1411)的DNA引物被应用于结合外泌体，进一步启动了滚环扩增(RCA)反应，产生许多重复序列，用于与金纳米颗粒(GNP)-DNA-荧光染料(FAM)结合(GNP-DNA-FAM)；最后，引发核酸内切酶(Nb·BbvCI)辅助靶材回收。因此，FAM从GNP-DNA-FAM结合物中释放，由猝灭状态转化为发射状态，荧光信号不断积累。这种检测方法基于双重信号放大平台，使得浓度低至1×10²个粒子每微升的溶液都可以准确地检测出外泌体，并且该方法不存在样品基质效应，在复杂生物样品中也具有较高的灵敏性和特异性。

尽管这些方法在外泌体检测中均取得了较大的进展，但仍然在存在不足：1.无论是基于抗原抗体反应的免疫学检测手段，还是利用适配体与外泌体膜蛋白之间高特异性识别结合的核酸检测手段，在实际应用过程中均有可能被外界环境中游离的外泌体膜蛋白，如CD63蛋白，CD9蛋白等所触发。因此，最终所检测的信号并不一定能够完全真是反应外泌体的数量。因此如何能够解决这种问题对于提高外泌体检测甚至外泌体分离意义重大。2.单纯通过外泌体膜上的蛋白质来实现外泌体检测，缺乏对外泌体膜上其他结构成分的表征，因此使检测结果不具说服性。

针对上述缺陷，发明人构建了一种只有当外泌体膜上的磷脂双分子层和相应膜蛋白同时存在才能触发的核酸扩增反应，实现高特异性的外泌体检测，并借助蛋白连接的磁珠将其富集，具体是适配体-胆固醇介导的邻近结扎测定法(AcmPLA)，以实现外泌体的高特异性鉴定和定量。本方法使用了两种经过特殊设计的探针，一种在5'末端带有CD63适配体，以专门识别膜CD63蛋白，另一种在5'末端带有胆固醇标记的探针插入脂质双层，然后进行邻近结扎和原位滚动圈扩增(RCA)。通过邻近结扎和RCA的整合，我们证明了干扰信号大大降低，因此对外泌体检测具有很高的特异性，同时确保了高灵敏度。

关于本发明一种高特异性的外泌体分离、检测及富集方法目前还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种高特异性的外泌体分离、检测及富集方法。

本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供一个检测、分离与富集外泌体的探针组合。

本发明的第三个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述探针组合的应用。

本发明的第四个目的是针对现有技术的不足，提供一种试剂盒。

本发明的第五个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述试剂盒的应用。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种高特异性的外泌体分离、检测及富集方法，包括如下步骤：

(1)外泌体的分离与检测：1)探针序列的设计：CD63适配体探针、胆固醇探针、连接子探针和骨干探针，CD63适配体探针序列如SEQ ID NO:1所示、胆固醇探针序列如SEQ IDNO:2所示、连接子探针序列如SEQ ID NO:3所示、骨干探针序列如SEQ ID NO:4所示；2)离心细胞培养上清液或血清样品，得到粗制的外泌体样本；3)使用CD63适配体探针与外泌体表面的CD63蛋白结合，胆固醇探针锚固在脂质双层中；4)连接子探针充当接头，与胆固醇探针中的连接序列L1和CD63适配体探针中的连接序列L2杂交形成邻近连接，形成一个与胆固醇探针和CD63适配体探针中主链序列区B1和B2序列杂交的骨架的封闭环；5)最后，通过邻近连接触发的RCA获得了ssDNA产物；

(2)外泌体的富集：将CD9蛋白抗体连接至磁珠表面，构建得到抗CD9 MB，使用直径为1μm的抗CD9 MB、浓度为0.5ug/ml的抗CD9MB、捕获时间为40min，富集得到外泌体。

优选地，所述胆固醇探针的结构分区为：间隔子S1、主链序列区B1和连接序列L1；所述CD63适配体探针的结构分区为：间隔子S2、主链序列区B2和连接序列L2，所述间隔子S1和S2的长度是15nt。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一个检测、分离及富集外泌体的探针组合，包括CD63适配体探针、胆固醇探针、连接子探针和骨干探针，CD63适配体探针序列如SEQ ID NO:1所示、胆固醇探针序列如SEQ IDNO:2所示、连接子探针序列如SEQ ID NO:3所示、骨干探针序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，所述胆固醇探针的结构分区为：间隔子S1、主链序列区B1和连接序列L1；所述CD63适配体探针的结构分区为：间隔子S2、主链序列区B2和连接序列L2，所述间隔子S1和S2的长度是15nt。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的探针组合在制备检测、分离与富集外泌体的试剂盒中的应用。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

一种试剂盒，包括CD63适配体探针、胆固醇探针、连接子探针和骨干探针，CD63适配体探针序列如SEQ ID NO:1所示、胆固醇探针序列如SEQ ID NO:2所示、连接子探针序列如SEQ ID NO:3所示、骨干探针序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，所述胆固醇探针的结构分区为：间隔子S1、主链序列区B1和连接序列L1；所述CD63适配体探针的结构分区为：间隔子S2、主链序列区B2和连接序列L2，所述间隔子S1和S2的长度是15nt。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的试剂盒在检测、分离与富集外泌体中的应用。

胆固醇在动物细胞膜中嵌在细胞膜的磷脂双层之间，使细胞膜结构富有流动性。胆固醇就是固醇的一类，也是最重要的一种固醇。它是细胞膜的重要成分，它嵌在细胞膜的磷脂双层之间，使细胞膜结构富有流动性。对于维持正常的细胞功能有着重要作用，比如营养的进入和废物的排出、信息的传递、免疫反应的发生等。

本发明中的胆固醇探针的构建主要是考虑到两个层面，而这两个层面均是建立在胆固醇分子能够插入到磷脂双分子层的前提下进行的。这两个层面主要是第一个：探针链的长度，长度是来保证该探针能够与周边的适配体探针连接的，因此发明人在设计的时候在第一部分就设计了一个铰链区，这部分就是来控制和调整探针的长度；其次是探针的结构，及探针的组成部分。

本发明中所涉及到的寡核苷酸序列见表1。

表1.寡核苷酸序列表

本发明优点在于：

1、构建当外泌体表面磷脂双分子层和相应的膜蛋白同时存在才能出现响应信号的外泌体检测技术，并利用磁珠分离外泌体，实现外泌体高特异性检测分离一体化。

2、通过整合邻近连接测定和基于抗CD9 MBs的外泌体富集，同时鉴定生物脂质层和CD63蛋白将大大减少由游离CD63蛋白触发的非特异性荧光信号。由于其简单性和高原位扩增效率，RCA扩增被用于增加荧光信号。除了基于RCA的信号放大外，抗CD9介导的外泌体富集进一步提高了灵敏度。最后，我们将AcmPLA方法的鉴定原理和质量与几种先前开发的策略进行了比较。结果表明，与常规方法相比，本发明的方法具有灵敏度和选择性高的优点。

附图说明

附图1是整个实验设计的思路，a是通过两个靶标进行检测能够提高特异性，b是整个实验的操作的具体流程；c是两个探针(CD63适配体探针和胆固醇探针)的具体结构分区，d是ACMPLA的原理。

附图2是外泌体提取和探针识别研究的结果，其中，a：TEM图像显示提取的外泌体呈扁平的圆形；b：NTA结果表明，分离的外泌体的直径在78nm-240nm之间变化；c：考虑到CD63适配体探针和胆固醇探针的结合亲和力是决定AcmPLA标记效率的关键因素，分别用外泌体测试了FAM标记的CD63适配体探针和FAM标记的胆固醇探针；d：外泌体对CD63适配体探针和胆固醇探针均显示完全阳性模式(++)；e：与外泌体温育40分钟后，FAM标记的适配体探针没有观察到明显的荧光强度增加，对于FAM标记的胆固醇探针，与外泌体孵育50分钟后，荧光强度没有显示出明显的增加，两种探针孵育时间的差异(40分钟和50分钟)与CD63蛋白相比，是由于脂质体双层在脂质体膜上的比例更大，考虑到在40分钟的孵育后所获得的胆固醇适配体的荧光强度几乎比适配体探针的荧光强度高两倍，这足以进行后续的连接，因此在以下测试中我们选择40分钟作为实验孵育时间，为了研究每种探针的结合不是针对靶外泌体的相同受体，我们进行了适配体结合竞争试验，在该测试中，将FAM标记的探针和其他未标记的探针同时应用于靶标外泌体；f：显示两种探针均存在时的荧光强度与单独存在时相比无显着差异，这表明两种探针均未显示出与另一种探针的竞争，换句话说，CD63适配体探针和胆固醇探针可以分别与外泌体表面的CD63适配体和脂质双层结合，从而可以在AcmPLA中进行以下应用，以准确鉴定外泌体。

附图3是AcmPLA的优化，其中，a：当两个探针在没有连接子的情况下同时存在时，在电泳中未观察到连接；b：使用两种方法：离心和抗CD9 MB来富集外泌体，从而去除未结合的探针；c：通过离心和抗CD9 MB两种方法获得的富集的外泌体的荧光强度没有显著差异；d：将具有不同大小的抗CD9 MB用于外泌体捕获，其外表面用适配体探针标记，可以清楚地看到，直径为1μm的抗CD9 MB在PBS洗涤后显示出更高的荧光强度；e：随着抗体浓度的增加，荧光强度逐渐增加，并达到0.5μg/ml的峰值，因此，最合适的CD9抗体浓度确定为0.5μg/ml；f：结果表明，荧光强度在0分钟-40分钟之间显着增加，而增加量在40分钟后下降，因此，磁珠捕获外泌体的最佳时间是40分钟。

附图4是AcmPLA用于外泌体鉴定，a:从共聚焦结果可以看出，通过AcmPLA方法获得了几个绿色荧光罐；b：荧光强度与外泌体的对数值线性相关，范围为10³-10⁷个颗粒/μl；c：确定获得的荧光强度与外泌体数量之间的相关方程为Y＝468.2lg(Exo)-698.2(R2＝0993)；d：为了验证所有探针，特别是AcmPLA过程中的连接探针和主链对于准确鉴定外泌体至关重要，我们在存在或不存在连接探针和主链的情况下，检测AcmPLA的荧光强度，如果仅存在CD63适配体探针，则在提取的外泌体上观察到较低的荧光信号；e：获得了相同的荧光结果，证实了AcmPLA是准确鉴定和定量外泌体的重要决定因素；f、g：提取的外泌体预先稀释为10⁶颗粒/μl，然后与重组CD63蛋白一起孵育，将具有四个成分(Apt探针(CD63适配体探针)，Cho探针(胆固醇探针)，连接子探针和骨干探针)的相同标记程序应用于外泌体和CD63混合物，之后，使用共聚焦显微镜和荧光分光光度计对外泌体混合物进行表征，通过共聚焦显微镜和荧光分光光度计可以清楚地识别出目标外泌体，并获得更高的FAM信号增益，而外泌体和CD63混合物中未观察到明显的荧光增强，表明AcmPLA可以避免外泌体鉴定中的CD63干扰，因此导致高度特异性；h：为了进一步研究提出的方法进行外泌体鉴定的选择性，我们比较了NTA，提出的方法和我们以前建立的方法的外泌体识别能力，结果表明，当系统中存在游离的重组CD63时，NTA的检测结果和所提出的方法与没有CD63的检测结果没有显着差异，但是，通过前一种方法存在CD63时，荧光信号显着增加。

附图5是提取的外泌体的WB结果。

附图6是MBs的TEM结果。

附图7是磁珠链抗体琼脂糖电泳结果。

附图8是前一种方法的方案示意图。

附图9是AcmPLA在临床标本中的应用。(a)使用NTA和AcmPLA检测健康人和肺癌患者的外泌体。(b)NTA与AcmPLA在外泌体鉴定中的回归分析拟合曲线。数据以均数±标准差表示，n＝10个样本重复。

附图10是两组探针的检测效果，结果表明两组探针的检测效果相似，无明显统计学差异。

附图11是不同间隔子长度的结果：当间隔子长度为15nt时能达到较好的检测效果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1预实验

1实验材料

化学品、细胞系和试剂

表1中的所有寡核苷酸序列均购自上海桑贡生物工程技术与服务有限公司(中国上海)。Tris-borate EDTA缓冲液，DNA染色凝胶红色，30％聚丙烯酰胺，DPEC水，Dulbecco的PBS，BSA，TMMED和APS购自上海三原生物工程技术与服务有限公司(中国上海)。T4 DNA连接酶，T4多核苷酸激酶，Phi29 DNA聚合酶和RiboLockRNase抑制剂购自赛默飞世尔科技有限公司(中国北京)。在含有10％胎牛血清(Hyclone)和1％青霉素-链霉素(Hyclone)的RPMI1640培养基(Hyclone)中，在5％CO₂气氛下于37℃培养A549细胞系。从A549细胞获得上清细胞培养物。共焦图像由LSM 780SYSTEM(德国蔡司)捕获，并使用JEM-1400PLUS透射电子显微镜(日本JEOL)观察。纳米颗粒跟踪分析由NanoSight NS300(英国马尔文)进行。本研究中使用的其他化学药品(分析纯)是从标准试剂供应商处获得的。荧光强度通过Infinite200PRO(瑞士Tecan)测量。

2实验方法

2.1细胞培养和外泌体分离

将A549细胞(来自非小细胞肺癌细胞系)在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中培养，并保持在37℃、5％CO₂的湿润气氛中。对于EV分离，当细胞达到70％汇合时，我们用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞3次，并在无FBS的培养基中再保持12小时。然后根据标准差速离心分离方案，通过超速离心收集培养基用于EV分离。最后，进行了透射电子显微镜(TEM)，纳米颗粒跟踪分析和流式细胞仪分析，以表征这些分离EV。

2.2外泌体的表征

分离的细胞外囊泡用几种方法表征。通过NTA分析浓度和尺寸分布，其使用Nanosight NS300，随后进行操作。TEM成像是使用日本JEOL的JEM-1400PLUS进行的。通过蛋白质印迹法(HSP90，HSP90，TSG101，CD9，CD63，CD81)和流式细胞仪(CD9，CD63，CD81，CytofIex S4，Beckman，USA)分析EV的特征蛋白。另外，将提取的EV用PKH67染色10分钟(PKH67试剂盒，Sigma，USA)，然后用胎牛血清终止反应。通过100,000g的超速离心分离染色的EV。分离后，将EV与A549细胞共培养12小时，然后通过共聚焦显微镜观察。

2.3缓冲液中邻近连接测定的构建

首先通过在PBS缓冲液中的液面凝胶来验证邻近连接测定。将CD63适配体探针，胆固醇探针，连接子探针和骨干探针(1μM)在1DPBS-Mg缓冲液中以1μM的浓度分别加热至95℃，并冷却至室温。然后将它们在1.5mL试管中混合在一起，在室温下进行30分钟的接近连接。将T4 DNA连接酶加入混合物中，并在室温下孵育1小时。Page gel(1％)在90V下于4℃运行100分钟，并用GelRed染色溶液染色。

2.4外泌体的成像和荧光检测

将外泌体与500nM的CD63适配体探针，胆固醇探针和抗CD9 MBs在冰上含20％FBS的100μL结合缓冲液中孵育40分钟。用磁铁富集20分钟后，捕获的抗CD9 MBs外泌体用1mL洗涤缓冲液洗涤两次，或以1000rpm离心3分钟，然后重悬于100μL结合缓冲液中。之后，将2μM连接探针，1μM骨架和2μM探针与外泌体再孵育60分钟，并使用洗涤缓冲液洗涤两次。然后通过共聚焦显微镜测试获得的样品。除去上清液中的游离探针后，使用Infinite 200 PRO测量荧光强度。

2.5 NTA，AcmPLA和我们以前的方法精确鉴定外泌体的比较

使用常规NTA，AcmPLA和我们以前的方法进行比较测试，以直接检测提取的外泌体。将相同浓度的分离的外泌体样品(主要浓度)稀释至3×10⁵颗粒/μl，分成6个试管。其中三个与游离的CD63蛋白混合。后来将这三种方法用于外泌体检测。

以上所述“我们以前的方法”参照文献：Analytical and BioanalyticalChemistry https://doi.org/10.1007/s00216-019-02211-4，Rapid and sensitiveexosome detection with CRISPR/Cas12a，Xianxian Zhao1&Wenqing Zhang1&XiaopeiQiu1&Qiang Mei3&Yang Luo2&Weiling Fu1，Received:10August 2019/Revised:8October2019/Accepted:10October 2019，#Springer-Verlag GmbH Germany,partofSpringerNature 2020。

大意是：报告一种基于CD63适配体和聚类规则间隔短链的外泌体检测方法回文重复(CRISPR)/Cas12a系统。该方法主要是基于外体膜蛋白识别关于CD63适配体和基于CRISPR/Cas12a的信号放大。CD63适配体是一种很容易适应的核酸而CRISPR/Cas12a则负责将外泌体的数量转化为核酸检测负责高特异性核酸信号的扩增。方法的检测范围确定为3×10³⁶每微升×10⁷粒。此外，我们还成功地将这一方法应用于检测来自这两个国家的临床样本中的外泌体对肺癌患者和健康人的检测结果与纳米颗粒检测结果高度一致跟踪分析。总的来说，该方法为外泌体的检测提供了一种高灵敏度和特异性的方法通向未来基于外泌体的疾病诊断的途径。

3数据分析

每个测试至少重复三个独立的重复，显示为平均值±标准差(SD)。数据使用GraphPad Prism 8.0(美国加利福尼亚州)软件可视化。t检验用于分析两组之间的比较。使用单向方差分析和最小显着差异法。

以下实施例2-实施例5均采用实施例1中的实验材料。

以下实施例2-实施例5均是先对其按照实施例1中的方法操作，然后再分别按照其对应的方法操作。

实施例2系统设计与运行机制

1实验方法

采用适配体-胆固醇介导的邻近结扎测定法(AcmPLA)来特异性捕获外泌体表面蛋白并缩小非特异性背景信号。

在提出的策略中，将细胞培养上清液(CCS)或血清样品离心以除去不想要的颗粒。获得的未精制上清液由外泌体、游离蛋白和其他一些生物成分组成。然后，将CD9抗体标记的磁珠(抗CD9 MBs)用于在磁体下捕获和组装CD9阳性生物成分。为了实现准确的外泌体识别，AcmPLA中使用了三种活性成分。第一个是分别具有三个功能域的两个单链DNA(ssDNA)：CD63适配体探针(Apt探针)和胆固醇探针(Cho探针)。在胆固醇探针中，可以插入脂质双层的胆固醇被标记在探针的5'末端，然后是一个铰链区(用来控制核酸链的长度)，用于结构空间位阻减少(S1)，是后续邻近连接相关的RCA(B1)的骨架序列区域)，以及邻近连接的连接顺序(L1)。CD63适配体探针与胆固醇探针共有三个功能域：间隔子(S2)，主链序列区(B2)和连接序列(L2)，并在5'末端用CD63适配体标记。第二个是ssDNA接头(连接子)，可通过互补DNA杂交来帮助连接胆固醇探针和CD63适配体探针中的连接序列(L1和L2)。第三个组件是RCA的骨干，仅在CD63适配体探针和胆固醇探针与连接子连接的情况下才会启动。

因此，详细的AcmPLA涉及三个步骤：在第一步中，CD63适配体与外泌体表面的CD63蛋白结合，胆固醇探针锚固在脂质双层中。考虑到外泌体膜的迁移性，连接子可充当接头，通过在步骤2中与L1和L2序列杂交形成邻近连接，从而形成一个与胆固醇探针和CD63适配体探针中的B1和B2序列杂交的骨架的封闭环。最后，通过邻近连接触发的RCA获得了很长的ssDNA产物。荧光探针(Reporter探针)的3'末端标记有FAM，可以在步骤3中与ssDNA产物杂交。

2结论

AcmPLA可以对外泌体进行高特异性和灵敏的鉴定，同时检测脂质双层和表面蛋白(例如CD63)可减少对游离外泌体表面蛋白的干扰，邻近相关的RCA具有良好的敏感性，并且将CD9抗体磁珠(抗CD9 MBs)进一步附着以捕获外泌体以进行分离，并提供进一步的信号富集。

实施例3外泌体提取和探针识别研究

1实验方法

(1)为了研究AcmPLA是否可以用于准确的外泌体鉴定，我们将提取的外泌体作为简单模型，这些提取的外泌体是通过差速离心从A549细胞CCS获得的。使用TEM和NTA对分离的外泌体进行了严格的表征，以进行形态观察，并使用western blotting进行蛋白质验证。由NTA确定的直径分布中的115nm的峰值与先前文献一致。我们随后通过蛋白质印迹检测了分离的外泌体和A549细胞表面表达的蛋白质(CD9/CD63/CD81)。

(2)考虑到适配体探针和胆固醇探针的结合亲和力是决定AcmPLA标记效率的关键因素，我们分别用外泌体测试了FAM标记的CD63适配体探针和FAM标记的胆固醇探针(图2c)。为了避免未结合的探针产生不希望的荧光结果，我们去除了上清液，离心后用PBS洗涤两次。

(3)为了研究每种探针的结合不是针对靶外泌体的相同受体，我们进行了适配体结合竞争试验。在该测试中，将FAM标记的探针和其他未标记的探针同时应用于靶标外泌体。

2实验结果

(1)AcmPLA是否可以用于准确的外泌体鉴定结果：TEM图像显示提取的外泌体呈扁平的圆形(图2a)。NTA结果表明，分离的外泌体的直径在78nm至240nm之间变化(图2b)。表明NSCLC外泌体中几种外泌体特异性标志物(CD9，CD63和CD81)的水平高于A549细胞，而在阴性对照中未观察到明显的蛋白表达。

(2)分别用外泌体测试了FAM标记的CD63适配体探针和FAM标记的胆固醇探针结果：外泌体对CD63适配体探针和胆固醇探针均显示完全阳性模式(++)(图2d)。值得注意的是，去除上清液后，胆固醇探针组的FAM荧光强度比适配体探针组高得多，这表明胆固醇探针插入脂质双层的可能性更高，这可以解释为脂质双层占很大的比例在外泌体膜上为了优化每种探针的外泌体结合时间，我们在与外泌体孵育不同时间后检测了每种探针的荧光强度(500nM)。如图2e所示，与外泌体温育40分钟后，FAM标记的适配体探针没有观察到明显的荧光强度增加。对于FAM标记的胆固醇探针，与外泌体孵育50分钟后，荧光强度没有显示出明显的增加。两种探针孵育时间的差异(40分钟和50分钟)与CD63蛋白相比，是由于脂质体双层在脂质体膜上的比例更大。考虑到在40分钟的孵育后所获得的胆固醇适配体的荧光强度几乎比适配体探针的荧光强度高两倍，这足以进行后续的连接，因此在以下测试中我们选择40分钟作为实验孵育时间。

(3)适配体结合竞争实验结果：图2f所示，两种探针均存在时的荧光强度与单独存在时相比无显著差异，这表明两种探针均未显示出与另一种探针的竞争。换句话说，CD63适体探针和胆固醇探针可以分别与外泌体表面的CD63适体和脂质双层结合，从而可以在AcmPLA中进行以下应用，以准确鉴定外泌体。

实施例4AcmPLA的优化

1实验方法

(1)是否可以在没有外泌体的情况下触发建立的邻近结扎测定方法，也是准确鉴定外泌体的关键因素。因此，我们研究了是否可以形成邻近连接测定法，从而触发PBS溶液中的RCA。

(2)可以使用两种方法富集外泌体，从而去除未结合的探针：离心和抗CD9 MB(图3b)。CD9蛋白抗体已成功连接至磁珠表面，以构建抗CD9 MB。为了研究两种方法中哪一种更适合外泌体富集，我们利用它们来富集外泌体，该外泌体与FAM标记的CD63适配体探针在表面连接，并检测PBS洗涤前后的荧光强度。其中离心条件为：1000g/5min；100000g/2h。

(3)为了优化MB的大小，将具有不同大小的抗CD9 MB用于外泌体捕获，其外表面用适配体探针标记。然后，我们优化了MBs上标记的抗CD9的浓度，外泌体捕获时间，以实现更好的外泌体检测性能。作为这种方法的重要组成部分，抗CD9 MBs复合物不仅与外泌体的捕获有关，而且在随后的信号富集中也起着至关重要的作用。与MBs连接的CD9抗体的浓度是外泌体捕获的重要因素。因此，我们首先研究了通过与不同浓度的CD9抗体连接的MB捕获外泌体的效率。之后，我们研究了捕获外泌体的时间。

2实验结果

(1)如图3a所示，当两个探针在没有连接子探针的情况下同时存在时，在电泳中未观察到连接。此外，当连接子探针存在于PBS溶液中时，也没有连接，表明两个探针很难相互杂交，连接子探针也难以将两个探针连接到PBS溶液中。值得注意的是，连接子探针，Apt探针(CD63适配体探针)和Cho探针(胆固醇探针)混合泳道中连接子键的消失可能归因于连接子探针与单个探针的杂交。即使电泳显示没有目标外泌体的情况下也很少存在连接，但应移动未结合的探针以减少可能的背景信号。

(2)可以清楚地看到，通过两种方法获得的富集的外泌体的荧光强度没有显着差异(图3c)。考虑到抗CD9 MBs介导的外泌体富集是可逆的，并且更适用于以下鉴定和定量，因此将抗CD9 MBs用于外泌体捕获程序。

(3)可以清楚地看到，直径为1μm的抗CD9 MB在PBS洗涤后显示出更高的荧光强度(图3d)。图3e显示，随着抗体浓度的增加，荧光强度逐渐增加，并达到0.5ug/ml的峰值。因此，最合适的CD9抗体浓度确定为0.5ug/ml。实验结果表明，荧光强度在0分钟至40分钟之间显着增加，而增加量在40分钟后下降。因此，磁珠捕获外泌体的最佳时间是40分钟(图3f)。

实施例5AcmPLA用于外泌体鉴定

1实验方法

(1)为了研究AcmPLA工艺是否可用于准确的外泌体鉴定，将CCS提取的外泌体用作样品。之后，我们将提出的方法用于外泌体定量。值得注意的是，提取的外泌体预先用NTA定量，并稀释成不同的浓度。为了验证所有探针，特别是AcmPLA过程中的连接子探针和主链对于准确鉴定外泌体至关重要，我们在存在或不存在连接子探针和主链的情况下，检测AcmPLA的荧光强度。此外，当其他三个探针中的任何一个都不存在时，没有观察到显着的荧光增强。当四个探针同时存在时，观察到明显的荧光，表明四个探针的同时存在对于AcmPLA是必不可少的。

(2)接下来，当游离重组CD63蛋白存在时，我们进一步检查了AcmPLA是否可以选择性地识别目标外泌体。提取的外泌体预先稀释为10⁶颗粒/μl，然后与重组CD63蛋白一起孵育。将具有四个成分(Apt探针，Cho探针，连接子探针和骨干探针)的相同标记程序应用于外泌体和CD63混合物。之后，使用共聚焦显微镜和荧光分光光度计对外泌体混合物进行表征。为了进一步研究提出的方法进行外泌体鉴定的选择性，我们比较了NTA，提出的方法和我们以前建立的方法的外泌体识别能力。

(3)为了进一步研究AcmPLA在检测临床血清样本中的外泌体方面的临床应用，收集了健康个体和NSCLC患者的血液样本。在5000g下离心10分钟后，从血液样本中获得血浆，并通过0.22um过滤器过滤。最终，收集了四个血清样品。使用AcmPLA和NTA分别检测了每个样品中的外泌体。预处理的血清样品通过NTA进一步超速离心和定量，而AcmPLA检测相同的无超速离心的血清样品，并通过图4c所示的校准方程式计算外泌体浓度。结果显示，AcmPLA检测到的血清外泌体的量也与NTA结果保持高度一致性(R2＝0.932)，表明该方法在临床标本检测中具有很高的应用潜力。

2实验结果

(1)研究AcmPLA工艺是否可用于准确的外泌体鉴定结果：从共聚焦结果(图4a)可以看出，通过AcmPLA方法获得了几个绿色荧光罐。如图4b所示，荧光强度与外泌体的对数值线性相关，范围为10³-10⁷个颗粒/μl。确定获得的荧光强度与外泌体数量之间的相关方程为Y＝468.2lg(Exo)-698.2(R2＝0993)(图4c)。如果仅存在CD63适配体探针，则在提取的外泌体上观察到较低的荧光信号(图4d)。在图4e中也获得了相同的荧光结果，证实了AcmPLA是准确鉴定和定量外泌体的重要决定因素。

(2)当游离重组CD63蛋白存在时，AcmPLA是否可以选择性地识别目标外泌体结果：通过共聚焦显微镜和荧光分光光度计可以清楚地识别出目标外泌体，并获得更高的FAM信号增益，而外泌体和CD63混合物中未观察到明显的荧光增强(图4f，4g)，表明AcmPLA可以避免外泌体鉴定中的CD63干扰。因此导致高度特异性。结果表明，当系统中存在游离的重组CD63时，NTA的检测结果和所提出的方法与没有CD63的检测结果没有显着差异。但是，通过前一种方法存在CD63时，荧光信号显着增加(图4h)。

实施例6探针优化试验

1实验方法

(1)优化探针序列。根据探针设计原则，考虑到G-C和A-T之间连接力的差异，我们在原有探针的基础上设计进行增减A-T核酸序列的量(PROBE-2)，以实现优化核酸探针的目的。其次，我们优化了间隔子探针序列的长度(5nt,10nt,15nt,20nt)。

(2)判断效果。按照之前的实验思路进行试验，通过荧光强度的高低判断探针的优劣。

2实验结果

(1)两组探针的检测效果见图10，结果表明两组探针的检测效果相似，无明显统计学差异。

(2)不同间隔子长度的结果见图11：当间隔子长度为15nt时能达到较好的检测效果。

本发明构建当外泌体表面磷脂双分子层和相应的膜蛋白同时存在才能出现响应信号的外泌体检测技术，并利用磁珠分离外泌体，实现外泌体高特异性检测分离一体化。通过整合邻近连接测定和基于抗CD9 MBs的外泌体富集，同时鉴定生物脂质层和CD63蛋白，大大减少了由游离CD63蛋白触发的非特异性荧光信号。由于其简单性和高原位扩增效率，RCA扩增被用于增加荧光信号。除了基于RCA的信号放大外，抗CD9介导的外泌体富集进一步提高了灵敏度。最后，我们将AcmPLA方法的鉴定原理和质量与几种先前开发的策略进行了比较。结果表明，与常规方法相比，本方法具有灵敏度和选择性高的优点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市中医医院

<120> 一种高特异性的外泌体分离、检测及富集方法

<130> /

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atatacaccc cacctcgctc ccgtgacact aatgctattt tttttttttt ttgacgctaa 60

tagttaagac gctt 74

<210> 2

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaccctaagc atacatgctc actgacgcta ggtttttttt ttttttatat gacagaacta 60

gacactctt 69

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gttctgtcat atttaagcgt cttaa 25

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctattagcgt ccagtgaatt atacccggtc gcttctttat gccgtcaaga gtgtcta 57

<210> 5

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atatacaccc cacctcgctc ccgtgacact aatgctattt tttttttttt ttgacgttaa 60

tagttaagat actt 74

<210> 6

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaccctaagc atacatgctc actgacgcta ggtttttttt tttttttata tgacagaact 60

agacactctt 70

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gttctgtcat atttaagcat cttaa 25

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctattagcgt ccagtgaatt atacccggtc gcttctttat gccgtcaaga atgtcta 57

Claims (8)

1.一种高特异性的外泌体分离、检测及富集方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)外泌体的分离与检测：1)探针序列的设计：CD63适配体探针、胆固醇探针、连接子探针和骨干探针，CD63适配体探针序列如SEQ ID NO:1所示、胆固醇探针序列如SEQ ID NO:2所示、连接子探针序列如SEQ ID NO:3所示、骨干探针序列如SEQ ID NO:4所示；2)离心细胞培养上清液或血清样品，得到粗制的外泌体样本；3)使用CD63适配体探针与外泌体表面的CD63蛋白结合，将胆固醇探针锚固在脂质双层中；4)连接子探针充当接头，与胆固醇探针中的连接序列L1和CD63适配体探针中的连接序列L2杂交形成邻近连接，形成一个与胆固醇探针和CD63适配体探针中的主链序列区B1和B2序列杂交的骨架的封闭环；5)最后，通过邻近连接触发的RCA获得了ssDNA产物；

(2)外泌体的富集：将CD9蛋白抗体连接至磁珠表面，构建得到抗CD9 MB，使用直径为1μm的抗CD9 MB、浓度为0.5ug/ml的抗CD9MB、捕获时间为40min，富集得到外泌体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胆固醇探针的结构分区为：间隔子S1、主链序列区B1和连接序列L1；所述CD63适配体探针的结构分区为：间隔子S2、主链序列区B2和连接序列L2，所述间隔子S1和S2的长度是15nt。

3.一个检测、分离与富集外泌体的探针组合，其特征在于，包括CD63适配体探针、胆固醇探针、连接子探针和骨干探针，CD63适配体探针序列如SEQ ID NO:1所示、胆固醇探针序列如SEQ ID NO:2所示、连接子探针序列如SEQ ID NO:3所示、骨干探针序列如SEQ ID NO:4所示。

4.根据权利要求3所述的探针组合，其特征在于，所述胆固醇探针的结构分区为：间隔子S1、主链序列区B1和连接序列L1；所述CD63适配体探针的结构分区为：间隔子S2、主链序列区B2和连接序列L2，所述间隔子S1和S2的长度是15nt。

5.权利要求3-4任一所述的探针组合在制备检测、分离与富集外泌体的试剂盒中的应用。

6.一种试剂盒，其特征在于，包括CD63适配体探针、胆固醇探针、连接子探针和骨干探针，CD63适配体探针序列如SEQ ID NO:1所示、胆固醇探针序列如SEQ ID NO:2所示、连接子探针序列如SEQ ID NO:3所示、骨干探针序列如SEQ ID NO:4所示。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述胆固醇探针的结构分区为：间隔子S1、主链序列区B1和连接序列L1；所述CD63适配体探针的结构分区为：间隔子S2、主链序列区B2和连接序列L2，所述间隔子S1和S2的长度是15nt。

8.权利要求6-7任一所述的试剂盒在检测、分离与富集外泌体中的应用。

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