CN112444629A - 基于发夹核酸分子信号放大线路的外泌体检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于发夹核酸分子信号放大线路的外泌体检测方法及其应用，属于生物检测技术领域。将羧基修饰的磁性纳米颗粒的羧基活化后与外泌体特异性识别抗体孵育，得到外泌体特异性识别抗体修饰的磁性纳米颗粒，加入外泌体样品，磁性分离后与携带启动核酸序列的双胆固醇分子锚孵育得到嵌入外泌体脂质双分子层膜的启动核酸序列，此启动核酸序列诱导发卡结构H1、发卡结构H2进行核酸扩增，H1、H2扩增产物与FQ荧光探针特异性杂交，荧光基团释放到溶液环境中，磁铁分离得上清液检测荧光信号。本方法能够特异性捕获、分离体液中外泌体；通过无酶催化发夹组装信号放大策略，实现外泌体高灵敏检测。

Description

基于发夹核酸分子信号放大线路的外泌体检测方法及应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体地说是一种基于发夹核酸分子信号放大线路的荧光型外泌体检测方法及其应用。
背景技术
肿瘤无创诊断技术即“液体活检”的出现，在临床诊疗中引起广泛关注，标志着人类在攻克肿瘤的道路上又前进了一大步。“液体活检”是指通过检测体液中外泌体、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA和循环肿瘤RNA等对癌症疾病做出诊断，其通过非侵入式的取样途径有效降低活检的危害，并可在影像学还未能发现病灶时就在体液中检测到肿瘤细胞的分泌物、释放物，做到提前“预知”癌症。
循环肿瘤DNA和RNA等，都有可能来源于凋亡或者坏死的肿瘤细胞，在体液中的清除时间依赖于巨噬细胞和循环酶类的活性，发生有临床意义的改变需要十几小时甚至数天；而外泌体是由活细胞直接分泌的细胞外囊泡，携带着母体细胞的分子信息，膜蛋白和细胞间通讯的遗传物质。研究表明，外泌体是“液体活检”领域最有前途的癌症标志物之一，癌症患者体液外泌体含量较正常人明显增加，且外泌体表面蛋白标志物具有显著的细胞来源特性，它们的类型和表达水平与某些癌症类别的存在和进展密切相关。如果可以实现外泌体水平和标志分子的灵敏、快速分析检测，就有可能实时监测体内循环体液甚至组织微环境的分子水平改变，做到提前“预知”癌症。
在外泌体的分析检测方面，传统方法包括扫描电子显微镜、原子力显微镜、动态光散射技术、纳米微粒追踪分析术、酶联免疫吸附法和流式细胞仪等。其中ELISA和流式细胞仪由于通量高、操作简单等优势，被普遍应用于外泌体的分析检测。然而，ELISA检测灵敏度低，往往不能满足低浓度检测的需求。流式细胞仪可以检测外泌体的数量、大小，并且可以通过荧光标记检测外泌体的来源。但是，传统流式细胞仪主要研究对象是细胞，散射光的检测极限通常是300-500 nm，而外泌体的直径在300 nm以下，无法与背景噪音区分。扫描电子显微镜、原子力显微镜、动态光散射技术、纳米微粒追踪分析术等方法，均不能特异性识别癌症特异性外泌体。
由此可见，以上传统分析方法在外泌体定性和定量方面的灵敏度和准确性以及疾病特异性外泌体识别方面并不理想。因此，亟需发展一种能够特异性识别，灵敏定量外泌体的新型检测手段。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种基于发夹核酸分子信号放大线路的荧光型外泌体检测方法及其应用，本方法能够特异性捕获、分离体液中外泌体；通过无酶催化发夹组装信号放大策略，实现外泌体高灵敏检测；能够成功区分健康人群与癌症患者。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案 ：
一种基于发夹核酸分子信号放大线路的荧光型外泌体检测方法，将羧基修饰的磁性纳米颗粒的羧基活化后与外泌体特异性识别抗体孵育，得到外泌体特异性识别抗体修饰的磁性纳米颗粒，加入外泌体样品，磁性分离后与携带启动核酸序列的双胆固醇分子锚孵育得到嵌入外泌体脂质双分子层膜的启动核酸序列，此启动核酸序列诱导发卡结构H1、发卡结构H2进行核酸扩增，H1、H2扩增产物与FQ荧光探针特异性杂交，荧光基团释放到溶液环境中，磁铁分离得上清液检测荧光信号。
本发明还具有以下附加技术特征：
优选的，上述检测方法包括以下步骤：
（1）20 µL浓度为10 mg/mL羧基修饰的磁性纳米颗粒，用MES（pH 6.0）缓冲溶液清洗三次，用磁铁分离后重悬于MES（pH 6.0）缓冲溶液，其中磁球上的羧基用于与抗体链接；
（2）步骤（1）中溶液加入5 µL浓度为0.1 M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，5 µL浓度为0.1 M的N-羟基琥珀酰亚胺，室温活化羧基30min后用MES（pH 6.0）缓冲溶液清洗并用磁铁分离，重悬于MES（pH 6.0）缓冲溶液，其中，磁球上的羧基被EDC和NHS活化后能够与抗体的氨基结合；
（3）在步骤（2）中溶液加入10 µL浓度为1mg/mL的外泌体特异性识别抗体，室温孵育2h，并在4℃孵育过夜后，用PBST缓冲溶液 (pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液包含0.1% Tween 20)清洗三次后，重悬于PBST缓冲溶液(pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液包含0.1% Tween 20及0.1%BSA)备用；
（4）取30 µL 0.5mg/mL步骤（3）中外泌体特异性识别抗体修饰的磁性纳米颗粒与20 µL不同浓度（0-1.1×107particles/µL）外泌体样品室温孵育2h后，用磁铁分离后，悬浮于50µL浓度为100 nM携带启动核酸序列的双胆固醇分子锚中室温孵育1h；并用PBST缓冲溶液清洗三次；
（5）将30 µL 300 nM H1，30 µL 450 nM H2，30 µL 300 nM FQ荧光探针（缓冲体系为含140 mM NaCl以及5 mM KCl的Tris-NK缓冲溶液）；分别加热至93℃保持1min后梯度降温至23℃后，将三者等体积混合；
（6）将步骤（4）所得复合物重悬于步骤（5）所得混合核酸序列溶液中，室温孵育2h后通过磁铁分离获得上清液，检测荧光信号。
在步骤（6）中，嵌入外泌体脂质双分子层膜的启动核酸序列与H1发夹结构中的单链部分杂交，诱导H1发夹结构打开并暴露出能与H2发夹结构互补杂交的序列，启动链被H2链置换与H1解链，此时H2与H1部分互补杂交（催化发夹组装是一个循环过程，可以产生大量H2与H1部分互补杂交序列），H2与H1部分互补杂交序列中未杂交的单链部分可以将FQ杂交序列解链，使荧光基团与荧光猝灭基团分离，诱导FAM荧光基团荧光恢复，从而检测到荧光信号；
优选的，上述检测方法中磁性纳米颗粒为高分子聚合物分子包裹的四氧化三铁颗粒。
优选的，上述检测方法中所述羧基修饰的磁性纳米颗粒为BioMag ScientificInc Carboxylic Acid. Catalog nos. BMS1000-2。
优选的，上述检测方法中所述磁性纳米颗粒粒径为1μm。
优选的，上述检测方法中所述发卡结构H1的序列为：GTCAGTGAGCTAGGTTAGATGTCGCCATGTGTAGACGACATCTAACCTAGCCCTTGTCATAGAGCAC；
所述发卡结构H2的序列为：
AGATGTCGTCTACACATGGCGACATCTAACCTAGCCCATGTGTAGA。
优选的，上述检测方法中所述外泌体的启动核酸序列为：
CGACATCTAACCTAGCTCACTGACATAAGGCACGACGGCTTT-Cholesterol
Cholesterol-TTTGCCGTCGTGCCTTAT。
优选的，上述检测方法中所述FQ以FAM作为荧光报告基团、以BHQ1作为荧光猝灭基团，其序列为：
FAM-CGAGTGCTCTATGACAAGGGCTAGGTT
CCCTTGTCATAGAGCACTCG-Dabcyl。
优选的，上述检测方法中所述H2标记荧光探针，FAM为荧光基团，Dabcyl为荧光淬灭基团，其序列为：
AGATGTCG/iDabcyldT/CTACACATGGCGACATCTAACCTAGCCCATGTGTAGA-FAM。
本发明还提供一种上述的检测方法的应用，用于癌症患者的检测。进一步的，用于肝癌患者和/或胆管癌患者的检测。
本发明和现有技术相比，其优点在于：
1.通过将磁性纳米颗粒与外泌体特异性识别抗体相结合，实现体液外泌体的特异性分离与捕获；
2.将携带启动核酸序列的双胆固醇分子嵌入外泌体脂质双分子层，启动核酸序列将位于外泌体表面，并诱导H1核酸发夹序列，H2核酸发夹序列，在无酶条件下进行核酸扩增，目的片段，将与荧光标记链杂交，实现荧光信号放大；
3.与双抗体检测方法相比，本方法通过抗体识别，胆固醇分子与脂质双分子层膜的特异性作用，能成功区分蛋白质与外泌体；
4.与扫描/透射电子显微镜、原子力显微镜、动态光散射技术、纳米微粒追踪分析术等技术相比，本方法能特异性识别外泌体，区分聚集蛋白和脂蛋白；
5.与酶联免疫吸附法（最少50 μL）和流式细胞仪（200 μL左右）等方法相比，本方法仅需20 μL外泌体样本，且检测灵敏度更高，特异性强。
6. 申请号为201911212520 .8名称为基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台及其制备方法与应用的专利主要针对于膜蛋白表达，本申请主要针对于灵敏检测外泌体数量。核酸链置换杂交实验中，发夹结构自发泄露导致的背景信号一直是影响检测性能的主要因素。与前期技术（H2标记荧光探针，FAM为荧光基团，Dabcyl为荧光淬灭基团，FAM与Dabcyl嵌入H2序列中，当H2形成发夹结构时，FAM与Dabcyl靠近，导致荧光猝灭，当H2发夹结构打开，荧光恢复）不同，本申请使用FAM标记核酸序列与Dabcyl标记核酸序列杂交双链结构（FQ荧光探针）（FAM为荧光基团，Dabcyl为荧光淬灭基团，因此FQ无荧光信号），FAM标记核酸序列与Dabcyl标记核酸序列比例为1:2，过量的Dabcyl标记核酸序列可以最大限度的掩蔽背景信号，提高荧光体系信噪比，从而提高检测灵敏度。另外，过量的Dabcyl标记核酸序列与启动序列、H1, H2核酸序列均无互补片段，因此不会对核酸扩增过程产生影响。
附图说明
图1. 基于催化发夹组装信号放大策略的外泌体检测方法原理图；
图2. (a) FQ荧光探针与H2荧光探针条件下荧光光谱响应及(b)相应信噪比比较；
图3. (a) 催化发夹组装page胶验证；(b) 泳道5，泳道6，泳道7相应荧光检测信号；
图4. (a)不同浓度外泌体存在情况下的荧光光谱响应，(b) 荧光强度与外泌体浓度的线性关系；
图5.选择性检测考察；
图6.(a)本检测体系在健康人群（healthy controls 1-7）及癌症患者（Cancerpatients：1-3肝癌患者；4-6胆管癌患者）外泌体检测中的荧光信号强度对比，(b)本方法用于(a)图临床样品分析所获得的点图(P=0.0008)。
具体实施方式
以下公开本发明的一些实施例，本领域技术人员可以根据本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的一种基于发夹核酸分子信号放大线路的荧光型外泌体检测方法原理如图1，将羧基修饰的磁性纳米颗粒的羧基活化后与外泌体特异性识别抗体孵育，得到外泌体特异性识别抗体修饰的磁性纳米颗粒，外泌体特异性识别抗体修饰的磁性纳米颗粒与外泌体孵育，再次磁性分离富集外泌体后与携带启动核酸序列的双胆固醇分子锚孵育得到嵌入外泌体脂质双分子层膜的启动核酸序列，此启动核酸序列诱导发卡结构H1、发卡结构H2进行核酸扩增，H1、H2扩增产物与FQ荧光探针特异性杂交，荧光基团释放到溶液环境中，磁铁分离得上清液检测荧光信号。
本实验共包括两部分：
1.修饰了外泌体特异性识别抗体的磁性纳米颗粒（此部分能够特异性捕获并分离出外泌体）与携带启动核酸序列的双胆固醇分子锚（此部分能插入外泌体脂质双分子层结构，且启动核酸序列暴露在溶液环境中）；
2.H1核酸发夹结构，H2核酸发夹结构，FAM标记核酸序列与Dabcyl标记核酸序列杂交双链结构，其中FQ为荧光探针，FAM为荧光基团，Dabcyl为荧光淬灭基团，因此FQ无荧光信号。此部分为荧光信号放大部分，在启动核酸序列存在的情况下，诱导此部分进行催化发夹组装荧光信号放大。
如图2： FQ荧光探针检测体系步骤：FQ-probe-blank：100 µL TNK 缓冲体系，含有60 nM H1, 90 nM H2, 60 nM FQ荧光探针，室温孵育2h后采集荧光信号；FQ-probe-triger：100 µL TNK 缓冲体系，含有2 nM 启动核酸序列, 60 nM H1, 90 nM H2, 60 nMFQ荧光探针，室温孵育2h后采集荧光信号；H2荧光探针检测体系步骤：H2-probe-blank：100µL TNK 缓冲体系，含有60 nM H1, 90 nM H2荧光探针，室温孵育2h后采集荧光信号；H2-probe-triger：100 µL TNK 缓冲体系，含有2 nM 启动核酸序列， 60 nM H1, 90 nM H2荧光探针，室温孵育2h后采集荧光信号；通过所采集荧光信号，计算信噪比进行比较。FQ荧光探针检测体系信噪比为H2荧光探针检测体系的1.7倍。
如图3：30 µL外泌体特异性识别抗体修饰的磁性纳米颗粒与6×105 particles/µL外泌体样品室温孵育2h，用磁铁分离后，使用PBST缓冲溶液清洗3次，再用PBS缓冲溶液清洗3次，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
（1）泳道1：上述捕获外泌体后的磁球-外泌体复合物在加入30µL 300 nM H1，60 µL TNK buffer 室温孵育2h；
（2）泳道2：上述捕获外泌体后的磁球-外泌体复合物在加入30µL 450 nM H2，60 µLTNK buffer 室温孵育2h；
（3）泳道3：上述捕获外泌体后的磁球-外泌体复合物在加入30µL 300 nM H1，30µL 450nM H2，30 µL TNK buffer 室温孵育2h；
（4）泳道4：上述捕获外泌体后的磁球-外泌体复合物，与50µL 100 nM双胆固醇分子锚孵育1h后，使用PBST缓冲溶液清洗3次，再用PBS缓冲溶液清洗3次，再加入30µL 300 nM H1，30µL 450 nM H2，30 µL TNK buffer 室温孵育2h；
（5）泳道5：上述捕获外泌体后的磁球-外泌体复合物，与50µL 100 nM双胆固醇分子锚孵育1h后，使用PBST缓冲溶液清洗3次，再用PBS缓冲溶液清洗3次，再加入30µL 300 nM H1，30µL 450 nM H2，30 µL 300 nM FQ荧光探针 室温孵育2h；
（6）泳道6：上述捕获外泌体后的磁球-外泌体复合物在加入30µL 300 nM FQ荧光探针，60 µL TNK buffer 室温孵育2h；
（7）上述捕获外泌体后的磁球-外泌体复合物，加入30µL 300 nM H1，30µL 450 nM H2，30 µL 300 nM FQ荧光探针 室温孵育2h；
取上述7组实验所获得的上清液与loading buffer混合后上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳操作并获得图3(a)胶图。将泳道5、6、7实验上清液采集荧光信号，如图3(b)所示荧光信号响应。
如图4：根据Umibio血清外泌体提取试剂盒，提取志愿者血清外泌体。30 µL外泌体特异性识别抗体修饰的磁性纳米颗粒分别与20 µL不同浓度外泌体（0，5.5×103，1.1×104，5.5×104，1.1×105，5.5×105，1.1×106，5.5×106，1.1×107particles/µL）孵育2h，后使用PBST缓冲溶液清洗3次，与50µL,100 nM双胆固醇分子锚孵育1h后，使用PBST缓冲溶液清洗3次，再加入30µL, 300 nM H1，30µL, 450 nM H2，30 µL, 300 nM FQ荧光探针室温孵育2h；最后磁分离，取上清液采集荧光信号。
图4（a）为不同浓度外泌体存在情况下的荧光光谱响应，图4（b）荧光强度与外泌体浓度的对数的线性关系。由图4（a），可发现当外泌体浓度为5.5×103 particles/µL时，此荧光检测体系能够获得明显荧光信号（与背景信号相比，即外泌体浓度为0 particles/µL时获得的荧光光谱信号），说明本荧光检测体系最低检测浓度能够达到5.5×103particles/µL。由图4（b）荧光强度与外泌体浓度的对数的线性关系，可以发现，本荧光检测体系在外泌体浓度为5.5×103-1.1×107particles/µL之间具有良好的线性响应关系，即本方法至少能够可靠检测到浓度范围在5.5×103-1.1×107particles/µL的外泌体。
如图5：选择CD63, TSG101, CRP, BSA四种蛋白，验证本检测体系的选择性。具体步骤如下：30 µL外泌体特异性识别抗体修饰的磁性纳米颗粒分别与20 µL, 2 µg/mLCD63, TSG101 CRP, BSA以及1.1×106 particles/µL孵育2h，后使用PBST缓冲溶液清洗3次，与50µL, 100 nM双胆固醇分子锚孵育1h后，使用PBST缓冲溶液清洗3次，再加入30µL,300 nM H1，30µL, 450 nM H2，30 µL, 300 nM FQ荧光探针室温孵育2h；最后磁分离，取上清液采集荧光信号。
从图5可以看到，本方法只对外泌体响应，与外泌体特异性蛋白CD63, TSG101以及其他常见蛋白CRP, BSA均无信号响应，这是因为本方法通过同时识别外泌体特异性蛋白CD63以及外泌体的膜结构，后才能引发荧光信号放大，因此对体液中的蛋白不会产生信号相应。
如图6： 根据Umibio血清外泌体提取试剂盒，分别提取健康人及癌症患者(1-3肝癌患者；4-6胆管癌患者)血清外泌体，并同时使用PBS缓冲溶液稀释规定倍数。外泌体特异性识别抗体修饰的磁性纳米颗粒分别与各样本外泌体孵育2h，后使用PBST缓冲溶液清洗3次，与50µL, 100 nM双胆固醇分子锚孵育1h后，使用PBST缓冲溶液清洗3次，再加入30µL,300 nM H1，30µL, 450 nM H2，30 µL, 300 nM FQ荧光探针 室温孵育2h；最后磁分离，取上清液采集荧光信号。通过软件分析获得点图(P=0.0008)。
综上：
1：本方法与酶联免疫吸附法（最少50 μL）和流式细胞仪（200 μL左右）等方法相比，本方法仅需20 μL外泌体样本，且检测灵敏度更高，特异性强”；
2：申请号为201911212520 .8名称为基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台及其制备方法与应用的专利主要针对于膜蛋白表达，本申请主要针对于灵敏检测外泌体数量。本申请使用FAM标记核酸序列与Dabcyl标记核酸序列杂交双链结构（FQ荧光探针）（FAM为荧光基团，Dabcyl为荧光淬灭基团，因此FQ无荧光信号），FAM标记核酸序列与Dabcyl标记核酸序列比例为1:2，过量的Dabcyl标记核酸序列可以最大限度的掩蔽背景信号，提高荧光体系信噪比（如图2）。另外，过量的Dabcyl标记核酸序列与启动序列、H1,H2核酸序列均无互补片段，因此不会对核酸扩增过程产生影响；
3：如图3，本方法所选用发夹结构及荧光探针结构，仅在外泌体存在情况下（启动序列在外泌体表面），才能诱导发夹结构H1与H2进行置换杂交，实现“单启动序列-多H1H2杂交链结构”信号放大策略，最终H1H2杂交链结构与荧光探针结构置换杂交获得荧光信号。
4：如图4，本方法对血清外泌体的最低检测浓度可达到5.5×103particles/µL；
5：如图5， 本方法对血清外泌体具有良好的选择性，能有效区分外泌体与外泌体特异性蛋白及其他蛋白质干扰；
6：如图6， 癌症患者分泌外泌体含量较正常人高，本方法通过检测外泌体含量能初步区分正常人及癌症患者；
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛科技大学
<120> 基于发夹核酸分子信号放大线路的外泌体检测方法及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcagtgagc taggttagat gtcgccatgt gtagacgaca tctaacctag cccttgtcat 60
agagcac 67
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agatgtcgtc tacacatggc gacatctaac ctagcccatg tgtaga 46
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgacatctaa cctagctcac tgacataagg cacgacggct tttttgccgt cgtgccttat 60
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgagtgctct atgacaaggg ctaggttccc ttgtcataga gcactcg 47

Claims (9)

1.一种基于发夹核酸分子信号放大线路的外泌体检测方法，其特征在于，将羧基修饰的磁性纳米颗粒的羧基活化后与外泌体特异性识别抗体孵育，得到外泌体特异性识别抗体修饰的磁性纳米颗粒，加入外泌体样品，磁性分离后与携带启动核酸序列的双胆固醇分子锚孵育得到嵌入外泌体脂质双分子层膜的启动核酸序列，此启动核酸序列诱导发卡结构H1、发卡结构H2进行核酸扩增，H1、H2扩增产物与FQ荧光探针特异性杂交，荧光基团释放到溶液环境中，磁铁分离得上清液检测荧光信号。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）20 µL羧基修饰的磁性纳米颗粒，用MES（pH 6.0）缓冲溶液清洗三次，用磁铁分离后重悬于MES（pH 6.0）缓冲溶液；
（2）步骤（1）中溶液加入5 µL浓度为0.1 M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，5 µL，浓度为0.1 M的N-羟基琥珀酰亚胺，室温活化羧基30min后用MES（pH 6.0）缓冲溶液清洗并用磁铁分离，重悬于MES（pH 6.0）缓冲溶液；
（3）在步骤（2）中溶液加入10 µL浓度为1mg/mL的外泌体特异性识别抗体，室温孵育2h，并在4℃孵育过夜后，用PBST缓冲溶液 (pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液包含0.1% Tween 20)清洗三次后，重悬于PBST缓冲溶液(pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液包含0.1% Tween 20及0.1%BSA)备用；
（4）取30 µL 0.5mg/mL步骤（3）中外泌体特异性识别抗体修饰的磁性纳米颗粒与外泌体样品室温孵育2h后，用磁铁分离后，悬浮于50 µL浓度为100 nM携带启动核酸序列的双胆固醇分子锚中室温孵育1h；并用PBST缓冲溶液清洗三次；
（5）将30 µL, 300 nM H1，30 µL, 450 nM H2，30 µL, 300 nM FQ荧光探针溶解于包含140 mM NaCl以及5 mM KCl的Tris-NK缓冲溶液；分别加热至93℃保持1min后梯度降温至23℃后，将三者等体积混合；
（6）将步骤（4）所得复合物重悬于步骤（5）所得混合核酸序列溶液中，室温孵育2h后通过磁铁分离获得上清液，检测荧光信号。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为聚合物分子包裹的四氧化三铁颗粒。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒粒径为1μm。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述发卡结构H1的序列为：GTCAGTGAGCTAGGTTAGATGTCGCCATGTGTAGACGACATCTAACCTAGCCCTTGTCATAGAGCAC；
所述发卡结构H2的序列为：
AGATGTCGTCTACACATGGCGACATCTAACCTAGCCCATGTGTAGA。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述外泌体的启动核酸序列为：
CGACATCTAACCTAGCTCACTGACATAAGGCACGACGGCTTT-Cholesterol
Cholesterol-TTTGCCGTCGTGCCTTAT。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述FQ以FAM作为荧光报告基团、以BHQ1作为荧光猝灭基团，其序列为：
FAM-CGAGTGCTCTATGACAAGGGCTAGGTT
CCCTTGTCATAGAGCACTCG-Dabcyl。
8.根据根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述发卡结构H2标记荧光探针，FAM为荧光基团，Dabcyl为荧光淬灭基团，其序列为：
AGATGTCG/iDabcyldT/CTACACATGGCGACATCTAACCTAGCCCATGTGTAGA-FAM。
9.一种如权利要求1所述的检测方法的应用，其特征在于，用于癌症患者的检测。
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