CN111458506A - 一种基于TdT信号放大的结直肠癌外泌体检测方法和体系 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学检测技术领域，具体为一种基于TdT信号放大的结直肠癌外泌体检测方法和体系。本发明采用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）对引物探针3’ 端进行链延伸反应，催化聚合产生长链生物素修饰的polyA；然后结合亲和素修饰的辣根过氧化物酶，催化3,3',5,5'‑四甲基联苯胺（TMB）进行显色反应，并在450 nm处产生紫外吸收峰。本发明可以用于临床血清样本的检测，并成功区分结直肠癌患者血清和正常人血清。本发明的方法具有快速高效、特异性强、灵敏度高，生物相容性好，可视化程度高，且不需要大型仪器设备和昂贵试剂，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种基于（末端脱氧核苷酸转移酶）TdT信号放大的结直肠癌外泌体的检测方法和体系。
背景技术
液体活检作为体外诊断的一个分支，是指通过对血液、尿液和唾液等体液进行检测，可以实现疾病分子的鉴定。液体活检对于早期诊断、指导用药、疗效评估和疾病监测等方面有着重要的意义。根据检测物的不同，可以分为循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）和外泌体检测等。外泌体是一种能被大多数细胞分泌的微小囊泡（直径约为30-150nm），肿瘤衍生的外泌体含有肿瘤特异性蛋白质和核酸等，可以作为潜在的疾病诊断标志物。相比于其他两种检测物，外泌体的含量高，容易富集，并且外泌体的膜结构对内部的核酸和蛋白质分子有着很好的保护作用，是继CTCs和ctDNA后又一备受关注的液体活检肿瘤标志物和治疗及预后的靶点。
目前对外泌体的检测方法主要有NTA、表面增强拉曼光谱（SERS）、荧光检测和酶联免疫吸附实验（ELISA）等方法。NTA利用Stockes-Einstein方程计算外泌体的流体学直径和浓度，可以实现外泌体的快速、简单检测，但是特异性低，灵敏度差；荧光检测易发生光漂白和猝灭现象，不利于信号的标记和存储；SERS技术所需要的仪器昂贵、操作复杂、不适合在短时间内处理大量样品。ELISA方法因为其检测灵敏度高、特异性强，对实验操作人员的要求低，易实现自动化操作而受到广泛关注。
核酸适配体是单链DNA或者RNA，其具有类似抗体的性质，能和多种目标分子高特异性、高选择性地结合。相比于抗体，核酸适配体成本低、稳定性好并且容易修饰，被广泛用于外泌体的检测中。为了提高外泌体检测的灵敏度，基于适配体识别作用外泌体的信号放大技术被广泛报道，但是现有的大部分检测方法依赖于靶向切割位点和特定的模板序列，导致操作步骤繁琐、耗时并可能出现假阳性结果。TdT酶（末端脱氧核苷酸转移酶）是一种无需模板的DNA聚合酶，可以催化脱氧核苷酸结合到单链或者双链DNA分子3’羟基端，和其他的信号放大技术相比，无需设计复杂的引物，操作简单，反应可以在37 ℃下进行。目前，没有报道将TdT酶和ELISA技术相结合用于外泌体的检测中。
我们建立了一种基于TdT酶的紫外信号放大的技术用于结直肠癌外泌体的可视化检测。A33（结直肠癌外泌体表面蛋白标志物）抗体作为捕获抗体，核酸适配体和引物修饰的金纳米颗粒作为信号探针，从而形成抗体-外泌体-金纳米颗粒的夹心结构。在TdT酶的作用下，引物探针的3’端进行链延伸反应形成多条生物素修饰的polyA长链，结合avidin-HRP，催化底物导致溶液的紫外吸收值发生实现对外泌体的定量检测，放大效果可达10.4倍。同时该方法可用于实际血清样本的检测，结直肠癌患者的血清样本（16例）可以和正常人的血清样本（9例）区分。
发明内容
本发明的目的在于提出一种快速、灵敏和可视化的结直肠癌外泌体的检测方法和体系。
本发明提出的结直肠癌外泌体检测方法，是基于TdT酶信号放大技术的，具体步骤为：
（1）金纳米粒子探针合成：在纳米金溶液中加入巯基修饰的引物和核酸适配体，老化；
（2）包被：按照50-150μL/孔将5-8μg/mL A33抗体加入到96孔板中，孵育一段时间，然后移除多余抗体；
（3）封闭：按照150-250μL /孔将封闭液加入到96孔板中，静置孵育一段时间，然后移除封闭液，随后洗涤并拍干；
（4）外泌体捕获：向每孔中加入50-150μL外泌体溶液，孵育一段时间，然后洗涤并拍干；
（5）信号放大：向每孔中加入50-150μL 金纳米粒子探针，孵育一段时间，然后洗涤并拍干；再加入20-60 U TdT酶、8-12μL缓冲液、100-300 nmol生物素修饰的dATP和16-25μL超纯水，35-40 ℃孵育一段时间，然后洗涤并拍干；
（6）检测反应：按照50-150μL/孔将亲和素修饰的辣根过氧化物酶（avidin-HRP）加入到96孔板中，孵育一段时间，然后移除，随后洗涤并拍干，最后按照50-150μL/孔将3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）单组份显色液加入到96孔板中进行显色反应；
（7）终止：按照25-75μL/孔加入1-2 M 硫酸，终止反应；
（8）读数：使用酶标仪进行读数，记录450 nm处的OD值。
本发明中，所述外泌体由如下操作得到：（1）外泌体分离纯化：培养SW480细胞并收集细胞培养上清液，使用超速离心法分离得到外泌体；（2）使用纳米颗粒跟踪分析技术（NTA）对提取得到的外泌体进行定量，然后分装保存于-80℃。
本发明步骤（1）中所述的引物序列（SEQ ID NO. 1）为：
5’-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT；
所述的核酸适配体的序列（SEQ ID NO. 2）为：
3’-SH- CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG。
本发明步骤（1）中，所述的金纳米粒子探针合成，其操作步骤为：将3’端修饰巯基的捕获适配体（30-50μL）和5’端修饰巯基的引物（160-220μL）通过金-硫键和金纳米颗粒（450-750μL）混合，静置过夜，再加入1-2 M NaCl溶液，使其终浓度为0.1-0.2 M，10000-14000 rpm离心两次。
本发明步骤（3）中，所述的封闭的操作流程为：往96孔板中加入150-250μL 1%-3%BSA溶液，孵育时间为1-2 h，反应温度为35-37 ℃；随后移除封闭液，按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次，拍干。
本发明步骤（4）中，所述的外泌体捕获的操作流程为在96孔板中加入50-150μL外泌体标准品，于35-38℃孵育反应1-2小时，移除液体，按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次。
本发明步骤（5）中，所述的信号放大的操作流程为：向每孔中加入50-150μL 金纳米粒子探针，35-40 ℃孵育1-2 h，移除液体，按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次，拍干；向每孔中加入20-60 U TdT酶、8-12μL缓冲液、100-300 nmol生物素修饰的dATP和16-25μL超纯水，35-40 ℃孵育25-35 min，移除液体，按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次，拍干。其中，在TdT酶作用下，金纳米粒子探针中的引物序列的3’端进行链延伸反应形成多条生物素修饰的dATP长链。
本发明步骤（6）中，所述的检测反应的操作流程为：按照50-150μL/孔将亲和素修饰的辣根过氧化物酶（avidin-HRP）加入到96孔板中，孵育25-35 min后移除，随后按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次，拍干；最后按照50-150μL/孔将TMB单组份显色液加入到96孔板中35-40 ℃ 孵育8-15 min。其中，avidin-HRP和dATP长链上的生物素结合，催化TMB进行显色反应。
本发明还包括构建标准曲线，具体步骤为：将分离得到的结直肠癌外泌体原液用1×PBS稀释为不同的浓度，然后分别进行检测OD值，根据检测的OD值和外泌体浓度构建得到标准线性曲线，作为判别依据。
基于上述检测方法，本发明还提供相应的基于（末端脱氧核苷酸转移酶）TdT信号放大的结直肠癌外泌体的检测体系。该检测体系包括：金纳米粒子探针，A33抗体，封闭液，TdT酶，缓冲液，生物素修饰的dATP，亲和素修饰的辣根过氧化物酶（avidin-HRP），3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）单组份显色液；其中，A33抗体用于对外泌体的包被和捕获；封闭液用于对外泌体的封闭，金纳米粒子探针、TdT酶、缓冲液、生物素修饰的dATP用于对外泌体信号的放大；亲和素修饰的辣根过氧化物酶（avidin-HRP）和3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）单组份显色液，分别用于对外泌体信号的检测和显示；其中金纳米粒子探针由纳米金溶液中加入巯基修饰的引物和核酸适配体得到。
与现有报道相比，本发明的基于TdT酶末端信号放大技术用于结直肠外泌体的检测，方法简便、快速、特异性高、灵敏度高，生物相容性好，可视化程度高。
（1）检测方法快速简便：可以实现自动化检测，在短时间内实现多个样品的同时检测，实验方法简单，对操作人员无需特殊要求；
（2）特异性良好：结直肠正常细胞（FHC）和胰腺癌细胞(PANC-01)分泌的外泌体对本检测方法基本没有干扰；
（3）灵敏度高：结直肠癌外泌体最低浓度是9.75×103 个/μL, 检出限6.67×103 个/μL（以信噪比计算，S/N=3），检测的浓度范围为9.75×103-1.95×106个/μL；
（4）检测方便：可视化程度高，可以直接用肉眼观察结果；或使用酶标仪根据读数数值对外泌体浓度进行定量。
附图说明
图1为TdT酶信号放大技术用于结直肠癌外泌体检测原理示意图。
图2为结直肠癌外泌体TEM表征图。
图3为基于TdT酶信号放大技术检测的紫外信号强度与结直肠癌外泌体浓度线性关系。
图4为不同种类外泌体特异性实验结果图。
图5为临床血清样本检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，进一步描述本发明。
实施例1
（1）金纳米粒子探针合成
将214μL引物和43μL 适配体加入到600μL 13 nm金纳米颗粒中室温下避光反应过夜，加入2 M氯化钠使其终浓度为0.2 M，老化12 h，12000 rpm 离心两次。
（2）包被
将100μL 5μg/mL A33抗体加入到96孔板中，4 ℃静置过夜，多余的A33抗体用1×PBS清洗。
（3）封闭
在96孔板中加入200μL 1% BSA溶液，36 ℃振荡孵育1.5 h，移除封闭液，用300μL 1×PBST洗涤三次，拍干。
（4）外泌体捕获
分别将100μL不同浓度SW480细胞分泌的外泌体和100μL相同浓度（1.95×105 个/μL）但不同种类的细胞（SW480、FHC和PANC-01）分泌的外泌体加入到96孔板中，36 ℃下反应1.5h，再用300μL 1×PBST洗涤三次。
（5）信号放大
在96孔板中加入100μL 金纳米粒子探针，37 ℃下反应1.5 h，加入300μL 1×PBST洗涤三次。再向每孔中分别加入60 U TdT酶，200 nmol 生物素修饰的dATP，8μL 缓冲液和19.5μL超纯水，在37 ℃下反应30 min，加入300μL 1×PBST洗涤三次，拍干。
（6）检测反应
在96孔板中加入100μL avidin-HRP，37 ℃下反应30 min，加入300μL 1×PBST洗涤三次，拍干。再加入100μL TMB单组份显色液，37 ℃下反应15 min。
（7）终止
在96孔板中加入50μL 1 M H2SO4 终止液终止反应。
（8）读数
使用酶标仪读数，记录450 nm处OD值。
（9）检测结果
紫外吸收值和SW480外泌体浓度关系如图3所示，在9.75×103-1.95×106个/μL浓度范围内呈现出良好的线性关系（R2>0.99），检出限为6.67×103个/μL（以信噪比计算，S/N=3）。同浓度的SW480, FHC和PANC-01外泌体紫外吸收值对比如图4所示， FHC和 PANC-01外泌体对检测结果基本没有干扰。相比于现有的外泌体检测方法，本方法步骤简单，特异性好，对于操作人员无特殊要求，仪器设备要求低，可视化程度高，可以直接通过肉眼观察检测结果。
实施例2
（1）金纳米粒子探针合成
将 178μL引物和36μL 适配体加入到500μL 13 nm金纳米颗粒中室温下避光反应过夜，加入2 M氯化钠使其终浓度为0.2 M，老化12 h，12000 rpm 离心两次。
（2） 包被
将100μL 6μg/mL A33抗体加入到96孔板中，4 ℃静置过夜，多余的A33抗体用1×PBS清洗。
（3） 封闭
再在96孔板中加入 200μL 1% BSA溶液，37 ℃振荡孵育2 h，移除封闭液，用300μL 1×PBST洗涤三次，拍干。
（4）外泌体捕获
将100μL结直肠癌患者和正常人血清分别加入到96孔板中，37 ℃下反应1 h，用300μL1×PBST洗涤三次。
（5）信号放大
在96孔板中加入100μL 金纳米探针，37 ℃下反应1 h，加入300μL 1×PBST洗涤三次拍干。再在96孔板中加入30 U TdT酶，200 nmol 生物素修饰的dATP，10μL 缓冲液和20μL 超纯水，在37 ℃下反应35 min，加入300μL 1×PBST洗涤三次，拍干。
（6）检测反应
在96孔板中加入100μL avidin-HRP，37 ℃下反应35 min，加入300μL 1×PBST洗涤三次，拍干。在96孔板中加入100μL TMB单组份显色液，37 ℃下反应10 min。
（7）终止
在96孔板中加入50μL 1 M H2SO4终止液终止反应。
（8）读数
使用酶标仪进行读数，记录450 nm处的OD值。
（9）检测结果
本方法选取16例结直肠癌患者血清样品和9例健康人血清样品作为对照组对TdT信号放大的外泌体检测体系进行验证，研究结果表明结直肠癌患者血清中的外泌体含量显著高于健康对照组（图5，p<0.05），本方法可以用于多个结直肠癌血清样本的同时检测，为临床结直肠癌的诊断提供新依据。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 一种基于TdT信号放大的结直肠癌外泌体检测方法和体系
<130> 001
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttt 48
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctg 48
Claims (10)
1.一种基于TdT酶信号放大的结直肠癌外泌体检测方法，其特征在于，具体步骤为：
（1）金纳米粒子探针合成：在纳米金溶液中加入巯基修饰的引物和核酸适配体，老化；
（2）包被：按照50-150μL/孔将A33抗体加入到96孔板中，孵育，然后移除多余抗体；
（3）封闭：按照150-250μL /孔将封闭液加入到96孔板中，静置孵育，然后移除封闭液，随后洗涤并拍干；
（4）外泌体捕获：向每孔中加入50-150μL外泌体溶液，孵育，然后洗涤并拍干；
（5）信号放大：向每孔中加入50-150μL 金纳米粒子探针，孵育，然后洗涤并拍干；再加入TdT酶、缓冲液、生物素修饰的dATP和超纯水，35-40 ℃孵育一段时间，洗涤并拍干；
（6）检测反应：按照50-150μL/孔将亲和素修饰的辣根过氧化物酶加入到96孔板中，孵育，然后移除，随后洗涤并拍干，最后按照50-150μL/孔将3,3',5,5'-四甲基联苯胺单组份显色液加入到96孔板中进行显色反应；
（7）终止：按照25-75μL/孔加入1-2 M 硫酸，终止反应；
（8）读数：使用酶标仪进行读数，记录450 nm处的OD值；
步骤（1）中所述引物序列为SEQ ID NO. 1所示，所述核酸适配体的序列为SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的结直肠癌外泌体检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述的金纳米粒子探针合成，其操作步骤为：将3’端修饰巯基的捕获适配体30-50μL和5’端修饰巯基的引物160-220μL，通过金-硫键和金纳米颗粒450-750μL混合，静置过夜，再加入1-2 MNaCl溶液，使其终浓度为0.1-0.2 M，10000-14000 rpm离心两次。
3.根据权利要求1所述的结直肠癌外泌体检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的封闭的操作流程为：往96孔板中加入150-250μL 1%-3% BSA溶液，孵育时间为1-2 h，反应温度为35-37 ℃；随后移除封闭液，按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次，拍干。
4.根据权利要求1所述的结直肠癌外泌体检测方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的外泌体捕获的操作流程为：在96孔板中加入50-150μL外泌体标准品，于35-38 ℃孵育反应1-2小时，移除液体，按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次。
5.根据权利要求1所述的结直肠癌外泌体检测方法，其特征在于，步骤（5）中所述的信号放大的操作流程为：向每孔中加入50-150μL金纳米粒子探针，35-40℃孵育1-2 h，移除液体，按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次，拍干；向每孔中加入20-60 U TdT酶、8-12μL缓冲液、100-300 nmol 生物素修饰的dATP和16-25μL超纯水，35-40 ℃孵育25-35 min，移除液体，按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次，拍干；在TdT酶作用下，金纳米粒子探针中的引物序列的3’端进行链延伸反应形成多条生物素修饰的dATP长链。
6.根据权利要求1所述的结直肠癌外泌体检测方法，其特征在于，步骤（6）中所述的检测反应的操作流程为：按照50-150μL/孔将亲和素修饰的辣根过氧化物酶加入到96孔板中，孵育25-35 min后移除，随后按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次，拍干；最后按照50-150μL/孔将TMB单组份显色液加入到96孔板中35-40 ℃ 孵育8-15 min；其中，辣根过氧化物酶和dATP长链上的生物素结合，催化TMB进行显色反应。
7.根据权利要求1所述的结直肠癌外泌体检测方法，其特征在于，还包括构建标准曲线，具体步骤为：将分离得到的结直肠癌外泌体原液用1×PBS稀释为不同的浓度，然后分别进行检测OD值，根据检测的OD值和外泌体浓度构建得到标准线性曲线，作为判别依据。
8.一种基于TdT酶信号放大的结直肠癌外泌体检测体系，其特征在于，包括：金纳米粒子探针，A33抗体，TdT酶，缓冲液，生物素修饰的dATP，亲和素修饰的辣根过氧化物酶，3,3',5,5'-四甲基联苯胺单组份显色液；其中，A33抗体用于对外泌体的包被和捕获；金纳米粒子探针，TdT酶，缓冲液，生物素修饰的dATP，用于对外泌体信号的放大；亲和素修饰的辣根过氧化物酶和3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB单组份显色液，分别用于对外泌体信号的检测和显示；其中金纳米粒子探针由纳米金溶液中加入巯基修饰的引物和核酸适配体得到。
9.根据权利要求8所述的结直肠癌外泌体检测体系，其特征在于，金纳米粒子探针中，所述的引物序列为SEQ ID NO. 1所示，所述的核酸适配体序列为SEQ ID NO. 2所示。
10.根据权利要求9所述的结直肠癌外泌体检测体系，其特征在于，按96孔板的每孔计，对应于直肠癌外泌体50-150μL，体系各组分的量为：金纳米粒子探针、A33抗体、亲和素修饰的辣根过氧化物酶、3,3',5,5'-四甲基联苯胺单组份显色液：50-150μL；封闭液：150-250μL；TdT酶：20-60 U，缓冲液：8-12μL，生物素修饰的dAT: 100-300 nmol。
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