CN113390842B - 一种快速高通量检测癌胚抗原的适配体生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种快速高通量检测癌胚抗原的适配体生物传感器，包括CEA变构适配体荧光探针；所述CEA变构适配体荧光探针为发夹结构；所述CEA变构适配体荧光探针包括互补序列、链接序列和CEA识别序列；所述CEA变构适配体荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明利用定量PCR仪对由CEA促发的适配体荧光信号进行多样品同时分析，把适配体的快速变构和qPCR仪的高通量分析相结合，从而实现对CEA的快速高通量检测，并且达到结果准确的效果。
Description
技术领域
本发明属于化学与生物传感器技术领域，特别涉及一种快速高通量检测癌胚抗原的适配体生物传感器及其应用。
背景技术
癌症是当前和未来人类面临的重大挑战之一，世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）最新统计报告显示，2020年全球新发癌症病例约1929万例，死亡病例约996万例；并预计到2040年，全球新发癌症病例将达到2840万例。根据这份报告，在中国、美国等国家小于或等于70岁人群中，癌症死亡人数占总死亡人的第一位。癌症治疗的难点之一在于很难做到早期诊断，使得许多病患者错过了治疗的最佳时期。癌胚抗原（CEA）作为一种糖蛋白，常在结肠癌、肺癌、大肠癌、胃癌等癌症病患者的血清中升高，是一种广谱的癌症标记物。因此，CEA的快速、高通量检测对于人口众多的我国癌症的早期筛查、预防和治疗均具重要的意义。
目前，酶联免疫吸附检测（ELISA）、荧光免疫法、电化学检测法、表面增强拉曼散射等方法，均已成功应用于CEA的快速检测。其中，检测CEA最常见的方法是酶联免疫吸附检测（ELISA），该方法以其高通量和重现性好的优点被广泛应用于临床检验和健康人群癌症筛查。但ELISA存在操作步骤繁琐（需要多次洗涤）和检测时间长（2-3小时）的缺点。
对比文件1（Yarizadeh, K., et al., Computational analysis andoptimization of carcinoembryonicantigen aptamers and experimental evaluation.Journal of Biotechnology, 2019. 306: p. 1-8）和对比文件2（Wang P , Wan Y , DengS , et al. Aptamer-initiatedon-particle template-independent enzymaticpolymerization (aptamer-OTEP) for electrochemical analysis of tumorbiomarkers[J]. Biosensors&Bioelectronics, 2016:536-541）为本研究最相近的现有技术，是针对癌胚抗原基于适配体识别技术的生物传感器，该方法具有灵敏度高、检测速度快的特点。该适配体生物传感器主要由两部分组成，分别为生物感受元件和信号传感器，生物感受元件中的适配体负责对CEA进行特异性识别，信号传感器把生物识别效应转化为光、电或质量等可被检测的信号。但适配体生物传感器与ELISA相比，适配体传感器对CEA的检测通量低，限制了它们在癌症筛查中的应用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种快速高通量检测癌胚抗原的适配体生物传感器，解决了目前检测CEA要么通量高速度慢，要么通量低速度快的问题。本发明通过将CEA适配体设计成变构适配体探针，并首次利用定量PCR（real-time fluorescentquantitative PCR，简称qPCR）仪对由CEA促发的适配体荧光信号进行多样品同时分析，把适配体的快速变构和qPCR仪的高通量分析相结合，从而实现对CEA的快速高通量检测。为实现本发明目的所使用的技术方案为：
一种快速高通量检测癌胚抗原的适配体生物传感器，包括CEA变构适配体荧光探针；
所述CEA变构适配体荧光探针为发夹结构；
所述CEA变构适配体荧光探针包括互补序列、链接序列和CEA识别序列；
所述CEA变构适配体荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述互补序列末端采用荧光染料修饰；所述识别序列末端采用荧光淬灭基团修饰。
优选地，所述互补序列末端采用羧基荧光素修饰；所述识别序列末端采用黑洞猝灭基团修饰。
优选地，所述互补序列与所述识别序列发生碱基互补，并通过所述链接序列相连接形成发夹结构。
优选地，所述核苷酸序列SEQ NO:1的5’端的9个碱基和3’端的9个碱基形成反向互补。
优选地，所述互补序列长度为5-11bp。
优选地，所述CEA变构适配体荧光探针和CEA结合时，采用实时定量 PCR 仪进行检测。
优选地，采用实时定量 PCR 仪进行检测的温度为4-20℃。
优选地，所述实时定量 PCR 仪进行检测时，探针溶液和待测样品的体积比为1：1~20。
本发明还提供一种快速高通量检测癌胚抗原的适配体生物传感器的制备方法，具体制备步骤如下：
1）化学合成方法制备出寡聚核苷酸；所述寡聚核苷酸的核心序列为SEQ ID NO:1所示；
2）化学合成的方法对上述寡聚核苷酸的5‘端修饰上荧光基团，3’端修饰上荧光猝灭基团，得到变构适配体荧光探针；
3）配体荧光探针溶解于水中，配置成浓度为0.05~5 uM的适配体探针溶液；
4）向qPCR反应管中加入上述适配体探针溶液，同时加入待测样品，使探针溶液和待测样品的体积比为1：1~20；
5）将上述qPCR反应管放入定量PCR仪中，在4-20℃条件下检测反应管中溶液的荧光信号。
本发明的有益效果是：
1）检测速度快，本发明利用了变构适配体探针结合CEA后的快速变构原理，使变构适配体探针的荧光信号迅速地从猝灭状态转换到荧光恢复状态，不需要对背景信号分子进行洗涤；同时变构适配体探针自身的荧光信号足够强，不需要进一步信号放大，因此达到了操作步骤简单，检测速度快，只需把样品加入到变构适配体探针溶液当中即可上机检测，从样品处理到获得实验结果只需数分钟。
2）检测通量高，对于荧光信号通常是用荧光分光光度计检测（只有1-4个上样孔），而本发明技术采用qPCR仪可对近百个(96个)样品同时检测。
3）在低温条件下检测，结果比较准确。发明人在研究的过程中发现，在低温条件下检测比在高温条件下检测更准确，随着温度的升高，适配体探针自身会发生变构，导致发夹结构打开，进而失去了对CEA的响应功能，最终导致检测灵敏度和准确性下降，通过qPCR仪在低温条件下分析变构适配体探针对CEA的响应所得到的实验结果比在常温或高温条件下所得到的实验结果更准确。
附图说明
图1是基于变构适配体探针的快速高通量检测CEA的原理图。
图2是适配体互补序列长度变化对CEA响应灵敏度的影响； (a-f)展示了变构适配体在1 ng/mL CEA （红色曲线）和0 ng/mL CEA （对照组，黑色曲线）条件下的温度溶解曲线；其中，（a)-(f)对应的适配体互补序列长度分别为5 bp (Aptamer 5)、7 bp (Aptamer7)、9 bp (Aptamer 9)、11 bp (Aptamer11）、13 bp (Aptamer 13)和15 bp (Aptamer 15)。
图3是适配体互补序列长度变化对检测CEA信噪比(S/N)的影响；误差线代表了五次重复实验。
图4 是适配体(Aptamer 9)在不同浓度CEA条件下的温度溶解曲线；(a)展示了适配体荧光值随着温度升高而发生的变化；（b）展示了变构适配体荧光值随温度变化的导数（-Rn）。
图5是适配体(Aptamer 9)荧光值响应和解链温度响应对CEA浓度做图得到的标准曲线图；(a)和(b)分别展示了在10℃和30℃测得的荧光强度对CEA浓度做图得到的标准曲线；（c）展示了由溶解曲线测得的解链温度（Tm）对CEA浓度做图得到的标准曲线；短直线表示对0.01-1 ng/mL范围内的点进行线性拟合。长直线表示对0.01-50 ng/mL范围内的点进行线性拟合。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
本发明选择Tabar, H.等人[Tabar, H., GHOLAMREZA, and C. Smith, DNAAptamers selected as a molecular probe fordiagnosis of cancerous cells. 2010]报导的CEA适配体（ATACCAGCTTATTCAATT）作为模板设计CEA变构适配体荧光探针,该适配体经过多个课题组的研究证实其对CEA的亲和力强、识别特异性高。本研究设计的CEA变构适配体荧光探针如附图1所示，分为三个部分：互补序列、链接序列和CEA识别序列。互补序列跟识别序列发生碱基互补，并通过链接序列相连接形成发夹结构。互补序列末端采用荧光染料修饰；所述识别序列末端采用荧光淬灭基团修饰。当探针不跟CEA结合的时候，发夹结构的适配体两端通过互补使FAM和BHQ1相互靠近，FAM的荧光被BHQ1猝灭，不能发出荧光。当探针跟CEA相结合的时候，发夹结构被打开，这时FAM和BHQ1的距离被拉开，FAM的荧光恢复，样品发出强烈的荧光。使用实时定量 PCR 仪在低温条件下可对近百个样品同时检测。
本发明的制备过程如下：
1）首先通过化学合成的方法制备出寡聚核苷酸；所述寡聚核苷酸的核心序列为5’AATTGAATACCCAACCCGCCCTACCCATACCAGCTTATTCAATT3’，其中5’端的9个碱基和3’端的9个碱基形成反向互补。互补序列增加或减少1-3个碱基均可。
2） 通过化学合成的方法对上述寡聚核苷酸的5‘端修饰上荧光基团，互补序列末端修饰上羧基荧光素（Carboxyfluorescein，简称FAM），3’端修饰上荧光猝灭基团，识别序列末端修饰上黑洞猝灭基团（Black Hole Quencher 1, 简称BHQ1），得到变构适配体荧光探针。
3）把上述荧光探针溶解于水中，配置成浓度为0.05~5 uM的适配体探针溶液。
4）向qPCR反应管中加入10-40 uL上述适配体探针溶液，同时加入2-40 uL待测样品，使探针溶液和待测样品的体积比为1~20。
5）把上述qPCR反应管放入定量PCR仪（例如但不局限于StepOnePlus™检测系统）当中，在低温（4-20℃）条件下检测反应管中溶液的荧光信号。反应管中溶液的荧光信号强度跟反应管中CEA的含量成正比。
实施例 2
把实施例1适配体探针用超纯水溶解，配置成0.5 Mol的适配体荧光探针溶液。用移液器吸取10 ul适配体荧光探针溶液到PCR反应管。向上述PCR反应管中加入10 ul样品溶液。把制备好的待测样品放入StepOnePlus实时定量 PCR 仪的96孔板中。设置检测程序如下：80 ℃，10s; 4 ℃，10s；溶解温度4-90℃，温差1℃。最后取温度和荧光值进行双坐标绘图，结果如图2和图4所示。
实验结果表明：图2展示了不同互补序列长度的适配体在1 ng/mL CEA环境下的温度溶解曲线。当互补序列为5个碱基时（如附图2a所示)，由于适配体发夹结构的解链温度较低，部分适配体在低温下条件下发夹结构被打开，导致低温环境下荧光背景较高（大于20k)。本研究定义，CEA作用组适配体溶解曲线的最大荧光值/对照组同一温度位点的荧光值为信噪比（S/N），如附图2a所示。因此，当互补序列为5个碱基时，信噪比为4.2。随着互补序列的增加，发夹结构打开的难度增大，低温环境下的荧光背景信号降低，如附图2b-f。但是，当互补序列长度大于13bp的时候（附图2e-f)，适配体发夹结构很难被CEA促发打开，导致信噪比大大降低。综上所述，我们采用互补序列为9bp的适配体探针（简称Aptamer 9)做后继实验，此时检测1ng/mL CEA得到的信噪比为最高值（12.8), 如附图3所示.
把不同浓度的CEA跟适配体探针溶液混合后，经过定量 PCR 仪溶解曲线分析，结果如附图4a所示。在0.01-50 ng/mL范围内，CEA浓度越高，适配体探针响应荧光值就越大。对温度溶解曲线的荧光值变化进行斜率转换可得适配体探针的解链温度，如附图4b所示，倒峰位点对应的温度为解链温度。从图中可看出，在0.01-0.1 ng/mL范围内，CEA的浓度越高，解链温度就越小；当CEA的浓度大于0.1 ng/mL时，解链温度的变化不明显。上述实验结果说明，本研究设计的适配体探针对CEA浓度变化的荧光值响应和解链温度响应均可以用来指示样品中CEA的含量。
实施例3
将实施例1荧光探针溶解于水中，配置成浓度为0.05 uM的适配体探针溶液。向qPCR反应管中加入10 uL上述适配体探针溶液，同时加入10 uL待测样品。把上述qPCR反应管放入定量PCR仪当中，在10℃条件下检测反应管中溶液的荧光信号。结果如图3和图5所示。图3，对比不同适配体对CEA响应的信噪比,。图5，取荧光信号强调和CEA浓度进行线性拟合得到的标准曲线。
实验结果表明：分别取低温（10 ℃）和高温（30 ℃）条件下的荧光响应值做标准曲线，如附图5a和附图5b所示。在低温条件下，探针的荧光响应值跟CEA的浓度呈良好的线性关系：在0.01-1 ng/mL和0.01-50n g/mL范围内，相关系数R2分别为0.9804和0.9780。在高温条件下，探针的荧光响应值跟CEA浓度的线性关系较差，在0.01-1ng/mL和0.01-50n g/mL范围内，相关系数R2分别为0.5843和0.9482。使用解链温度（Tm）做标准曲线时，Tm响应值跟CEA浓度的线性关系较差,在0.01-1 ng/mL和0.01-50n g/mL范围内，相关系数R2分别为0.9435和0.8452，如附图5c所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。
序列表
<110> 广西医科大学
<120> 一种快速高通量检测癌胚抗原的适配体生物传感器
<141> 2021-06-16
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 1
aattgaatac ccaacccgcc ctacccatac cagcttattc aatt 44
Claims (5)
1.一种快速高通量检测癌胚抗原的适配体生物传感器，其特征在于，包括CEA变构适配体荧光探针；
所述CEA变构适配体荧光探针为发夹结构；
所述CEA变构适配体荧光探针包括互补序列、链接序列和CEA识别序列；
所述CEA变构适配体荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述互补序列末端采用荧光染料修饰；所述识别序列末端采用荧光淬灭基团修饰。
2.根据权利要求1所述的快速高通量检测癌胚抗原的适配体生物传感器，其特征在于，所述互补序列末端采用羧基荧光素修饰；所述识别序列末端采用黑洞猝灭基团修饰。
3.根据权利要求1所述的快速高通量检测癌胚抗原的适配体生物传感器，其特征在于，所述CEA变构适配体荧光探针和CEA结合时，采用实时定量PCR仪进行检测。
4.根据权利要求3所述的快速高通量检测癌胚抗原的适配体生物传感器，其特征在于，采用实时定量PCR仪进行检测的温度为4-20℃。
5.根据权利要求3所述的快速高通量检测癌胚抗原的适配体生物传感器，其特征在于，所述实时定量PCR仪进行检测时，探针溶液和待测样品的体积比为1：1～20。
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