CN114739976A - 一种sers探针生物传感器及其制备方法和使用方法 - Google Patents
一种sers探针生物传感器及其制备方法和使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114739976A CN114739976A CN202210379218.7A CN202210379218A CN114739976A CN 114739976 A CN114739976 A CN 114739976A CN 202210379218 A CN202210379218 A CN 202210379218A CN 114739976 A CN114739976 A CN 114739976A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- dna
- sers
- dna probe
- biosensor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
- G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种SERS探针生物传感器及其制备方法和使用方法，涉及生物技术领域。该SERS探针生物传感器包括DNA探针1、DNA探针2和适配体，所述DNA探针1和DNA探针2上至少有5个碱基互补配对，DNA探针1和DNA探针2上的剩余碱基与所述适配体上的碱基互补配对，且DNA探针1、DNA探针2和适配体两两配对形成Y形，所述DNA探针1还共价连接拉曼报告分子修饰的金纳米颗粒，所述DNA探针2共价连接表面修饰链霉亲和素的磁珠。本发明制备得到的SERS探针生物传感器具有高灵敏度、高特异性、样本消耗量少、精确度高的高的优点，能有效实现急性肾损伤的精准诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种SERS探针生物传感器及其制备方法和使用方法。
背景技术
特异性检测生物标志物可以指示疾病的存在、严重程度或进展。一般来说，生物标志物是一种代表结构、生理、遗传或生化参数变化的蛋白质，其异常表达往往比临床影像学发现更早被发现，在精准诊断领域显示出巨大的潜力。在过去的几十年里，生物标志物检测技术由于生物标志物的独特性质而引起了人们的极大关注，并被广泛应用于不同疾病的诊断中。例如，利用荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、表面等离子共振等多种检测方法来实现对特定生物标志物的直接检测。然而，这些传统技术在灵敏度、稳定性和操作复杂性等方面仍存在一些问题。此外，疾病的生物标志物通常在血液或组织中含量非常少，尤其是在疾病的早期，这增加了准确检测的难度。鉴于此，迫切需要开发一种特异性、快速、超灵敏的生物标志物检测技术，用于疾病的早期诊断。
表面增强拉曼散射(SERS)技术作为一种超灵敏的分析检测方法，可以在分子水平上提供生物物质的指纹信息，不仅可以量化蛋白质浓度，还可以分析蛋白质结构，从而实现蛋白质的准确检测。生物标志物中由于相邻纳米粒子之间独特的等离子体耦合，电磁场非常强，SERS信号可以高度响应“热点”的分形分布。此外，由于功能性金属纳米颗粒基于SERS的免疫测定技术，具有出色的灵敏度和多重检测能力，在疾病早期诊断领域引起了极大的兴趣。在申请人的早期的工作中，就已成功地制作了基于抗体识别的SERS探针，并可以对几种代表性的蛋白质生物标志物进行灵敏检测，从而准确诊断前列腺癌和急性心肌梗死。这些发现表明，通过对生物标志物进行快速、原位和无损检测，用于快速和灵敏疾病诊断的SERS检测技术往往成为研究重点。与抗体相比，适配体具有免疫原性低、合成可重复、成本低、易于修饰、结构转换能力强、长期稳定性好等优点。因此，申请人最近的研究致力于通过DNA适配体与目标分析物的强结合构建基于SERS的适配体生物传感器，以实现对复杂混合样品中生物标志物的选择性检测。
关于急性肾损伤(AKI)，它首先引发生物和分子变化，然后发展为细胞损伤，这在用于诊断AKI的血清肌酐升高之前就能被特定的生物标志物检测到，尤其是能在老年人和营养不良的患者中检测到。
目前，已发现一系列生物标志物，如中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、白细胞介素-18、胱抑素C(Cys C)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶和netrin-1存在与功能性肾脏相关的疾病蛋白。例如，NGAL作为一种在损伤后立即上调的肾小管蛋白生物标志物，已被大量研究证实，在不同的临床情况下表现出显著的早期诊断性能。此外，Cys C是人体必需的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，已被提议作为用于AKI检测的肾小球滤过率的迷人生物标志物。然而，由于血液或组织中存在许多其他生物干扰成分，单一的生物标志物总是无法实现所需的临床特异性。
因此，考虑到NGAL和Cys C在AKI发生和进展中的关键作用，开发基于SERS的检测技术实现NGAL和Cys C的双重检测，对AKI的准确诊断具有重要意义。
发明内容
本发明提供的一种SERS探针生物传感器及其制备方法和使用方法，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
为了实现上述技术目的，本发明主要采用以下技术方案：
一种SERS探针生物传感器，包括DNA探针1、DNA探针2和适配体，所述DNA探针1和DNA探针2上至少有5个碱基互补配对，DNA探针1和DNA探针2上的剩余碱基与所述适配体上的碱基互补配对，且DNA探针1、DNA探针2和适配体两两配对形成Y形，所述DNA探针1还共价连接拉曼报告分子修饰的金纳米颗粒，所述DNA探针2共价连接表面修饰链霉亲和素的磁珠。
优选的，所述拉曼报告分子为异硫氰基-孔雀石绿(MGITC)。MGITC被选为拉曼报告分子，因为它在π共轭形式下通过金纳米的Au-S共价键吸收在有毒基质条件下是稳定的。此外，使用MGITC在1618cm-1处的特征拉曼峰(芳环拉伸)可以实现SERS量化。
进一步的，所述DNA探针1通过Au-S键与所述拉曼报告分子修饰的金纳米颗粒共价连接，所述DNA探针2通过SA-Biotin反应与所述表面修饰链霉亲和素的磁珠共价连接。
本发明还提供了上述SERS探针生物传感器的制备方法，主要包括以下步骤：
S1金纳米颗粒的制备：将柠檬酸钠溶液与氯金酸溶液加入到反应器内反应，制得金纳米颗粒；
S2拉曼报告分子标记的金纳米的制备：将拉曼报告分子添加到步骤S1制备的金纳米颗粒中，室温搅拌反应，直至拉曼报告分子通过Au-S键固定在金纳米颗粒表面，然后离心去除未结合的拉曼报告分子；
S3 DNA功能化的SERS探针的制备：将DNA探针1与三(2-羧乙基)膦混合孵育，得到混合物1，然后将步骤S2制备得到的拉曼报告分子标记的金纳米加入混合物1中孵育过夜，得到混合物2，再在24小时内将PBS逐渐添加到混合物2中，再用双蒸水洗涤，去除未结合的DNA，制备得到DNA功能化的SERS探针；
S4 DNA功能化的表面修饰链霉亲和素的磁珠的制备：将DNA探针2与表面修饰链霉亲和素的磁珠混合孵育，在室温下振荡，并用纯净水洗涤后，分散到PBS中，得到DNA功能化的表面修饰链霉亲和素的磁珠；
S5 SERS探针生物传感器的制备：将步骤S3制备得到的DNA功能化的SERS探针分散到步骤S4制备得到的DNA功能化的表面修饰链霉亲和素的磁珠中，再加入适配体，并在室温下一起孵育过夜，用纯净水洗涤后，得到Y型SERS探针生物传感器。
其中，所述DNA探针1、DNA探针2和适配体在使用前还包括预处理步骤：将DNA探针1、DNA探针2和适配体分散在TE缓冲液中，并在水浴中加热至95℃5分钟，然后将其冷却至室温并储存在4℃以供进一步使用。
作为本发明的其中一个实施例，所述步骤S3中，DNA探针1与三(2-羧乙基)膦的体积比为10:1，摩尔比为1:2000。
作为本发明的其中一个实施例，所述步骤S4中，DNA探针2与表面修饰链霉亲和素的磁珠的体积比为1:2，摩尔比为100:3。
作为本发明的其中一个实施例，所述DNA探针1、DNA探针2和适配体的浓度及摩尔量都相等。
本发明还提供了一种使用上述SERS探针生物传感器检测急性肾损伤中蛋白质生物标志物的方法，包括：将样品和SERS探针生物传感器混合孵育，然后分离上清液，检测上清液中是否含有SERS信号。
优选的，所述蛋白质生物标志物的检测为中性粒细胞明胶酶脂质运载蛋白(NGAL)和胱抑素C(Cys C)的双重检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明开发了一种灵敏且准确的AKI诊断技术，通过独特的Y型适配体辅助SERS传感平台，基于磁分离，使用识别释放机制来检测AKI的双重生物标志物，具有灵敏度高的优点。
2、本发明通过DNA功能化的拉曼报告标记的金纳米颗粒，然后将SERS探针与DNA功能化的共轭磁珠和生物标志物的选择性适配体混合，形成Y型DNA结构，在检测AKI相关的生物标志物NGAL和Cys C时，通过从磁珠上预先构建的Y型结构释放到上清液的SERS探针来检测，然后使用拉曼光谱仪对上清液进行SERS扫描可以对双生物标志物进行灵敏的定量检测，具有临床特异性，对AKI的准确诊断具有重要意义。
3、SERS探针生物传感器使用金属纳米颗粒热点效应增强拉曼信号，有效实现高灵敏检测；
4、SERS探针生物传感器针对特异性生物标志物识别不受其他非靶标生物标志物生物影响，具有特异性高的优点；
5、SERS探针生物传感器单次检测样本需求量少，解决了目前临床大型检测仪器样本消耗问题；
6、SERS探针生物传感器可对双生物标志物进行分析，实现急性肾损伤的精准诊断，精确度高。
附图说明
图1为本发明中SERS探针生物传感器的的检测流程；
图2为本发明中拉曼活性SERS探针的合成示意图；
图3为本发明中SERS探针生物传感器构建过程中金纳米的DLS强度图；
图4为本发明中SERS探针生物传感器中Y型适配体的电泳特性表征数据；
图5为本发明中SERS探针生物传感器的生物标志物传感的可行性验证图；
图6为本发明中SERS探针生物传感器的选择性示意图；
图7为本发明中SERS探针生物传感器对于双AKI生物标志物的工作曲线图；
图8为本发明中SERS探针生物对于药物诱导后大鼠血液中生物标志物的检测图。
具体实施方式
以下将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明，凡在本发明的主体设计思想上经过无创造性的替代或变换所获得的其他实施例，都在本发明的保护范围之内。
实施例1：SERS探针生物传感器的制备
金纳米颗粒的合成制备：
将75mL的2.2mM柠檬酸钠添加到三颈圆底并加热至沸腾，同时利用冷凝器来防止溶剂蒸发。在此步骤之后，添加0.5mL的25mM HAuCl4并在搅拌下煮沸，发现溶液的颜色在15分钟内首先从淡黄色变为灰蓝色，最后变为粉红色。沸腾的液体立即在同一容器中冷却，直到温度达到90℃。接下来，依次加入0.5mL 60mM柠檬酸钠和0.5mL 25mM HAuCl4溶液，持续约2分钟。通过重复这个过程，可以生长出12代尺寸逐渐变大的金颗粒。之后，将溶液在90℃再搅拌30分钟并冷却至室温。
拉曼报告分子标记的金纳米的制备：
将拉曼报告分子MGITC(1μL，10-4M)添加到5mL金纳米颗粒中，并在室温下剧烈搅拌1小时，直到MGITC通过Au-S键固定在金纳米表面。进行离心过程(8000rpm，25分钟)以去除未结合的MGITC。最后，将制备的MGITC标记的金纳米储存在4℃以供进一步使用。
DNA探针1、DNA探针2和适配体的预处理：
将DNA探针1、DNA探针2和适配体分散在TE缓冲液(1M Tris-HCl 5mL,pH＝8.005MEDTA1mL)中，并在水浴中加热至95℃5分钟。将其冷却至室温并储存在4℃以供进一步使用。
其中，用于检测NGAL的Y型适配体SERS探针序列和用于检测Cys C的Y型适配体SERS探针序列如下表1、表2所示。
表2：用于检测Cys C的Y型适配体SERS探针序列
DNA功能化的SERS探针的制备：
首先，将100μL的10μM硫醇化的DNA探针1与10μL 20mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)一起孵育60分钟，使其在室温下活化，得到混合物1，然后，将0.5mL拉曼报告分子标记的金纳米在室温下在混合物1中孵育过夜，得到混合物2，在24小时内将120μL PBS(盐水)逐渐添加到混合物2中。随后，MGITC标记的金纳米用双蒸水洗涤以去除未结合的DNA。最后，获得DNA功能化的SERS探针并储存在4℃的PBS中以供进一步使用。
金纳米颗粒易于合成，金纳米颗粒的等离子体吸收与入射激光(633nm)之间的重叠显著增加了信号强度。拉曼活性SERS探针的合成如图2所示。简而言之，金纳米是通过在沸腾条件下用柠檬酸钠还原HAuCl4制备的，通过12轮种子生长，由相应的水合粒径确定(图2b)金纳米最终的平均直径为50nm，并在520nm处有最大的UV-vis吸收(图2a)。图2c显示了金纳米颗粒的TEM图像，在直径约40nm处表现出良好的分散性和形态(图2d)。
为了将带负电荷的DNA探针1附着到带负电荷的MGITC标记的金纳米上，使用了盐老化方法。在硫醇(SH)-DNA探针1和MGITC标记的金纳米的混合物2中逐渐加入盐以减少电荷排斥。在洗涤步骤中加入MGITC和DNA探针1后，发现金纳米的最大DLS强度(图3)增加了约10nm。这些结果表明拉曼报告基因和探针DNA成功结合到金纳米上。
DNA功能化的表面修饰链霉亲和素的磁珠的制备：
生物素化的DNA探针2通过SA-Biotin反应在DNA探针2的3'端与表面修饰链霉亲和素的磁珠结合。首先，将100μL的10μM DNA探针2与200μL表面修饰链霉亲和素的磁珠(300nm)一起孵育，在室温下振荡1小时，得到DNA功能化的表面修饰链霉亲和素的磁珠。
SERS探针生物传感器的制备：
将制备得到的DNA功能化的SERS探针分散到制备得到的DNA功能化的表面修饰链霉亲和素的磁珠中，再加入100μL的10μM适配体，并在室温下一起孵育过夜，最终溶液用纯水洗涤3次，得到Y型SERS探针生物传感器，使用前4℃保存。
实施例2：Y型适配体的电泳特性表征
为了确定Y型适配体探针的形成，首先通过凝胶电泳研究了Y型DNA探针。当DNA探针1、DNA探针2和适配体同时存在时，观察到新的条带，表明Y型结构杂交成功。如图4a所示。DNA对应条带出现在1-6。1泳道为DNA探针1、NGAL适配体，2泳道为DNA探针2、NGAL适配体，3泳道为DNA探针1、DNA探针2、NGAL适配体，当适配体与DNA探针1和DNA探针2分别孵育时，在泳道1和泳道2中分别出现了89bp、89bp的新条带。当适配体与DNA探针1和DNA探针2一起存在时，在泳道3中观察到一系列新的条带，长度为103bp。当Cys C适配体分别与DNA探针1'和DNA探针2'一起孵育时，在泳道5和6中观察到新的条带，分别位于96bp、96bp。当适配体分别与DNA探针1'和DNA探针2'一起孵育时，在110bp的泳道6中观察到一系列新条带。这些结果表明，当适配体与DNA探针1和DNA探针2按实验设计共孵育时，Y型DNA结构成功杂交。
实施例3：SERS探针生物传感器的可行性
设计了三组杂交DNA模式，如图5a所示。在用TCEP激活巯基修饰的DNA探针1后，DNA探针1和DNA探针2分别耦合到MGITC修饰的金纳米和表面修饰链霉亲和素的磁珠的表面。然后，添加特定的适配体并与MGITC修饰的金纳米和表面修饰链霉亲和素磁珠共同孵育，形成模型Y型SERS探针生物传感器。
为了比较，申请人引入了与DNA探针1和适配体碱基均无互补配对能力的DNA链S2代替DNA探针2作为样品1。此外，申请人还尝试了在没有适配体的情况下作为样品2的DNA探针1和DNA探针2互补杂交的DNA模式。为了评估它们的结合能力，将样品放在磁力离心机上几秒钟，然后表面修饰链霉亲和素磁珠会在磁力作用下聚集。样品1中的红色表明游离的MGITC修饰的金纳米分散在上清液中，说明在链霉亲和素磁球表面上的DNA探针2是形成稳定纳米结构的必要条件之一(图5b)。在样品2中也观察到相同的结果，这主要归因于在没有适配体的情况下DNA探针1和DNA探针2的脆弱结合。然而，可以清楚地发现样品3中的上清液变为无色，表明所有的MGITC修饰的金纳米都与磁珠紧密结合(图5b)。这可以解释为适配体与其互补序列(DNA探针1和DNA探针2)之间的高亲和力，它们分别固定在金纳米和磁珠表面，诱导组装形成Y型结构，从而保持MGITC修饰的金纳米和彼此靠近的磁珠。
实施例4：SERS探针生物传感器的的检测流程
为了提高检测灵敏度，MGITC标记的金纳米颗粒被用作蛋白质生物标志物适配体传感器测定的常用SERS探针。如图1所示，金纳米和磁珠的表面分别用探针ssDNA进行了功能化。每个ssDNA序列由两部分组成，一部分ssDNA序列(DNA探针1)与另一部分DNA序列(DNA探针2)互补。相反，探针ssDNA序列的另一部分(DNA探针1和DNA探针2)与适配体序列的两部分互补。然后，将硫醇化DNA修饰的金纳米(DNA探针1)、生物素化DNA功能化磁珠(DNA探针2)和适配体在离心管中混合，形成Y型适配体传感器。在目标蛋白存在的情况下，由于适配体的特异性识别以及DNA探针1和DNA探针2在室温下不稳定的7bp杂化链，Y型结构会解体。随着NGAL或Cys C浓度的增加，磁珠上的金纳米数量减少，上清液中出现更多分散的金纳米，导致上清液的SERS信号显着增加。然后通过测量不同浓度的生物标志物的校准曲线和相应的SERS信号来实现AKI生物标志物的定量分析。
实施例5：SERS探针生物传感器的选择性
在该生物传感器中，AKI生物标志物的确定是基于相应适配体的特异性识别来实现的。在实际检测中，血清中可能存在其他常见的蛋白质共存，因此通过研究潜在干扰蛋白的交叉反应性，进一步评估构建的生物传感器的检测特异性。对于NGAL适配体传感器，HSA和Cys C等引入的干扰组分在1618cm-1的特征峰处几乎没有观察到拉曼信号。相反，NGAL导致拉曼信号强度发生显著变化，显示出对NGAL的良好检测灵敏度在开发的测定中。这可以归因于Y型设计的有利结构，它赋予适配体传感器选择性结合能力和对NGAL生物标志物的高度亲和力。同样，对于Cys C适配体传感器，它对Cys C检测也表现出出色的选择性，对HSA和NGAL几乎没有反应(图6)。
实施例6：AKI生物标志物的定量SERS分析
为了评估适配体传感器的检测性能，对AKI生物标志物进行了定量分析。选择MGITC(1618cm-1)的特征拉曼峰用于监测NGAL和Cys C水平。图7a显示了使用建议的测定法测试各种浓度的NGAL的SERS信号。可以发现，随着体系中NGAL浓度的增加，拉曼信号强度逐渐升高，代表了对NGAL的敏感且可激活的信号响应。在1ng/mL至10ng/mL范围内，基于增加的拉曼信号强度与NGAL浓度绘制的标准曲线显示，变化的拉曼强度与NGAL浓度之间具有良好的线性关系，相关系数(R2)为0.9791(图7b)。此外，从用于检测Cys C的SERS光谱也获得了类似的增加趋势(图7c)。SERS强度作为Cys C的函数，浓度从100到1000ngmL-1绘制在图7d中，并显示了良好的线性响应(R2＝0.9836)。此外，所开发的适配传感平台对NGAL和Cys C的检测限(LOD)分别计算为0.054ng/mL和0.32ng/mL，可以很好地满足临床应用的要求。
实施例7：双重检测和大鼠血浆基质应用
验证双链测定的性能及其在大鼠血浆基质中的应用。我们首先构建了大鼠AKI模型，并通过观察肾组织切片的H&E染色和药物治疗后不同时间点的SERS测定对其进行了研究。最重要的是，如图8a所示的肾脏切片的H&E染色显示在顺铂处理后24小时刷状缘和透明铸型消失。相比之下，来自对照组和空白组的肾切片的组织学染色显示正常的肾组织结构，这证明了AKI大鼠建模成功。SERS光谱的标准方程是从SERS光谱的特征峰1618cm-1强度获得的(NGAL：y＝7224.4x+309.05，R2＝0.994；Cys C：y＝5772.93x+337.12，R2＝0.983)。与探针孵育后取大鼠血浆上清液进行SERS检测，将I1618值代入方程，得到NGAL、Cys C浓度，如图8b、8c所示，该图显示，大鼠血液中的靶蛋白浓度水平在AKI4到6小时之间显着增加，这使得SERS能够比大鼠体内荧光成像更早地检测到靶蛋白浓度水平的变化。这也提示Y型适配体探针可用于AKI大鼠体外SERS检测，在AKI早期有明显反应。
实施例8：准血清样品检测
为评估在临床场景中用于双重检测NGAL和Cys C的性能。在标准曲线的线性动态范围内选择的浓度为0.1、1、10ng/μL和10、100、1000ng/μL。将不同浓度的生物标志物混合并添加到血浆中，在使用Y型适配体传感器对加标样品进行双重检测后，随着NGAL和Cys C浓度的增加，SERS信号强度按预期增加。通过监测相应测试线在1618cm-1处的SERS信号强度，对加标的NGAL和Cys C样品进行定量分析。源自NGAL和Cys C校准曲线的线性回归方程用于根据SERS信号强度计算加标样品中生物标志物的回收浓度。
然后，每个样品的NGAL和Cys C的近似浓度可以通过所提出的生物传感器基于已建立的校准曲线来确定。这些结果总结在表3中。可以发现AKI患者的NGAL和Cys C浓度范围为28.93至44.01ng/mL和904至1201ng/mL。通过分析两种不同测定法测定的浓度之间的一致性，我们发现SERS测定法测定的NGAL和Cys浓度与ELISA测定法测定的浓度高度相关。此外，由(CSERS-CELISA)/CELISA×100％计算的检测偏差显示在表3中。这些结果表明，SERS检测能够达到ELISA检测对NGAL和Cys C的检测精度。此外，与常用的ELISA方法(100μL)相比，SERS检测具有更大的动态范围(10-2-105ng/mL)以及更少的血样需求(仅5μL)。基于SERS探针的生物传感器的这些令人兴奋的性能表明，该方法具有成为临床实践中NGAL和Cys C检测的替代工具的潜力。
表格3基于SERS的NGAL、Cys C测定(数量＝5)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 海南医学院
<120> 一种SERS探针生物传感器及其制备方法和使用方法
<130> 2022.04.12
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
agcagcacag aggtcagatg gcgctggata gcaagatcac gttatcatcg taaaccctat 60
gcgtgctacc gtgaa 75
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ctgtgactgc tgct 14
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
acctcgtgtc acag 14
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
ctgtgaccca tctg 14
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
tccagcggtc acag 14
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
ctgtgacctt gcta 14
<210> 7
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
acgtgatgtc acag 14
<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
ctgtgacgat gata 14
<210> 9
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
ggtttacgtc acag 14
<210> 10
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
ctgtgaccgc atag 14
<210> 11
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
ggtagcagtc acag 14
<210> 12
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
cctaaccgat atcacactca cgaactgtcg gaactcgggc caaatggacg agcgaccatt 60
ggttgttcgt cattggagta tc 82
<210> 13
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
ctgtgacggt tagg 14
<210> 14
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
tgatatcgtc acag 14
<210> 15
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
ctgtgacgtg agtg 14
<210> 16
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
acagttcgtc acag 14
<210> 17
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
ctgtgacagt tccg 14
<210> 18
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
tggcccggtc acag 14
<210> 19
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 19
ctgtgacgtc catt 14
<210> 20
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 20
gtcgctcgtc acag 14
<210> 21
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 21
ctgtgacacc aatg 14
<210> 22
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 22
acgaacagtc acag 14
<210> 23
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 23
ctgtgaccaa tgac 14
<210> 24
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 24
gatactcgtc acag 14
Claims (10)
1.一种SERS探针生物传感器，其特征在于：包括DNA探针1、DNA探针2和适配体，所述DNA探针1和DNA探针2上至少有5个碱基互补配对，DNA探针1和DNA探针2上的剩余碱基与所述适配体上的碱基互补配对，且DNA探针1、DNA探针2和适配体两两配对形成Y型，所述DNA探针1还共价连接拉曼报告分子修饰的金纳米颗粒，所述DNA探针2共价连接表面修饰链霉亲和素的磁珠。
2.根据权利要求1所述的SERS探针生物传感器，其特征在于：所述拉曼报告分子为异硫氰基-孔雀石绿(MGITC)。
3.根据权利要求1所述的SERS探针生物传感器，其特征在于：所述DNA探针1通过Au-S键与所述拉曼报告分子修饰的金纳米颗粒共价连接，所述DNA探针2通过SA-Biotin反应与所述表面修饰链霉亲和素的磁珠共价连接。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的SERS探针生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1金纳米颗粒的制备：将柠檬酸钠溶液与氯金酸溶液加入到反应器内反应，制得金纳米颗粒；
S2拉曼报告分子标记的金纳米的制备：将拉曼报告分子添加到步骤S1制备的金纳米颗粒中，室温搅拌反应，直至拉曼报告分子通过Au-S键固定在金纳米颗粒表面，然后离心去除未结合的拉曼报告分子；
S3 DNA功能化的SERS探针的制备：将DNA探针1与三(2-羧乙基)膦混合孵育，得到混合物1，然后将步骤S2制备得到的拉曼报告分子标记的金纳米加入混合物1中孵育过夜，得到混合物2，再在24小时内将PBS逐渐添加到混合物2中，再用双蒸水洗涤，去除未结合的DNA，制备得到DNA功能化的SERS探针；
S4 DNA功能化的表面修饰链霉亲和素的磁珠的制备：将DNA探针2与表面修饰链霉亲和素的磁珠混合孵育，在室温下振荡，并用纯净水洗涤后，分散到PBS中，得到DNA功能化的表面修饰链霉亲和素的磁珠；
S5 SERS探针生物传感器的制备：将步骤S3制备得到的DNA功能化的SERS探针分散到步骤S4制备得到的DNA功能化的表面修饰链霉亲和素的磁珠中，再加入适配体，并在室温下一起孵育过夜，用纯净水洗涤后，得到Y型SERS探针生物传感器。
5.根据权利要求4所述的SERS探针生物传感器的制备方法，其特征在于，所述DNA探针1、DNA探针2和适配体在使用前还包括预处理步骤：将DNA探针1、DNA探针2和适配体分散在TE缓冲液中，并在水浴中加热至95℃5分钟，然后将其冷却至室温并储存在4℃以供进一步使用。
6.根据权利要求4所述的SERS探针生物传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中，DNA探针1与三(2-羧乙基)膦的体积比为10:1，摩尔比为1:2000。
7.根据权利要求4所述的SERS探针生物传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中，DNA探针2与表面修饰链霉亲和素的磁珠的体积比为1:2，摩尔比为100:3。
8.根据权利要求4所述的SERS探针生物传感器的制备方法，其特征在于：所述DNA探针1、DNA探针2和适配体的浓度及摩尔量都相等。
9.一种使用权利要求1-3任一项所述的SERS探针生物传感器检测急性肾损伤中蛋白质生物标志物的方法，其特征在于，包括：将样品和SERS探针生物传感器混合孵育，然后分离上清液，检测上清液中是否含有SERS信号。
10.根据权利要求9所述的SERS探针生物传感器检测急性肾损伤中蛋白质生物标志物的方法，其特征在于：所述蛋白质生物标志物的检测为中性粒细胞明胶酶脂质运载蛋白(NGAL)和胱抑素C(Cys C)的双重检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210379218.7A CN114739976A (zh) | 2022-04-12 | 2022-04-12 | 一种sers探针生物传感器及其制备方法和使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210379218.7A CN114739976A (zh) | 2022-04-12 | 2022-04-12 | 一种sers探针生物传感器及其制备方法和使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114739976A true CN114739976A (zh) | 2022-07-12 |
Family
ID=82281635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210379218.7A Pending CN114739976A (zh) | 2022-04-12 | 2022-04-12 | 一种sers探针生物传感器及其制备方法和使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114739976A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117070603A (zh) * | 2023-08-28 | 2023-11-17 | 海南医学院 | 一种用于miRNA检测的探针及其检测方法和应用 |
| CN117434045A (zh) * | 2023-11-02 | 2024-01-23 | 中国海洋大学 | 基于sers标记检测和机器学习的同时检测两种兽药的方法 |
-
2022
- 2022-04-12 CN CN202210379218.7A patent/CN114739976A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117070603A (zh) * | 2023-08-28 | 2023-11-17 | 海南医学院 | 一种用于miRNA检测的探针及其检测方法和应用 |
| CN117434045A (zh) * | 2023-11-02 | 2024-01-23 | 中国海洋大学 | 基于sers标记检测和机器学习的同时检测两种兽药的方法 |
| CN117434045B (zh) * | 2023-11-02 | 2024-07-19 | 中国海洋大学 | 基于sers标记检测和机器学习的同时检测两种兽药的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Akkilic et al. | Single-molecule biosensors: Recent advances and applications | |
| Ferhan et al. | Nanoplasmonic sensors for detecting circulating cancer biomarkers | |
| Qu et al. | Novel turn-on fluorescent detection of alkaline phosphatase based on green synthesized carbon dots and MnO2 nanosheets | |
| Laing et al. | Multiplex in vitro detection using SERS | |
| Liu et al. | Supersandwich cytosensor for selective and ultrasensitive detection of cancer cells using aptamer-DNA concatamer-quantum dots probes | |
| EP1981994B1 (en) | Sers nanotag assays | |
| Wang et al. | Advanced on-site and in vitro signal amplification biosensors for biomolecule analysis | |
| Kordasht et al. | Biomedical analysis of exosomes using biosensing methods: recent progress | |
| CN114739976A (zh) | 一种sers探针生物传感器及其制备方法和使用方法 | |
| Solhi et al. | Critical role of biosensing on the efficient monitoring of cancer proteins/biomarkers using label-free aptamer based bioassay | |
| Thaxton et al. | Optically and chemically encoded nanoparticle materials for DNA and protein detection | |
| JP2008154493A (ja) | 分離精製方法とマイクロ流体回路 | |
| US9482616B2 (en) | Methods, kits and systems for signal amplification for bioassays using zinc nanoparticles | |
| Li et al. | Digital concentration readout of DNA by absolute quantification of optically countable gold nanorods | |
| Bonnet et al. | Highly labeled methylene blue-ds DNA silica nanoparticles for signal enhancement of immunoassays: application to the sensitive detection of bacteria in human platelet concentrates | |
| KR101591475B1 (ko) | 레일리 산란을 이용한 순환 종양 DNA(ctDNA)의 종양 특이적 돌연변이와 후성유전학적 변이의 동시 검출방법 | |
| Sun et al. | Multistage nucleic acid amplification induced nano-aggregation for 3D hotspots-improved SERS detection of circulating miRNAs | |
| Liao et al. | Signal-on and label-free electrochemical detection of amyloid β oligomers based on dual amplification induced hemin/G-quadruplex formation | |
| US8026108B1 (en) | Detection of biotargets using bioreceptor functionalized nanoparticles | |
| Li et al. | Determining alkaline phosphatase based on core–shell gold@ silver nanocubes by single-particle dark-field images | |
| Pishbin et al. | Recent advances in isolation and detection of exosomal microRNAs related to Alzheimer's disease | |
| CN113203718B (zh) | 一种基于荧光共振能量转移的gpc3检测方法 | |
| Hallaj et al. | Induced ultrasensitive electrochemical biosensor for target MDA-MB-231 cell cytoplasmic protein detection based on RNA-cleavage DNAzyme catalytic reaction | |
| CN110553991A (zh) | 基于中空金纳米粒-dna复合物的生物/化学检测试剂和检测方法 | |
| CN116536240A (zh) | 一种基于双适配体识别分离并检测细胞外囊泡的试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |