CN105755101B

CN105755101B - 一种基于单个量子点水平检测dna糖基化酶活性的方法

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Publication number: CN105755101B
Application number: CN201610150395.2A
Authority: CN
Inventors: 张春阳; 唐波; 王黎娟; 马飞
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2016-03-16
Filing date: 2016-03-16
Publication date: 2018-10-26
Anticipated expiration: 2036-03-16
Also published as: CN105755101A

Abstract

本发明公开了一种基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶活性的方法。检测时，DNA糖基化酶hOGG1会特异性识别并切除损伤鸟嘌呤，留下一个脱碱基位点，脱嘌呤核酸内切酶‑1会对脱碱基位点进一步剪切，留下一个核苷酸的缺口，DNA聚合酶β将Cy5‑dGTP聚合在该缺口处，生成双标记的双链核苷酸底物，通过生物素与链霉亲合素之间的特异性反应，DNA底物会结合在覆盖有链霉亲合素的量子点的表面，形成QD‑DNA‑Cy5复合物，空间距离缩小，导致量子点和Cy5之间发生荧光共振能量转移，从而可以在单分子水平观察到Cy5的荧光信号。本发明所述检测方法简单、快速、灵敏，检测下限可达1.8×10^‑6U/μL。

Description

一种基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶活性的方法

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶活性的方法。

背景技术

基因组DNA完整性的维持对于物种的稳定具有十分重要的意义，但在现实生活中，基因组DNA不可避免地受到来自体内外各种因素的影响，外源的如辐射(UV)、化学诱变剂等，内源的如活性氧化物质(ROS)等，这些因素会导致DNA单、双链断裂，错配，碱基缺失，从而破坏基因组完整性，影响物种的生存。为了减少DNA损伤，生物体在进化过程中形成了多种损伤修复机制，仅针对单碱基突变就有错配修复(MMR)，碱基切除修复(BER)，核苷酸切除修复(NER)等，其中碱基切除修复(BER)是修复碱基氧化损伤最重要方式。而启动碱基切除修复(BER)过程最关键的一步就是由DNA糖基化酶催化完成的。DNA糖基化酶是一类负责损伤碱基识别和碱基切除启动的酶类，它的功能异常会导致切除修复机制无法运行，从而引发各种疾病。如在帕金森病人体内可检测到DNA糖基化酶hOGG1有较高的活性。据报道可知，DNA糖基化酶hOGG1与多种癌症如肺癌、乳腺癌、胃癌、胆囊癌、膀胱癌以咽喉癌都有着密切的关联，因此DNA糖基化酶hOGG1是重要的生物标志物之一。

高灵敏地检测DNA糖基化酶活性对于癌症等相关疾病的早期诊断和药物筛选有重要的意义。现有的DNA糖基化酶hOGG1活性检测技术主要包括凝胶电泳(gelelectrophoresis)，放射性标记(radiolabeling)，质谱分析(MS)，以及高效液相色谱分析(HPLC)。这些检测方法十分有效，但是非常的耗时，操作繁琐，而且存在安全隐患。

为了克服以上缺点，近年来也发展了以纳米技术为基础的比色检测法以及各种荧光染料为基础的荧光探针检测法，如CN105132522A公开了DNA三向节活化的杂交链式反应用于尿嘧啶DNA糖基化酶的高灵敏检测，以DNA糖基化酶UDG为模型，开发了发夹重构的识别机制，将DNA修饰酶对底物的作用转化为杂交链式反应的触发过程，从而引起DNA的自组装过程，并实现了通用性DNA纳米器件的构建，该器件能够用于DNA修饰酶(尤其是UDG)的高灵敏检测，其中UDG的检测下限达到0.000043U/mL；CN104630363A公开了一种基于免标记无酶DNA机器荧光放大策略检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的方法，采用包含尿嘧啶碱基和引发序列的双链DNA(dsDNA)探针识别UDG目标物并伴随引发链的释放，该引发链可激活免标记无酶DNA机器，产生放大的荧光信号，由于dsDNA探针及特定DNA机器设计，检测方法成功实现了背景降低和信号放大，产生了低的检测限(0.00044U/mL)；但是纳米颗粒处理麻烦，耗时长，操作复杂且检测灵敏度不高，而荧光检测法常常存在荧光探针设计较难且成本较高，检测灵敏度提高有限的缺点。

最近发展的单分子检测技术，因其信噪比高，所耗样品量少，检测灵敏度以及分辨率高等优点已成为当今世界前沿科技的研究热点之一。将单分子检测技术应用于生物标志物的超灵敏检测，可实现对疾病的早期诊断和治疗，在临床医学领域具有广阔的应用前景。

如何设计有效的检测策略从而实现高效、快速、灵敏的检测DNA糖基化酶活性，是本领域内亟待解决的技术问题。

发明内容

为解决现有技术中存在的上述问题，发明人提出一种简单、快速、灵敏的基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶活性的方法。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先，本发明提供一种基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶hOGG1活性的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)待测DNA糖基化酶hOGG1介导的双链DNA底物的碱基切除修复：双链DNA底物中加入待测DNA糖基化酶hOGG1、脱嘌呤核酸内切酶-1(APE1)、DNA聚合酶β和标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(Cy5-dGTP)；所述双链DNA底物为长度15-60bp的双链DNA，其作为DNA糖基化酶hOGG1底物，该双链DNA的其中一条链3′端修饰一个生物素分子，它的互补链距离5′端12个碱基处为损伤8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，双链DNA的其他碱基不为8-氧鸟嘌呤；通过DNA糖基化酶hOGG1特异性地识别双链DNA底物中8-氧鸟嘌呤，并切除损伤8-氧鸟嘌呤，在双链DNA上留下一个脱碱基位点(AP site)；脱嘌呤核酸内切酶-1(APE1)对脱碱基位点(AP site)进行剪切，在该位点处留下一个核苷酸的缺口；DNA聚合酶β将标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(Cy5-dGTP)聚合在缺口处，最终生成具有Cy5和生物素双标记的修复反应产物；

(2)修复反应产物与量子点(QDs)混合孵育反应：所述量子点表面覆盖有链霉亲合素；

(3)单分子检测Cy5荧光信号，定量分析DNA糖基化酶hOGG1活性：采用全内角反射荧光技术(TIRF)的单分子成像系统进行检测。

本发明所述检测方法的原理为：所述方法设计一个长度15-60bp的双链DNA作为DNA糖基化酶hOGG1底物，该双链DNA的其中一条链3′端修饰一个生物素分子，它的互补链距离5′端12个碱基处为损伤8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)(双链DNA的其他碱基不为8-氧鸟嘌呤)。在DNA糖基化酶hOGG1存在时，其会特异性地识别8-氧鸟嘌呤，并切除损伤碱基，在双链DNA上留下一个脱碱基位点(AP site)。引入脱嘌呤核酸内切酶-1(APE1)，对脱碱基位点(APsite)进行剪切，从而在该位点处留下一个核苷酸的缺口。在DNA聚合酶β的作用下，标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(Cy5-dGTP)会被聚合在缺口处，从而生成Cy5和生物素双标记的双链核苷酸底物。生物素与链霉亲合素发生特异性反应，双标记的DNA底物结合在覆盖有链霉亲合素的量子点(QDs)的表面，形成QD-DNA-Cy5的复合物，从而导致量子点(QDs)和Cy5之间的荧光共振能量转移(FRET)。通过全内角反射荧光技术(TIRF)，简单统计Cy5数目就可以在单分子水平上对DNA糖基化酶hOGG1活性进行定量检测。当DNA糖基化酶hOGG1不存在时，由DNA糖基化酶hOGG1所引发的碱基切除修复不会启动，因而Cy5和量子点(QDs)之间也不会发生荧光共振能量转移(FRET)，最终也就观察不到Cy5的荧光信号。由于一个量子点可以同时结合多个标记Cy5的核苷酸底物，导致Cy5和量子点(QDs)之间的荧光共振能量转移(FRET)效率很高，而基于全内角反射荧光(TIRF)的单分子检测技术又具有较高的灵敏性和较高的分辨率，因此该方法可以实现高效、快速、灵敏地检测DNA糖基化酶的活性。

其中，本发明所述双链DNA底物的有效长度范围15bp-60bp，小于15bp不利于常温下双链DNA引物的稳定性；而大于60bp，双链DNA引物可能会形成二聚体或空间二级结构，不利于其在量子点(QDs)表面的均匀分布，影响荧光分子与量子点(QDs)之间荧光共振能量转移(FRET)效率；双链DNA的其中一条链3′端修饰一个生物素分子，基于发生荧光共振能量转移的需要，它的互补链距离5′端12个碱基处为损伤8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)。

优选的，本发明所述双链DNA底物的长度为25bp，构成双链DNA底物的两条序列分别为正义链(5'-CTCCTCCCCCATCTCCTCCCAGTCC-biotin-3')和反义链(5'-GGACTGGGAGGAOATGGGGGAGGAG-3')，O为8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)。

本发明所述的检测方法，依靠QD-DNA-Cy5复合物中Cy5与量子点的荧光共振能量转移，对于荧光分子Cy5的选择，虽然现有技术已有多种可与量子点发生荧光共振能量转移的荧光染料分子，如TAMRA/Cy3/Texas Red/罗丹明等，但发明人通过对比试验研究发现，QD/Cy5这一对组合在本发明所述方法中的荧光共振能量转移(FRET)效率相更高。

本发明所述量子点优选605QDs；本发明所述605QDs是指从公司InvitrogenCorporation(California,U.S.A.)购买得到的Qdot 605ITK，它是一种streptavidin-coated CdSe/ZnS QDs，最大发射波长为605nm。

本发明所述检测方法，对于DNA糖基化酶hOGG1的检测下限可达1.8×10^-6U/μL，所述灵敏度是通过该方法各个步骤和过程逐渐累积和配合达到的。

其次，本发明还提供一种基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶hOGG1活性的试剂盒，所述试剂盒包括：双链DNA底物、脱嘌呤核酸内切酶-1(APE1)、DNA聚合酶β、标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(Cy5-dGTP)、表面覆盖有链霉亲合素的量子点；所述双链DNA底物长度15-60bp的双链DNA，其作为DNA糖基化酶hOGG1底物，该双链DNA的其中一条链3′端修饰一个生物素分子，它的互补链距离5′端12个碱基处为损伤8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，双链DNA的其他碱基不为8-氧鸟嘌呤。

优选的，上述试剂盒还包括防淬灭缓冲液，所述防淬灭缓冲液组成为：67毫摩尔每升的甘氨酸-氢氧化钾(pH 9.4)、2.5毫摩尔每升的氯化镁、50微克每毫升的牛血清白蛋白、1毫克每毫升的葡萄糖氧化酶、0.04％毫克每毫升的过氧化氢酶、0.4％(质量/体积)D-葡萄糖。

上述试剂盒还包括：所述DNA糖基化酶hOGG1、脱嘌呤核酸内切酶-1(APE1)、DNA聚合酶β的酶反应所需的缓冲体系。

此外，上述试剂盒在检测DNA糖基化酶hOGG1活性中的用途也是本发明的目的之一。

本发明取得了以下有益效果：

1)本发明设计了一种新的设计思路用于在单分子水平上检测DNA糖基化酶hOGG1活性的方法，本发明技术方案中，当DNA糖基化酶hOGG1存在时，其会特异性识别并切除损伤鸟嘌呤，留下一个脱碱基位点(AP位点)。脱嘌呤核酸内切酶-1(APE1)会对脱碱基位点(AP位点)进一步剪切，留下一个核苷酸的缺口。此时DNA聚合酶β将Cy5-dGTP聚合在该缺口处，生成双标记(Cy5和生物素)的双链核苷酸底物。通过生物素与链霉亲合素之间的特异性反应，DNA底物会结合在覆盖有链霉亲合素的量子点(QDs)的表面，形成QD-DNA-Cy5复合物。空间距离缩小，导致量子点(QDs)和Cy5之间发生荧光共振能量转移(FRET)，从而可以在单分子水平观察到Cy5的荧光信号。

2)灵敏度高：一个量子点可以结合多个标记Cy5荧光分子的核苷酸底物，大大提高了荧光分子Cy5和量子点(QDs)之间的荧光共振能量转移(FRET)效率；基于全内角反射荧光(TIRF)的单分子检测技术，具有较高的灵敏度和较高的分辨率特性，本发明所述方法检测下限可达1.8×10^-6U/μL。现有技术公开了多种UDG的检测方法(如CN104630363A)，然而不同的DNA糖基化酶，酶活性大小不同，反应机理也不同，而且检测酶活性的方法也不相同，本发明是基于单分子技术的检测，无循环放大步骤，直接数荧光分子的数目即可，简单、快速；对于检测精度，除了Wang等(Wang,X.；Hou,T.；Lu,T.；Li,F.Anal.Chem.2014,86,9626-9631.)基于核酸外切酶III的循环放大荧光检测法外(检测灵敏度为1.0×10^-6U/μL)¹，还没有其它的方法可以超过发明所述方法的灵敏度。

3)特异性好：由于本方案是基于DNA糖基化酶hOGG1的自身修复特性，整个修复反应是严格按照自然修复机制进行的，因此反应的特异性极高；此外，发明人对该方案中的各反应条件也都进行了细致优化，因此在修复反应过程中，几乎不发生非特异性反应，而且在与量子点(QDs)的孵育反应中，只有聚合上Cy5-dGTP的核苷酸底物才会与量子点(QDs)之间发生荧光共振能量转移(FRET)，这也大大减少了该方法的非特异性。

4)操作简单：由于本方案中的修复反应是恒温扩增，因而不涉及控温；该反应是在一管中进行反应后直接进行单分子检测，因而不涉及分离、洗涤步骤。

5)省时：方案中的总反应时间共40分钟。

附图说明

图1：单分子检测DNA糖基化酶hOGG1活性的原理图：A图：在氧化条件下，鸟嘌呤(G)受到损伤，变为8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)。B图：(1)在hOGG1存在条件下，特异性识别并剪切8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，留下一个脱碱基位点(AP site)；(2)脱嘌呤核酸内切酶-1(APE1)剪切脱碱基位点(AP site)，留下一个核苷酸缺口；(3)聚合酶β将Cy5-dGTP聚合在DNA链的缺口处，产生标记生物素和Cy5的核苷酸底物；(4)标记生物素和Cy5的核苷酸底物与覆盖有链霉亲合素的量子点自组装生成QD-DNA-Cy5复合物，导致两者之间的荧光共振能量转移(FRET)。

图2：体外DNA糖基化酶介导的碱基切除修复过程的验证。A图：DNA糖基化酶hOGG1介导的修复反应产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析，泳道1为不加hOGG1的反应样品；泳道2为加hOGG1的反应样品；B图：当DNA糖基化酶hOGG1存在和不存在时，量子点和Cy5的荧光强度变化曲线。

图3：单分子检测DNA糖基化酶hOGG1活性。A、D代表605量子点荧光信号，B、E代表Cy5荧光信号，C、F代表605量子点和Cy5的荧光重叠部分。

图4：Cy5数目随着不同浓度的DNA糖基化酶hOGG1的变化情况及其线性分析。误差线代表三次实验的标准偏差。

图5：针对不同的蛋白样品，Cy5数目的变化。误差线代表三次实验的标准偏差。

具体实施方式

实施例1

孵育缓冲液的准备：100毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、10毫摩尔每升的酸铵、3毫摩尔每升的氯化镁、0.83纳硫摩尔每升的量子点(605QDs)，pH 8.0。

防淬灭缓冲液的准备：67毫摩尔每升的甘氨酸-氢氧化钾(pH 9.4)、2.5毫摩尔每升的氯化镁、50微克每毫升的牛血清白蛋白、1毫克每毫升的葡萄糖氧化酶、0.04％毫克每毫升的过氧化氢酶、0.4％(质量/体积)D-葡萄糖。

细胞提取物准备：人肺腺癌细胞(A549)培养基为含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，放在含有5％二氧化碳，37度的培养箱中进行培养。待细胞长到对数生长期时，用胰酶将其消化下来，并用pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两遍，然后4℃，1000转每分钟离心5分钟。将细胞悬浮在100微升的裂解缓冲液中，于4℃冰上裂解30分钟，然后4℃，12000转每分钟离心20分钟。最后，将上清液转移至干净的离心管中，并立即进行DNA糖基化酶hOGG1活性的测定。

DNA糖基化酶hOGG1介导的碱基切除修复反应：将稀释不同倍数的DNA糖基化酶hOGG1样品加入到20微升含有100纳摩尔每升的双链DNA底物、10×NEB缓冲液2、1个单位的DNA聚合酶β、1×聚合反应缓冲液(包括50毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 8.7)、10毫摩尔每升的氯化钾、10毫摩尔每升的氯化镁、0.4毫克每毫升的牛血清白蛋白、1毫摩尔每升的二硫苏糖醇、15％(v/v)甘油)、100微克每毫升的牛血清白蛋白、1微摩尔每升的Cy5-dGTP、0.5个单位的脱嘌呤核酸内切酶-1(APE1)、10×NEB缓冲液4的混合物中，在37℃避光反应30分钟，使DNA糖基化酶介导的修复反应得以进行；构成双链DNA底物的两条序列分别为正义链(5'-CTCCTCCCCCATCTCCTCCCAGTCC-biotin-3')和反义链(5'-GGACTGGGAGGAOATGGGGGAGGAG-3')，O为8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)。

单分子检测：将20微升的反应产物与孵育缓冲液混合达到100微升，在室温下避光反应10分钟，使DNA底物通过生物素-链霉素的特异性反应充分结合在量子点(QDs)的表面。反应过后，取出20微升的孵育产物，先用防淬灭缓冲液稀释100倍，充分混匀，然后用基于全内角反射荧光技术(TIRF)的单分子成像系统进行检测。

实验原理(如图1)：

该方案设计一个双链DNA，总长25bp，作为DNA糖基化酶hOGG1的催化底物。该双链DNA底物的其中一条链3′端修饰一个生物素分子，互补链上距离5′端第13个碱基处为损伤的8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)。在DNA糖基化酶hOGG1存在时，其会特异性地识别损伤8-氧鸟嘌呤，切断戊糖与损伤碱基间的N-糖苷键，释放出损伤碱基，并在双链DNA链上留下一个脱碱基位点(AP site)。加入脱嘌呤核酸内切酶-1(APE1)，对脱碱基位点(AP位点)进行进一步剪切，从而在该位点处留下一个核苷酸的缺口。在聚合酶β作用下，标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)会被聚合在缺口处，从而生成具有荧光分子Cy5和生物素双标记的双链核苷酸底物。通过生物素与链霉亲合素之间的特异性反应，双标记的核苷酸底物将会结合在覆盖有链霉亲合素的量子点(QDs)的表面，形成QD-DNA-Cy5复合物。这种基于单个量子点的自组装复合物拉近了量子点(QDs)和Cy5之间的距离，导致两者之间的荧光共振能量转移(FRET)。通过全内角反射荧光技术(TIRF)，简单统计荧光分子Cy5的数目就可以在单分子水平上对DNA糖基化酶hOGG1活性进行定量检测。而当DNA糖基化酶hOGG1不存在时，由DNA糖基化酶hOGG1所引发的碱基切除修复机制将不会发生，因而荧光共振能量转移(FRET)不会在荧光分子Cy5和量子点(QDs)之间发生，最终也不会观察到Cy5的荧光信号。由于一个量子点可以同时结合多个标记Cy5的核苷酸底物，导致Cy5和量子点(QDs)之间的荧光共振能量转移(FRET)效率很高，而基于全内角反射荧光(TIRF)的单分子检测技术又具有较高的灵敏性和较高的分辨率，因此该方法可以实现DNA糖基化酶hOGG1活性的超灵敏检测分析。

实施例2

2.1原理的实验验证

为了验证DNA糖基化酶hOGG1在细胞外碱基切除修复的可行性，发明人对修复反应产物进行了检测分析，结果如图2所示。首先本发明用非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳进行验证分析。从图2A可看出，没有DNA糖基化酶hOGG1时，只有一条25bp的条带，表明切除修复反应没有发生。有DNA糖基化酶hOGG1时，可看到有两条带，长度分别为25bp和12nt，表明其中一条DNA链被切断，产生了12nt的小片段。以上结果显示DNA糖基化酶hOGG1可以特异性识别并切除8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，在脱嘌呤核酸内切酶-1(APE1)的剪切下，脱碱基位点(APsite)处留下一个核苷酸的缺口。加入Cy5-dGTP，DNA聚合酶β将其聚合在缺口处。反应产物与量子点(QDs)孵育后，进行荧光检测，如图2B所示。从图上可看出，没有DNA糖基化酶hOGG1时，605nm处的量子点荧光信号并没有降低，670nm处的Cy5荧光信号也没有上升，表明两者之间没有荧光共振能量转移(FRET)。而在加入DNA糖基化酶hOGG1时，可看到605nm处的量子点荧光信号明显下降，670nm处的Cy5荧光信号反而大大提高。结果表明QD-DNA-Cy5复合物可以形成，并且Cy5和量子点(QDs)之间的荧光共振能量转移(FRET)效率很高。以上实验数据证明，DNA糖基化酶hOGG1可以在细胞外进行碱基切除修复，并且其活性可以用基于量子点的荧光共振能量转移(FRET)法进行检测。为进一步验证该方案的可行性，本发明用基于全内角反射荧光(TIRF)的单分子检测技术进行了检测，如图3所示。在没有DNA糖基化酶hOGG1时，只观察到A图的605量子点信号，而看不到如E图的Cy5信号(B图)。而当DNA糖基化酶hOGG1加入时，不仅能观察到D图的605量子点信号，也可以看到E图的Cy5信号，而F图的荧光信号为两者重叠部分。以上结果显示，可以通过分析Cy5数目来定量检测DNA糖基化酶hOGG1的活性。

2.2灵敏度实验

为了评估本技术方案在检测DNA糖基化酶hOGG1活性的灵敏度，本发明对不同浓度的DNA糖基化酶hOGG1进行了检测分析，结果如图4所示。为了评估其定量分析能力，本发明对DNA糖基化酶hOGG1的浓度取对数，观察到Cy5数目在hOGG1的一定浓度范围内呈现出良好的线性关系(如图4inset中所示)，经过计算，检测限可达1.8×10^-6摩尔每微升。因此本技术方案具有超高的检测灵敏度。

2.3特异性实验

为了评估本技术方案的特异性，本发明选用了另外三种蛋白牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白G(IgG)和胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)作为实验样品，结果如图5所示。从该图可以看出，DNA糖基化酶hOGG1有很高的Cy5荧光信号，而牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白G(IgG)和胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)的荧光信号却跟阴性对照(不加任何蛋白)一样，几乎没有信号。以上结果表明该方法可以很好的区分hOGG1和其它蛋白，证明本技术方案具有很好的特异性。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

Claims

1.一种非疾病治疗诊断目的的基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶hOGG1活性的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)待测DNA糖基化酶hOGG1介导的双链DNA底物的碱基切除修复：双链DNA底物中加入待测DNA糖基化酶hOGG1、脱嘌呤核酸内切酶-1、DNA聚合酶β和标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸；所述双链DNA底物为长度25bp的双链DNA，其作为DNA糖基化酶hOGG1底物，该双链DNA的其中一条链3′端修饰一个生物素分子，互补链距离5′端12个碱基处为损伤8-氧鸟嘌呤，双链DNA的其他碱基不为8-氧鸟嘌呤；通过DNA糖基化酶hOGG1特异性地识别双链DNA底物中8-氧鸟嘌呤，并切除8-氧鸟嘌呤，在双链DNA上留下一个脱碱基位点；脱嘌呤核酸内切酶-1对脱碱基位点进行剪切，在该位点处留下一个核苷酸的缺口；DNA聚合酶β将标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸聚合在缺口处，最终生成具有Cy5和生物素双标记的修复反应产物；构成双链DNA底物的两条序列分别为正义链：5'-CTC CTC CCC CATCTC CTC CCA GTC C-biotin-3'和反义链：5'-GGA CTG GGA GGA OAT GGG GGA GGA G-3'，O为8-氧鸟嘌呤；

(2)修复反应产物与量子点混合孵育反应：所述量子点表面覆盖有链霉亲合素；

(3)单分子检测Cy5荧光信号，定量分析DNA糖基化酶hOGG1活性：采用全内角反射荧光技术的单分子成像系统进行检测。

2.一种非疾病治疗诊断目的的基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶hOGG1活性的试剂盒，所述试剂盒包括：双链DNA底物、脱嘌呤核酸内切酶-1、DNA聚合酶β、标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、表面覆盖有链霉亲合素的量子点；所述双链DNA底物长度25bp的双链DNA，其作为DNA糖基化酶hOGG1底物，该双链DNA的其中一条链3′端修饰一个生物素分子，互补链距离5′端12个碱基处为损伤8-氧鸟嘌呤，双链DNA的其他碱基不为8-氧鸟嘌呤；所述双链DNA底物的两条序列分别为正义链：5'-CTC CTC CCC CAT CTC CTC CCA GTCC-biotin-3'和反义链：5'-GGA CTG GGA GGA OAT GGG GGA GGA G-3'，O为8-氧鸟嘌呤。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括防淬灭缓冲液，所述防淬灭缓冲液组成为：pH 9.4的67毫摩尔每升的甘氨酸-氢氧化钾、2.5毫摩尔每升的氯化镁、50微克每毫升的牛血清白蛋白、1毫克每毫升的葡萄糖氧化酶、0.04％过氧化氢酶、0.4％D-葡萄糖。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：所述DNA糖基化酶hOGG1、脱嘌呤核酸内切酶-1、DNA聚合酶β的酶反应所需的缓冲体系。

5.权利要求2-4任一项试剂盒在检测DNA糖基化酶hOGG1活性中的非疾病诊断目的治疗目的的用途。