CN110057793B - 基于单量子点的纳米传感器检测人烷基糖基化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了基于单量子点的纳米传感器检测人烷基糖基化酶的方法,hAAG引发发夹探针裂解产生触发探针,触发探针与AP探针杂交,在APE1酶的作用产生裂解释放出触发探针,并获得引物,释放的触发探针继续与AP探针杂交APE1的辅助下形成循环裂解,从而获得大量引物,获得引物与捕获探针杂交后,通过聚合将改性脱氧核糖核苷三磷酸聚合至双链DNA中,双链DNA通过生物素与单量子点的链霉亲和素的结合,使双链DNA自组装至单量子点的表面,然后经过激发后使Cy5产生荧光共振能量转移,并通过荧光显微镜测量。本公开提供的方法能够实现对hAAG的超灵敏检测。
Description
技术领域
本公开涉及分析检测技术领域,涉及一种基于单量子点的多层受体纳米传感器检测人 烷基糖基化酶的方法。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息,而不必然构成现有技术。
内源性DNA损伤是各种内部和环境因素作用的结果,会引起DNA突变和复制错误,进一步引发癌症。碱基切除修复(BER)是参与维持基因组稳定的重要DNA修复途径。DNA 糖基化酶是BER途径的起始酶,它可以催化损伤/错配碱基的切割,并产生作用于下游BER 修复过程的脱嘌呤/脱嘧啶位点(AP位点)。DNA糖基化酶的异常表达与人类疾病密切相关, 对DNA糖基化酶的准确检测对于了解DNA损伤修复过程和临床诊断有重要意义。
据本公开发明人所知,传统的DNA糖基化酶检测方法中,凝胶电泳结合放射性标记的 方法灵敏度偏低,需要样品量大,对操作技巧要求高,不适合定量分析而且同位素标记探 针会引起放射性污染;高效液相色谱需要繁琐的DNA片段和昂贵的仪器。磁性纳米颗粒分 离技术分析时间长,工艺复杂。金纳米颗粒比色法可以直观检测DNA糖基化酶,但制备和修饰金纳米颗粒需要复杂的过程。发光分析需要额外的化学试剂,增加了实验的复杂性。荧光方法,它有安全、简单、灵敏度高的优点。然而,荧光方法依赖于用荧光团和猝灭剂 进行外部标记,用于均相测定,涉及到复杂的设计且费用高。人烷基DNA糖基化酶(hAAG) 不像其他的DNA糖基化酶只针对于特定类型的受损碱基,它可以切除被烷基化和脱胺作用 破坏的多种底物碱基。而且,目前没有方法对hAAG进行超灵敏检测。
发明内容
为了解决现有技术的不足,本公开的目的是提供基于单量子点的纳米传感器检测人烷 基糖基化酶的方法,能够实现对hAAG的超灵敏检测。
为了实现上述目的,本公开的技术方案为:
一方面,一种基于单量子点的纳米传感器,包括发夹探针、AP探针、捕获探针、改性单量子点、APE1酶、改性脱氧核糖核苷三磷酸;
所述发夹探针为茎-环结构的单链DNA,茎结构的一条互补链修饰次黄嘌呤,茎结构中 次黄嘌呤至末端序列为能够与AP探针配对杂交的触发探针;
所述AP探针为含有AP位点的单链DNA,所述AP位点位于能够与触发探针互补的AP探 针的序列中,AP位点至AP探针末端的序列为能够与捕获探针配对杂交的引物;
所述捕获探针为一个末端修饰有生物素的单链DNA,捕获探针长度高于引物的长度, 所述捕获探针分为两部分序列,一部分序列为能够与引物配对杂交的序列,另一部分序列 中含有若干能够与改性脱氧核糖核苷三磷酸配对的位点,生物素修饰在另一部分序列的末 端;
所述改性脱氧核糖核苷三磷酸为修饰有Cy5的一种脱氧核糖核苷三磷酸(例如dATP, dGTP,dTTP或dCTP);
所述改性单量子点为表面修饰链霉亲和素的单量子点。
本公开开发了一种基于单量子点(QD)的多层多受体纳米传感器,对hAAG进行超灵敏检测。首先,设计了一个发夹探针,在该探针的茎部修饰了次黄嘌呤(I),作为hAAG的 底物。在hAAG的存在下引发发夹探针的裂解,产生一个触发探针,该触发探针可以与带有 AP位点修饰的AP探针杂交,在APE1的辅助下启动循环裂解,产生大量引物。引物可启动 捕获探针进行信号扩增,生成生物素-/多个Cy5标记双链DNA(dsDNA),并通过生物素与 链霉亲和素在QD上组装形成QD-dsDNA-Cy5纳米结构,产生从QD到Cy5的有效荧光共振能 量转移。这种纳米传感器可以灵敏地检测hAAG,检出限低至4.42×10-12U每微升。此外,它 甚至可以检测单个癌细胞中的hAAG,并将癌细胞与正常细胞区分开来。
另一方面,一种人烷基糖基化酶的检测试剂盒,包括上述纳米传感器、缓冲溶液、DNA 聚合酶。
第三方面,基于单量子点的纳米传感器检测人烷基糖基化酶的方法,提供上述纳米传 感器或检测试剂盒,hAAG引发发夹探针裂解产生触发探针,触发探针与AP探针杂交,在 APE1酶的作用产生裂解释放出触发探针,并获得引物,释放的触发探针继续与AP探针杂交 APE1的辅助下形成循环裂解,从而获得大量引物,获得引物与捕获探针杂交后,通过聚合 将改性脱氧核糖核苷三磷酸聚合至双链DNA中,双链DNA通过生物素与单量子点的链霉亲 和素的结合,使双链DNA自组装至单量子点的表面,然后经过激发后使Cy5产生荧光共振能 量转移,并进行荧光检测。
本公开的有益效果为:
1、hAAG对发夹探针基体进行特异性识别和切割,单分子检测有消耗样品量极少,信噪 比高,灵敏度高,背景信号接近零的显著优点。
2、与典型的基于QD的单供体-单层受体对FRET方法相比,本公开将生物素-/多个Cy5标 记的双链DNA组装到单个QD上,在QD-dsDNA-Cy5纳米结构中形成多层Cy5分子,显著提高 了荧光共振能量转移效率。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解,本公开的示意性 实施例及其说明用于解释本公开,并不构成对本公开的不当限定。
图1为本公开实施例的原理图;
图2为本公开实施例中在APE1存在下,hAAG引发的发夹探针底物中次黄嘌呤切除修复 反应的分子反应机理图;
图3为本公开实施例中605QD和Cy5的吸收和发射光谱图;
图4为本公开实施例中可行性实验的表征图,A为以SYBR Gold为指示剂的hAAG介导 Cy5发夹探针裂解的凝胶电泳分析图,1号泳道为不存在hAAG、存在Cy5标记的发卡探针和 APE1,2号泳道为hAAG、Cy5标记的发卡探针和APE1同时存在,B为以SYBR Gold为指示 剂的APE1介导链置换扩增的凝胶电泳分析图,1号泳道为只存在双链DNA、不存在APE1, 2号泳道为存在双链DNA和APE1,泳道3为以合成引物作为参照,C为-dF/dT在DNA聚合酶 辅助扩增前和后随温度的变化曲线,D为605QD和Cy5在无hAAG和有hAAG情况下的荧光发 射光谱,插图显示从655到725纳米放大后的荧光光谱,hAAG浓度是0.1U每微升;
图5为本公开实施例中单量子点纳米传感器测量hAAG活性的表征图,A为没有hAAG条 件下的605QD通道单分子成像照片,B为没有hAAG条件下的Cy5通道单分子成像照片,C为有hAAG条件下的605QD通道与Cy5通道叠加的单分子成像照片,D为有hAAG条件下的 605QD通道单分子成像照片,E为有hAAG条件下的Cy5通道单分子成像照片,F为有hAAG 条件下的605QD通道与Cy5通道叠加的单分子成像照片;
图6为本公开实施例中实验条件的优化表征图,A为不同浓度发夹探针对Cy5计数影响 的柱状图,hAAG的浓度为0.1U每微升,AP探针的浓度是960纳摩尔每升,B为在APE1介导 的循环切割SDA中,不同数量的APE1对Cy5计数影响的柱状图,hAAG的浓度为0.1U每微升,C为不同浓度Cy5-dATP对Cy5计数影响的柱状图,hAAG的浓度为0.1U每微升,D为不 同含量Klenow片段聚合酶的Cy5计数差异的柱状图,hAAG的浓度为0.1U每微升,E为不同 扩增时间对Cy5计数影响的柱状图,hAAG的浓度为0.1U每微升,F为Cy5计数(圆圈)和FRET 效率(三角)随捕获探针和QD比值的变化曲线,误差棒代表三次实验的标准偏差;
图7为本公开实施例中Cy5计数对不同浓度的hAAG的曲线,插图为Cy5个数对hAAG的 浓度的对数线性图;
图8为本公开实施例中特异性检测的表征柱状图;
图9为本公开实施例中初始速度(V)随发夹探针底物浓度的变化曲线,hAAG浓度为0.1U 每微升,误差棒代表三次实验的标准偏差;
图10为本公开实施例中不同浓度CdCl2对hAAG相对活性的检测曲线,hAAG浓度为0.1 U每微升,误差棒代表三次实验的标准偏差;
图11为本公开实施例中细胞的hAAG活性检测表征图,A为检测不同细胞提取物产生的 Cy5的数目柱状图,B为不同数量A549细胞产生的Cy5数目的曲线,插图为Cy5个数与A549 细胞数量的对数线性关系图,误差棒代表三次实验的标准偏差。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有 指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理 解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本 公开的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也 意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包 括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本公开中记载的APE1酶为人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶。
鉴于传统的DNA糖基化酶的方法有步骤费时、灵敏度低、辐射危害大、需要繁琐的DNA 片段和昂贵的仪器的缺点,难以对hAAG进行检测,为了解决如上的技术问题,本公开提出 了基于单量子点的纳米传感器检测人烷基糖基化酶的方法。
本公开的一种典型实施方式,提供了一种基于单量子点的纳米传感器,包括发夹探针、 AP探针、捕获探针、改性单量子点、APE1酶、改性脱氧核糖核苷三磷酸;
所述发夹探针为茎-环结构的单链DNA,茎结构的一条互补链修饰次黄嘌呤,茎结构中 次黄嘌呤至末端序列为能够与AP探针配对杂交的触发探针;
所述AP探针为含有AP位点的单链DNA,所述AP位点位于能够与触发探针互补的AP探 针的序列中,AP位点至AP探针末端的序列为能够与捕获探针配对杂交的引物;
所述捕获探针为一个末端修饰有生物素的单链DNA,捕获探针长度高于引物的长度, 所述捕获探针分为两部分序列,一部分序列为能够与引物配对杂交的序列,另一部分序列 中含有若干能够与改性脱氧核糖核苷三磷酸的位点,生物素修饰在另一部分序列的末端;
所述改性脱氧核糖核苷三磷酸为修饰有Cy5的一种脱氧核糖核苷三磷酸(例如dATP, dGTP,dTTP或dCTP);
所述改性单量子点为表面修饰链霉亲和素的单量子点。
本公开开发了一种基于单量子点(QD)的多层多受体纳米传感器,对hAAG进行超灵敏检测。首先,设计了一个发夹探针,在该探针的茎部修饰了次黄嘌呤(I),作为hAAG的 底物。在hAAG的存在下引发发夹探针的裂解,产生一个触发探针,该触发探针可以与带有 AP位点修饰的AP探针杂交,在APE1的辅助下启动循环裂解,产生大量引物。引物可启动 捕获探针进行信号扩增,生成生物素-/多个Cy5标记双链DNA(dsDNA),并通过生物素与 链霉亲和素在QD上组装形成QD-dsDNA-Cy5纳米结构,产生从QD到Cy5的有效荧光共振能 量转移。这种纳米传感器可以灵敏地检测hAAG,检出限低至4.42×10-12U每微升。此外,它 甚至可以检测单个癌细胞中的hAAG,并将癌细胞与正常细胞区分开来。
该实施方式的一种或多种实施例中,所述发夹探针为3'端突出的茎-环结构的单链DNA, 次黄嘌呤位于茎结构的3'端的互补链上,所述触发探针为次黄嘌呤至3'端的序列。
该实施方式的一种或多种实施例中,所述AP探针的长度大于触发探针的长度。
该实施方式的一种或多种实施例中,所述引物为AP位点至AP探针5'端的序列。
该实施方式的一种或多种实施例中,所述捕获探针的5'端修饰有生物素。
该实施方式的一种或多种实施例中,发夹探针5'至3'的序列为CAC GAT GAA TCCTAG ACT ATT TTT ATA GTC TAG GAT TCI TCG TGA CAA TAC AAC;
AP探针5'至3'的序列为CGC TGG AGC TGA GTT GTT GTA TXG TCA CGA;
捕获探针5'至3'的序列为AAA TGA CAT CGA CTG ACG TAC CTC A TAC AAC AACTCA GCT CCA GCG。
本公开的另一种实施方式,提供了一种人烷基糖基化酶的检测试剂盒,包括上述纳米 传感器、缓冲溶液、DNA聚合酶。
该实施方式的一种或多种实施例中,DNA聚合酶为Klenow片段聚合酶。
本公开的第三种实施方式,提供了基于单量子点的纳米传感器检测人烷基糖基化酶的 方法,提供上述纳米传感器或检测试剂盒,hAAG引发发夹探针裂解产生触发探针,触发探 针与AP探针杂交,在APE1酶的作用产生裂解释放出触发探针,并获得引物,释放的触发探 针继续与AP探针杂交APE1的辅助下形成循环裂解,从而获得大量引物,获得引物与捕获探 针杂交后,通过聚合将改性脱氧核糖核苷三磷酸聚合至双链DNA中,双链DNA通过生物素 与单量子点的链霉亲和素的结合,使双链DNA自组装至单量子点的表面,然后经过激发后 使Cy5产生荧光共振能量转移,并进行荧光检测。
该实施方式的一种或多种实施例中,其步骤为:
(1)将待测样品、发夹探针、APE1酶加入至1×NEBuffer 4中,在人体温度下进行反应;
(2)向步骤(1)反应后的溶液中添加AP探针和APE1酶,在人体温度下进行反应;
(3)将步骤(2)反应后的产物、捕获探针、改性脱氧核糖核苷三磷酸、与改性脱氧核糖核苷三磷酸不同另外三种脱氧核糖核苷三磷酸、Klenow片段聚合酶添加至1×NEBuffer 2中,在人体温度下进行反应;
(4)将步骤(3)反应后的产物、改性单量子点加入至含有氯化镁、Tris-HCl和硫酸铵 的溶液中进行孵育获得QD-dsDNA-Cy5纳米结构;
(5)将获得的QD-dsDNA-Cy5纳米结构进行荧光检测。
本公开中所述人体温度为人体正常的温度,为36.2~37.2℃。
本公开中所述的1×NEBuffer 4含有50毫摩尔每升醋酸钾(KAC)、20毫摩尔每升Tris-HAC(pH 7)、10毫摩尔每升醋酸镁(Mg(AC)2)和1毫摩尔每升DTT。
本公开中所述的1×NEBuffer 2含有50毫摩尔每升氯化钠、10毫摩尔每升Tris-HCl、10 毫摩尔每升氯化镁、1毫摩尔每升DTT;pH 7.9。
该实施方式的一种或多种实施例中,荧光检测条件为:激发波长为405nm,激发和发射 狭缝均为5nm。
为了保证发夹探针形成发夹结构,该实施方式的一种或多种实施例中,将发夹探针放 入孵育缓冲溶液中,升温至90~100℃进行孵育,然后冷却至室温形成发夹结构;所述孵育 缓冲溶液中含有氯化镁和Tris-HCl。孵育缓冲溶液中氯化镁的浓度为150微摩尔每升。孵育 缓冲溶液中Tris-HCl的浓度为1微摩尔每升。采用Tris-HCl的pH为8.0。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案,以下将结合具体的 实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例
发夹探针的制备:将10微摩尔每升的发夹探针(hairpinprobe substrate)加入到含有150 微摩尔每升氯化镁(MgCl2)和1毫摩尔每升Tris-HCl(pH 8.0)的缓冲溶液中,在95℃下孵 育5分钟,然后缓慢冷却至室温形成发夹结构。退火后的发夹探针储存在4℃备用。
酶反应与QD-dsDNA-Cy5纳米结构的形成:酶反应包括三个连续的步骤。首先,0.48微摩尔每升退火的发夹探针、不同浓度的hAAG、1U的APE1在10微升含有50毫摩尔每 升醋酸钾(KAC)、20毫摩尔每升Tris-HAC(pH 7)、10毫摩尔每升醋酸镁(Mg(AC)2)和 1毫摩尔每升DTT的1×NEBuffer 4中在37℃反应1小时。第二,1.44微升10微摩尔每升 的AP探针(APprobe)和2U APE1被添加到反应溶液中,形成15微升的混合溶液,在37℃ 反应40分钟,然后在95℃孵育20分钟灭活。第三,扩增反应在25微升的体系中进行。0.576 微摩尔每升的捕获探针(capture probe)、8微摩尔每升Cy5-dATP、200微摩尔每升三磷酸 鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、200微摩尔每升三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)、200微摩 尔每升三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)、2U的Klenow片段聚合酶,在1×NEBuffer 2 (50毫摩尔每升氯化钠、10毫摩尔每升Tris-HCl、10毫摩尔每升氯化镁、1毫摩尔每升DTT, pH 7.9)溶液中,37℃避光反应90分钟。随后在75℃持续20分钟结束反应。酶反应产物 和终浓度为5纳摩尔每升605QD,3毫摩尔每升氯化镁(MgCl2)、100毫摩尔每升Tris-HCl 和10毫摩尔每升硫酸铵((NH4)2SO4)在总体积为80微升的溶液中,室温下孵育15分钟 形成QD-dsDNA-Cy5纳米结构。
荧光检测:将含有QD-dsDNA-Cy5纳米结构的溶液60微升,用日立F-7000荧光分光光度计(日本,东京)测量荧光光谱,并记录光谱。激发波长为405纳米,光谱记录范围 为550-750纳米。激发和发射狭缝均设置为5.0纳米。采用605纳米(QDs最大发射波长)和 670纳米(Cy5最大发射波长)的荧光强度进行数据分析。
单分子检测:在单分子测量中,将反应产物用含有3毫摩尔每升氯化镁(MgCl2)、100 毫摩尔每升Tris-HCl和10毫摩尔每升硫酸铵((NH4)2SO4)的溶液中稀释200倍。将10微升 稀释后的溶液滴在盖玻片上,用全内反射荧光显微镜(TIRF)成像。用405纳米的激光激发QD,QD和Cy5的光子被油浸的100×物镜(日本,尼康)所收集,并用一个数字化的 CMSOEMCCD相机(滨松光子学,日本)所拍摄,曝光时间为500毫秒。选取一个600×600 像素的区域利用image J软件统计Cy5的数目,用10张图的总个数进行数据分析。
该实施例采用的各种核苷酸序列如表1所示
表1:寡核苷酸的序列
下划线粗体字母“I”表示脱氧次黄嘌呤,下划线粗体字母“X”表示AP位点。在捕获探针中,带下划线的序列可与引物杂交。
抑制剂分析:hAAG抑制实验是在糖基化酶反应混合物中加入不同浓度的CdCl2,随后 的反应过程和单分子测量都遵循上述步骤。根据公式:
计算hAAG的相对活性。其中N0为不存在hAAG时Cy5的数目,Nt为hAAG存在时 Cy5的数目,Ni为hAAG和CdCl2同时存在时Cy5的数目。IC50值由RA与CdCl2浓度的曲 线计算得到。
细胞培养和细胞提取物的制备:将人肺腺癌细胞系(A549)、人宫颈癌细胞系(HeLa)、 人正常肝细胞系(HL-7702)、人正常肺细胞系(MRC-5)和人类胚胎肾细胞系(HEK-293) 放入含有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM),在37℃,含5%CO2的潮湿气氛中培养。使用核提取试剂盒(ActiveMotif) 根据说明书进行细胞提取物的提取。
该方法的检测原理如图1所示,反应系统由发夹探针、AP探针和捕获探针组成。该实施 例设计了一种以颈环为基体的发夹探针。茎含有两条互补链,在较长的茎上修饰了一个次黄 嘌呤碱基(I),与互补链中的胸腺嘧啶(T)错配。该实施例设计了一个AP探针,在5'端第23个碱 基处有一个AP位点。在APE1存在的情况下,AP探针与发夹探针裂解产生的触发探针(trigger, TCG TGA CAA TAC AAC)配对,启动链置换扩增反应(SDA)。另外,该实施例设计了一个 捕获探针,可以与引物(primer,CGC TGG AGC TGA GTT GTT GTA T)杂交,启动DNA聚 合酶引发的扩增。为了防止非特异性扩增,该实施例用氨基修饰了所有探针的3'端。
该实施例方法包括四个步骤:(1)hAAG作用下的次黄嘌呤切除修复反应,(2)APE1介导的 链置换扩增反应(SDA),(3)DNA聚合酶辅助扩增和多个Cy5分子的嵌入,(4)生物素-/多个Cy5 标记的dsDNA在QD表面组装,导致QD到Cy5的高效率荧光共振能量转移。在hAAG、APE1 酶和发夹探针的存在下,hAAG识别I/T碱基对,并将五碳糖和次黄嘌呤碱基之间的N-糖苷键 裂解,释放次黄嘌呤碱基形成AP位点。然后APE1切割AP位点,导致发夹探针断裂成两部分, 如图2所示。生成的触发探针可以与AP探针杂交,形成AP探针/触发探针dsDNA。随后,APE1 酶诱导dsDNA的循环切割,释放3’-OH的触发探针和大量引物。释放的引物可以在Klenow片 段聚合酶、Cy5-dATP、dCTP、dGTP、dTTP存在的情况下,以生物素化的捕获探针为模板, 引发扩增反应,嵌入多个Cy5分子,生成稳定的dsDNA。这些生物素-/多个Cy5标记的dsDNA 可以通过特异性的生物素-链霉亲和素结合自组装到QD表面,形成QD-dsDNA-Cy5纳米结构。 如图3所示,在405纳米的激发下,以605QD为供体,Cy5为受体可发生有效荧光共振能量转移, Cy5信号可通过全内反射荧光显微镜测量,以定量hAAG活性。而在没有hAAG的情况下,次 黄嘌呤碱基不能被裂解,也不会产生触发探针。因此,既没有发生APE1介导的SDA,也没有 发生DNA聚合酶辅助的扩增反应,所以观察不到Cy5信号。
单量子点纳米传感器荧光共振能量转移效率的计算:在单量子点纳米传感器中,荧光共 振能量转移导致QD发射强度减弱和Cy5发射的增强。根据下面公式可以量化荧光共振能量转 移效率(E),
其中FDA为Cy5受体存在时的605QD荧光强度,FD为Cy5受体不存在时的605QD荧光强度。 在最佳的实验条件下根据上式该实施例计算出的FRET效率为84.94%。该值与用单量子点-多 层受体纳米传感器方法测量的FRET效率(85.29%)相近。而这种高的FRET效率在理论上是合理 的。在单量子-多层受体点纳米传感器中,基于以下公式可以计算荧光共振能量转移效率(E),
其中R0为福氏半径,n为与一个供体相互作用的受体分子的平均数量,r为受体到供体中 心的距离。对于605QD/Cy5对,福氏半径(R0)为7.7纳米。该实施例计算了基于荧光共振能 量转移的纳米传感器中605QD供体与Cy5受体的距离。理论上,通过DNA聚合酶辅助扩增, 可以在每个引物的末端加入5个Cy5-dATP。dsDNA中一个核苷酸平均长度为0.34纳米,推测 延伸引物中Cy5分子与链霉亲和素包被的QD表面的距离分别为1.36纳米、3.06纳米、4.76纳米、 6.46纳米、7.82纳米。QD的半径为7.5~10埃相应的QD-Cy5分离距离计算为11.36纳米(~ 1.5×R0)、13.06纳米(~1.7×R0)、14.76纳米(~1.9×R0)、16.46纳米和17.82纳米。在2×R0的范围 内得到有效的FRET,结构可以看作是QD-Cy5-Cy5-Cy5构型。当R0为7.7纳米,n为36时,供体 与受体的FRET效率通过(2)式计算得:Cy5在位置1(E1)为77.73%,Cy5在位置2E2为60.19%, Cy5在位置3E3为42.05%。在QD-Cy5-Cy5-Cy5构型中,理论上的总FRET效率(Eth)可由单对 FRET效率(即,E1,E2,E3)基于方程3得到
其中该QD-dsDNA-Cy5纳米传感器具有多层Cy5受体,总效率(Eth) 计算为85.14%,与荧光光谱测量值(84.94%)和单量子点纳米传感器测量值(85.29%)一致。该实 施例进一步研究了QD-Cy5-Cy5-Cy5构型中能量的分布。总FRET效率可由三个QD-Cy5子系统 (即,QD-位置1的Cy5、QD-位置2的Cy5、QD-位置3的Cy5),由公式4~6可知
E′1=E1(1-E′2-E′3) (4)
E′2=E2(1-E′1-E′3) (5)
E′3=E3(1-E′1-E′2) (6)
QD/Cy5对在位置1上的FRET效率为E'1,在位置2上的FRET效率为E'2,在位置3上的FRET效率为E'3。计算结果如下:E'1=51.88%,E'2=22.47%,E'3=10.79%。理论上总荧光共 振谱效率估计为85.14%,与荧光光谱测量(84.94%)和单量子点纳米传感器(85.29%)的实验值 一致,进一步证实了具有多层Cy5分子的QD-dsDNA-Cy5纳米传感器的形成。
可行性实验:分别进行了凝胶电泳、DNA熔解温度实验和荧光测定,检测结果如图4所示。使用Cy5标记的发夹探针进行hAAG引发的次黄嘌呤切除修复反应,如图4A所示。在 没有hAAG的情况下,只有54个碱基的Cy5标记的发夹探针(Cy5-labeled hairpin probe)条带(图4A,泳道1),表示未发生裂解反应。在hAAG存在下,Cy5标记的发夹探针发生裂解,生 成15个碱基的Cy5标记的DNA条带(图4A,泳道2下)和38个碱基的茎环结构的DNA条带(图 4A,泳道2上),说明hAAG能够识别次黄嘌呤/胸腺嘧啶(I/T)碱基对,并在APE1的辅助下 特异性切除次黄嘌呤。
通过凝胶电泳验证了APE1对dsDNA中AP位点的切割,如图4B所示。触发探针与AP探针杂交,形成触发探针/AP探针dsDNA(图4B,泳道1)。APE1可以切割dsDNA的AP位点,产 生与合成的引物(图4B,泳道3)长度相同的22个碱基的引物(图4B,泳道2),能够说明存在 APE1引发的SDA反应。
为了验证引物与捕获探针杂交是否可以启动Klenow片段聚合酶辅助扩增,测量了产物 的熔解曲线,如图4C所示。扩增后产品的熔链温度是78℃,远高于扩增前(71℃),表明存 在Klenow片段聚合酶辅助扩增反应。用荧光光谱法验证了该方法的可行性,如图4D所示。 在没有hAAG的对照组未检测到Cy5信号,说明在没有hAAG的情况下,未发生由QD至Cy5的荧光共振能量转移。在hAAG存在下,有明显的Cy5信号,QD信号减弱,表明 QD-dsDNA-Cy5纳米结构的形成导致了QD-dsDNA-Cy5的有效的荧光共振能量转移。
单分子成像法检测hAAG活性:采用单量子点纳米传感器测量hAAG活性, 如图5所示。在没有hAAG的对照组中,图5A中仅在供体通道观察到605QD的信 号,图5B中未在受体通道中观察到Cy5荧光信号。当hAAG存在时,图5D中能观 察到605QD的荧光信号,图5E中可以观察到Cy5荧光信号,图5F表示605QD和Cy5 共区域化。605QD在hAAG存在下的荧光强度(图5D)远低于605QD在hAAG不存 在时的荧光强度(图5A),但QD的数量几乎没有变化,这是由于605QD与Cy5之间 发生了有效的荧光共振能量转移。因此,对Cy5个数的简单量化可用于准确测量 hAAG活性。
优化实验条件:对该实施例提供的方法进行不同条件的优化,优化结果如图6所示。图 6A显示,当发夹探针浓度从96纳摩尔每升上升至320纳摩尔每升时,Cy5荧光分子数显著增 加,而当发夹探针浓度从320纳摩尔每升继续上升时,Cy5荧光分子数增加不明显,考虑到 该方法的成本,因而320纳摩尔每升浓度的发夹探针作为该方法的优化实验条件。图6B表明, 第二步中,当APE1量从0.5U提升至2U时,Cy5荧光分子数显著增加,当APE1量从2U提升至 3U时,Cy5荧光分子数增加不明显,考虑到该方法的成本,因而第二步中2U APE1作为该方 法的优化实验条件。图6C表明,Cy5-dATP的浓度从2微摩尔每升提高至8微摩尔每升的过程 中,Cy5荧光分子数显著增加,Cy5-dATP的浓度从8微摩尔每升继续提升至12微摩尔每升时 Cy5荧光分子数增加不明显,考虑到该方法的成本,因而8微摩尔每升浓度的Cy5-dATP作为 该方法的优化实验条件。如图6D所示,当Klenow片段聚合酶从0.5U提升至2U时,Cy5荧光 分子数显著增加,当Klenow片段聚合酶从2U提升至3U时,Cy5荧光分子数没有增加,因而 2U Klenow片段聚合酶作为该方法的优化实验条件。图6E表明,当扩增时间为90min以下时, 随着扩增时间的增长,Cy5荧光分子数显著增加,当扩增时间为90min以上时,随着扩增时 间的增长,Cy5荧光分子数增加不明显,因而将90min的扩增时间作为该方法的优化实验条 件。图6F显示,当捕获探针与QD的比例从6:1到36:1时,Cy5荧光分子数增多,且FRET效率 也增大;当捕获探针与QD的比例大于36时,Cy5荧光分子数基本不变,且FRET效率也基本 不变,因而将捕获探针与QD的比例为36:1作为该方法的优化实验条件。
hAAG灵敏度检测:在优化的实验条件(发夹探针浓度为320纳摩尔每升,第二步中APE1 的量为2U,Cy5-dATP的浓度为8微摩尔每升,Klenow片段聚合酶的量为2U,扩增时间为90min,捕获探针与QD的比例为36:1)下测量了Cy5计数对不同浓度的hAAG的响应。如图 7所示,当hAAG的浓度从1.0×10–11U每微升到0.1U每微升,Cy5的数目也相应增加。此外在 hAAG浓度从1.0×10–11U每微升到1.0×10–3U每微升范围内,Cy5的个数与浓度呈对数性相关, 如图7插图所示。回归方程N=164.8log10C+1955.5(R2=0.9946),其中C表示hAAG的浓度(U 每微升),N代表Cy5个数。在对照信号加上三倍标准偏差的基础上,计算检出限为4.42×10-12U每微升。与磁性纳米颗粒分离方法(1×10-4U每微升)和基于超支信号放大的荧光分析(9×10-5U每微升)相比,该方法的灵敏度提高了7个数量级。灵敏度的提高可归因于(1)hAAG引发的次黄嘌呤切除修复,(2)经APE1介导扩增产生大量引物,(3)形成了具有多层Cy5分子的QD-dsDNA-Cy5纳米传感器,(4)单分子检测背景接近零、信噪比高。
特异性检测:使用了T4多核苷酸激酶(PNK)、人8-氧代鸟嘌呤-DNA糖基酶1(hOGG1)、 尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和胸腺嘧啶DNA糖基酶(TDG)作为干扰酶。如图8所示,在hAAG 存在下,Cy5的信号非常高;在反应缓冲液、UDG、hOGG1、TDG和PNK存在下没有明显的Cy5信号。这可以解释为,只有在hAAG的存在下,才能产生生物素-/多个Cy5标记的dsDNA,这些dsDNA可以组装在605QD的表面,得到具有多层Cy5分子的QD-dsDNA-Cy5纳米结构。 这些结果清楚地证明了本方法对hAAG具有良好的选择性。
动力学分析:0.1U每微升hAAG、1U APE1和不同浓度的发夹探针在37℃反应5分钟。将实验数据与米氏方程拟合得到hAAG的酶动力学参数:
其中Vmax为最大初速度,[S]为底物(发夹探针)浓度,Km为米氏常数。如图9所示,随着发夹探针浓度的增加,hAAG的初始速度增大。对于hAAG,Vmax的计算值为10.99每秒, Km的计算值为32.97纳摩尔每升。Km值与放射性测定值(13~42纳摩尔每升)一致。实验结果 表明,该方法能较准确地确定hAAG的动力学参数。
抑制剂试验:用镉(CdCl2)作为hAAG的模型抑制剂,验证该方法对于抑制剂分析的可行 性,结果如图10所示。CdCl2可以抑制hAAG对DNA寡核苷酸中1,N6-亚乙烯基腺嘌呤(εA)和 次黄嘌呤(I)的作用。测量了不同浓度CdCl2下hAAG的相对活性,发现随着CdCl2浓度的增加, hAAG的相对活性降低。IC50值是酶活性降低50%所需的抑制剂浓度。IC50值确定为83.66微 摩尔每升,比单用放射性测定法测定的hAAG值小(120微摩尔)。CdCl2在10~100微摩尔每升 时同时抑制APE1的活性,而抑制APE1有助于整个反应的抑制作用。
细胞的hAAG活性检测:测量了癌细胞和正常细胞中hAAG的活性。肿瘤细胞包括人肺 腺癌细胞系(A549细胞)和人宫颈癌细胞系(HeLa细胞),正常细胞包括人肝细胞细胞系(HL-7702细胞)、正常人肺细胞系(MRC-5细胞)和人胚胎肾细胞系(HEK-293细胞)。如图11A所示,在HL-7702细胞、MRC-5细胞和HEK-293细胞中Cy5的信号只是略高于灭活的A549 细胞提取物的对照组的Cy5信号,表明正常细胞缺乏hAAG。而在肿瘤细胞中,包括A549细 胞和HeLa细胞,Cy5数量较多,说明A549细胞和HeLa细胞中hAAG表达量高,与既往研究 一致。结果表明,该方法可用于肿瘤细胞与正常细胞的鉴别。
以A549细胞为模型,研究Cy5计数与细胞数量的关系。如图11B,A549细胞的数目从1 个到5.8×104个,Cy5的数量也随之增加。在1~1000个细胞范围内,Cy5的个数与细胞个数呈 对数性相关,如图11B插图所示,相应的方程N=703.6log10X+204.9(R2=0.9947),其中N 是Cy5个数、X是A549细胞的数量。通过对照组信号加3倍标准偏差,检测限计算为0.67个细 胞,说明该方法在单细胞水平检测hAAG的可行性。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已,并不用于限制本公开,对于本领域的技术人 员来说,本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内,所作的任何修改、 等同替换、改进等,均应包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 基于单量子点的纳米传感器检测人烷基糖基化酶的方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cacgatgaat cctagactat ttttatagtc taggattcit cgtgacaata caac 54
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cacgatgaat cctagactat ttttatagtc taggattcit cgtgacaata caac 54
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgctggagct gagttgttgt atxgtcacga 30
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaatgacatc gactgacgta cctcatacaa caactcagct ccagcg 46
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 引物
<400> 5
tcgtgacaat acaac 15
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgctggagct gagttgttgt at 22
Claims (11)
1.一种基于单量子点的纳米传感器,其特征是,包括发夹探针、AP探针、捕获探针、改性单量子点、APE1酶、改性脱氧核糖核苷三磷酸;
所述发夹探针为茎-环结构的单链DNA,茎结构的一条互补链修饰次黄嘌呤,茎结构中次黄嘌呤至末端序列为能够与AP探针配对杂交的触发探针;
所述AP探针为含有AP位点的单链DNA,所述AP位点位于能够与触发探针互补的AP探针的序列中,AP位点至AP探针末端的序列为能够与捕获探针配对杂交的引物;
所述捕获探针为一个末端修饰有生物素的单链DNA,捕获探针长度高于引物的长度,所述捕获探针分为两部分序列,一部分序列为能够与引物配对杂交的序列,另一部分序列中含有若干能够与改性脱氧核糖核苷三磷酸的位点,生物素修饰在另一部分序列的末端;
所述改性脱氧核糖核苷三磷酸为修饰有Cy5的一种脱氧核糖核苷三磷酸;
所述改性单量子点为表面修饰链霉亲和素的单量子点。
2.如权利要求1所述的纳米传感器,其特征是,所述发夹探针为3'端突出的茎-环结构的单链DNA,次黄嘌呤位于茎结构的3'端的互补链上,所述触发探针为次黄嘌呤至3'端的序列。
3.如权利要求1所述的纳米传感器,其特征是,所述AP探针的长度大于触发探针的长度;
或,所述引物为AP位点至AP探针5'端的序列。
4.如权利要求1所述的纳米传感器,其特征是,所述捕获探针的5'端修饰有生物素。
5.如权利要求1所述的纳米传感器,其特征是,发夹探针5'至3'的序列为CAC GATGAATCC TAG ACT ATT TTT ATA GTC TAG GAT TCI TCG TGA CAA TAC AAC;
AP探针5'至3'的序列为CGC TGG AGC TGA GTT GTT GTA TXG TCA CGA;
捕获探针5'至3'的序列为AAA TGA CAT CGA CTG ACG TAC CTC A TAC AAC AACTCAGCTCCA GCG。
6.一种人烷基糖基化酶的检测试剂盒,其特征是,包括权利要求1~5任一所述的纳米传感器、缓冲溶液、DNA聚合酶。
7.如权利要求6所述的人烷基糖基化酶的检测试剂盒,其特征是,DNA聚合酶为Klenow片段聚合酶。
8.基于单量子点的纳米传感器在制备检测人烷基糖基化酶的检测试剂盒中的应用,其特征是,提供权利要求1~5任一所述的纳米传感器和对应的检测试剂盒,hAAG引发发夹探针裂解产生触发探针,触发探针与AP探针杂交,在APE1酶的作用产生裂解释放出触发探针,并获得引物,释放的触发探针继续与AP探针杂交APE1的辅助下形成循环裂解,从而获得大量引物,获得引物与捕获探针杂交后,通过聚合将改性脱氧核糖核苷三磷酸聚合至双链DNA中,双链DNA通过生物素与单量子点的链霉亲和素的结合,使双链DNA自组装至单量子点的表面,然后经过激发后使Cy5产生荧光共振能量转移,并进行荧光检测。
9.如权利要求8所述的应用,其特征是,其步骤为:
(1)将待测样品、发夹探针、APE1酶加入至1×NEBuffer 4中,在人体温度下进行反应;
(2)向步骤(1)反应后的溶液中添加AP探针和APE1酶,在人体温度下进行反应;
(3)将步骤(2)反应后的产物、捕获探针、改性脱氧核糖核苷三磷酸、与改性脱氧核糖核苷三磷酸不同另外三种脱氧核糖核苷三磷酸、Klenow片段聚合酶添加至1×NEBuffer2中,在人体温度下进行反应;
(4)将步骤(3)反应后的产物、改性单量子点加入至含有氯化镁、Tris-HCl和硫酸铵的溶液中进行孵育获得QD-dsDNA-Cy5纳米结构;
(5)将获得的QD-dsDNA-Cy5纳米结构进行荧光检测。
10.如权利要求8所述的应用,其特征是,荧光检测条件为:激发波长为405nm,激发和发射狭缝均为5nm。
11.如权利要求8所述的应用,其特征是,将发夹探针放入孵育缓冲溶液中,升温至90~100℃进行孵育,然后冷却至室温形成发夹结构;所述孵育缓冲溶液中含有氯化镁和Tris-HCl。
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