CN112725416B - 一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器及其检测方法和应用 - Google Patents

一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本公开属于生物分析技术领域，具体为一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器及其检测方法和应用。包括双功能哑铃探针、信号探针1和信号探针2；所述双功能哑铃探针包括T7启动子区域，并修饰有一个8‑oxoG和一个脱氧肌苷；所述信号探针1和2的5'端分别被不同的荧光团修饰，在3'端分别被不同的淬灭剂修饰。首次证明了可控T7转录激活的循环级联扩增在单分子水平同时检测人类8‑氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)和人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)，该方法具有良好的特异性和灵敏性，对hOGG1的检出限为3.52×10‑8U/μL，对hAAG的检出限为3.55×10‑7U/μL，甚至可以在单细胞水平定量修复糖基化酶活性。

Description

一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器及其检测方法和 应用
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体为一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器及其检测方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
DNA双螺旋中杂环碱基的特定配对(即A与T，G与C)对于保存和传递人类基因组中编码的遗传信息至关重要。但是，杂环碱基的化学结构具有大量的亲核和氧化还原活性位点，这些位点经常受到各种外源性(例如，紫外线，遗传毒性化学物质和吸烟)和内源性(例如，活性氧和S-腺苷甲硫氨酸)的攻击，各种氧化损伤(例如，氧化碱基，无碱基位点和链断裂)和烷基化损伤(例如，烷基化碱基，脱氨基嘌呤和环状加合物)。其中，8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷(8-oxodG)是最丰富的氧化损伤，在DNA复制过程中可能与2'-脱氧腺苷(dA)错配，导致永久性的G：C→T：A转化突变，而N3-甲基-2'-脱氧腺苷(m3dA)是重要的烷基化病变，它可以进行自发的去嘌呤作用，从而阻断大多数聚合酶，阻碍DNA复制和转录。人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)和人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)是两种类型的修复糖基化酶，它们具有明显的不同功能和底物特异性，通过经典的碱基切除修复(BER)机制可分别催化修复两个主要的氧化和烷基化损伤。因此，同时检测hOGG1和hAAG活性对DNA损伤相关的生物医学研究和临床疾病治疗具有重要意义。
传统方法包括凝胶电泳偶联的放射性同位素标记，酶联免疫测定(ELISA)，质谱(MS)，和高效液相色谱(HPLC)。然而，基于凝胶的放射测定存在以下缺点：危险的辐射和耗时的操作；ELISA需要昂贵的抗体，并且可能会因多步洗涤过程中样品损失而被低估。此外，所有这些方法都是异质和半定量的。MS和HPLC具有较高的背景，这是由复杂的样品制备过程中的人工DNA损伤引起的。另外，还开发了几种新方法，包括比色法，电化学法，和荧光法。比色法可以直观地检测hOGG1的活性，但是DNA-AuNP探针的制备既费时又费力。电化学方法利用尿嘧啶水解引发的DNA双链解开释放的单链DNA(ssDNA)和随后在石墨烯电极沉积中鸟嘌呤的氧化来定量尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的活性，但是修饰电极的制备和DNA探针的固定相对繁琐和复杂。荧光分析利用8-oxoG修复诱导的基于量子点的纳米传感器组装来检测hOGG1活性，但复杂的探针修饰和昂贵的荧光纳米材料限制了其广泛应用。为了提高灵敏度，引入了一些脱氧核糖核苷酸扩增技术来检测修复糖基化酶活性，包括环介导的等温扩增(LAMP)，滚环扩增(RCA)，和内切核酸酶(例如Fok I)辅助信号扩增(EASA)。但是，这些方法涉及复杂的扩增程序，多种引物/酶以及非选择性荧光染料，非特异性聚合和消化引发的高背景。此外，所有上述方法只能检测一种类型的修复糖基化酶。
为了解决上述问题，多种DNA聚合扩增技术(例如聚合酶链反应(PCR)，链置换扩增(SDA)，和指数等温扩增反应(EXPAR))引入生物传感系统中，以探索出色的检测能力。然而，发明人发现，由于空间位阻，变异的化学微环境和拥挤的表面效应，在生物传感器的界面上实现探针结合和信号放大不可避免地会导致结合效率和酶动力降低。尽管纳米结构界面工程的改进可以使目标最大化识别效率，但表面微/纳米加工的可变性可能会显著影响目标物在复杂基质中的定量和重现性。
基因组氧化和烷基化是可能引起诱变、致癌性和致畸性的两种最重要的细胞毒性损害形式。人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)和人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)负责两种主要的氧化和烷基损伤修复，其异常活动可能导致修复缺陷，而缺陷与多种人类疾病(包括癌症)有关。由于复杂的催化途径和水解机理，多种修复糖基化酶的同时和准确检测一直是一个巨大的挑战，迫切需要一种同时检测多种修复糖基化酶的简便，准确，灵敏的方法。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足，本公开的目的是提供一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器及其检测方法和应用，首次证明了可控T7转录激活的循环级联扩增在单分子水平同时检测人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)和人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)，该方法具有良好的特异性和灵敏性，对hOGG1的检出限为3.52×10-8U/μL，对hAAG的检出限为3.55×10-7U/μL，甚至可以在单细胞水平定量修复糖基化酶活性。
具体地，本公开的技术方案如下所述：
在本公开的第一方面，提供一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器，包括双功能哑铃探针、信号探针1和信号探针2；所述双功能哑铃探针包括T7启动子区域，并修饰有一个8-oxoG和一个脱氧肌苷；所述信号探针1和2的5'端分别被不同的荧光团修饰，在3'端分别被不同的淬灭剂修饰。
在本公开的第二方面，提供一种同时检测hOGG1和hAAG的试剂盒，所述试剂盒包括双功能哑铃探针、信号探针1、信号探针2、hOGG1、hAAG、APE1、T7 RNA聚合酶、DSN。
在本公开的第三方面，一种同时检测hOGG1和hAAG的检测方法，所述方法包括：修复糖基化酶催化的受损碱基切除使哑铃探针中两个环的展开；随后的修复激活的T7转录依赖性扩增级联反应诱导Cy3和Cy5荧光团的释放；通过基于TIRF的单分子检测对释放的Cy3和Cy5荧光团进行计数。
在本公开的第四方面，一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器或同时检测hOGG1和hAAG的试剂盒或同时检测hOGG1和hAAG的方法在检测人血清中的修复糖基化酶活性中的应用。
本公开中的一个或多个技术方案具有如下有益效果：
(1)、本公开首次证明了可控T7转录激活的循环级联扩增在单分子水平同时检测人类8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)和人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)，该方法具有良好的特异性和灵敏性，对hOGG1的检出限为3.52×10-8U/μL，对hAAG的检出限为3.55×10-7U/μL，甚至可以在单细胞水平定量修复糖基化酶活性。重要的是，该方法可用于测量动力学参数，筛选潜在的抑制剂并检测人血清中的修复糖基化酶活性，为修复糖基化酶相关的医学研究，药物发现和临床诊断提供了新的有希望的范例。
(2)、在特定的T7启动子区域中，能够使下游DNA序列在等温条件下1小时内转录成大量的单链RNA(ssRNA)序列。与DNA扩增技术相比，基于T7的转录扩增具有独特的优势，灵活的扩增序列设计，容易的界面纳米制备，高杂交效率，快速的酶动力学，有效消除非特异性扩增以及无需热循环仪的优势。本公开证明了可控T7转录激活的循环扩增级联的构建，该方法具有良好的特异性，高灵敏度和较大的动态范围(5个数量级)。
(3)、本公开展示了可控T7转录激活的循环扩增级联的构建，用于在单分子水平同时检测多个修复糖基化酶，并以hOGG1和hAAG作为目标模型，利用了基于T7的体外转录扩增和连续的DSN催化的RNA/DNA杂种循环回收消化，从而获得了出色的扩增特异性和较高的扩增效率，有效消除了不依赖模板/引物和底物的非特异性扩增，并提高了复杂环境中传感的灵敏度和可重复性。利用DNA糖基化酶催化的受损碱基切除修复的高准确性和选择性，T7转录依赖性循环扩增级联反应的高特异性和效率，以及基于TIRF的单分子的高分辨率和信噪比检测，该方法显示出良好的特异性和较高的灵敏度。
(4)、该方法可用于区分不同的干扰酶，测量酶促动力学参数，筛选潜在的抑制剂，确定人血清中的修复糖基化酶活性，甚至通过改变哑铃探针中特定的受损碱基而扩展到监测其他修复糖基化酶，具有实用通用性以及与现有技术的潜在可集成性。
(5)、操作简单，省时省力，不需要复杂的扩增步骤，即可达到信号放大的目的，且反应过程不涉及任何热循环、洗涤、分离过程。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
以下，结合附图来详细说明本公开的实施方案，其中：
图1：实施例1的一种同时检测hOGG1和hAAG的检测方法，可控的T7转录激活的循环扩增级联的示意图，用于在单分子水平上同时检测多种修复糖基化酶。
图2：(A)在不同条件下DNA糖基化酶催化的受损碱基切除修复产物和转录扩增反应产物的变性PAGE分析。泳道1，hOGG1+APE1+哑铃型探针；泳道2，hAAG+APE1+哑铃型探针；泳道3，hOGG1+hAAG+APE1+哑铃探针；泳道4，hOGG1+hAAG+APE1+哑铃探针+T7 RNA聚合酶；泳道5，合成哑铃探针。(B)在hOGG1不存在(下方线)和存在(上方线)的情况下，hOGG1催化的8-oxoG修复激活的T7转录依赖性扩增级联的荧光测量诱导了Cy3荧光团的释放。插图显示在hOGG1不存在(蓝色柱)和存在(红色柱)的情况下Cy3的荧光强度。(C)在不存在(下方线)和存在(上方线)的情况下，hAAG催化的脱氧肌苷修复激活的T7转录依赖性扩增级联诱导的Cy5荧光团释放的荧光测量。插图显示在不存在hAAG(左侧)和存在(右侧)的情况下Cy5的荧光强度。实验中使用了0.1U/μL hOGG1、0.1U/μL hAAG和0.5U/μL APE1。
图3：在没有hOGG1和hAAG(A和E)，和存在hOGG1(B和F)，存在hAAG(C和G)，hAAG和hOGG1同时存在(D和H)的单分子成像。Cy3荧光信号以红色显示，Cy5荧光信号以绿色显示(由于附图为黑白色，无法显示红、绿色，实际上以红、绿色明显区分)。hOGG1浓度为0.1U/μL，hAAG浓度为0.1U/μL。比例尺为5μm。
图4：(A)不同hOGG1浓度下的Cy3计数。插图显示Cy3计数与hOGG1浓度的对数从5×10-7到0.4U/μL呈线性相关。(B)不同hAAG浓度下的Cy5计数。插图显示Cy5计数与浓度从5×10-7到0.1U/μL的对数之间的线性相关性。误差棒代表三个独立实验的标准偏差。
图5：Cy3(左侧柱)和Cy5(右侧柱)对应0.1U/μL hOGG1+0.1U/μL hAAG，0.1U/μLhOGG1，0.1U/μL hAAG，0.1U/μL UDG，0.1g/L BSA和不含任何酶的对照的计数。误差棒代表三个独立实验的标准偏差。
图6：(A)hOGG1的初始速度随不同浓度的DNA底物(即哑铃型探针)的响应而变化。hOGG1浓度为0.1U/μL，APE1浓度为0.5U/μL。(B)hAAG的初始速度对不同浓度的DNA底物(即哑铃型探针)的响应而变化。hAAG浓度为0.1U/μL，APE1浓度为0.5U/μL。误差棒代表三个独立实验的标准偏差。
图7：(A)不同CdCl2浓度下的hOGG1相对活性的变化。(B)不同CdCl2浓度下的hAAG相对活性的变化。实验中使用了0.1U/μL hOGG1、0.1U/μL hAAG和0.5U/μL APE1。误差棒代表三个独立实验的标准偏差。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，目前的用于同时检测hOGG1和hAAG的方法，存在方法涉及复杂的扩增程序，多种引物/酶以及非选择性荧光染料，非特异性聚合和消化引发的高背景，以及由于空间位阻，变异的化学微环境和拥挤的表面效应，在生物传感器的界面上实现探针结合和信号放大不可避免地会导致结合效率和酶动力降低等一些列问题，为了解决这些问题，本公开提供了一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器及其检测方法和应用。
在本公开的一种实施方式中，提供一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器，包括双功能哑铃探针、信号探针1和信号探针2；所述双功能哑铃探针包括T7启动子区域，并修饰有一个8-oxoG和一个脱氧肌苷；所述信号探针1和2的5'端分别被不同的荧光团修饰，在3'端分别被不同的淬灭剂修饰。
其中，信号探针1和2的5'端的荧光团可以为Cy3或Cy5，具体不做限定，只要能够保证不同的荧光团区分目标检测物即可，同理，在3'的淬灭剂可以为BHQ2或BHQ3。
通过修饰有一个8-oxoG和一个脱氧肌苷的双功能哑铃探针，分别用作hOGG1和hAAG的底物，以及转录扩增的T7 RNA聚合酶的模板。hOGG1和hAAG的存在可以分别从哑铃形探针中去除受损的8-oxoG和脱氧肌苷，从而产生两个去嘌呤(AP)位点。AP核酸内切酶(APE1)随后切割AP位点，导致哑铃探针断裂，两个环解开并同时暴露两个T7启动子。暴露的T7启动子可以通过T7 RNA聚合酶催化，以打开的环为模板来激活转录扩增，诱导模板的有效转录以产生大量的两种不同的单链RNA转录本(即报告探针1和2)。报告探针1和2可以分别与信号探针1和2杂交，以启动信号探针的双特异性核酸酶定向循环消化，从而释放出大量Cy3和Cy5荧光分子。可以通过基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测来简单地测量释放的Cy3和Cy5荧光分子，其中Cy3信号指示hOGG1的存在，而Cy5信号指示hAAG的存在(原理参见图1)。
其中，双功能哑铃探针的序列为：5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG ITA ATACTA TCT CTT ATC CCT ATA GTG AGT CGT ATT ACC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGO GTGTAT CTC TTT CAC CCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA G-3'(其中I和O分别代表8-oxoG和脱氧肌苷)；
信号探针1的序列为：5'-Cy3-TAT CTC TTT C-BHQ2-3'；
信号探针2的序列为：5'-Cy5-TAC TAT CTC T-BHQ3-3'。
信号探针1和2(图1，左侧和右侧)都是10-nt DNA序列，在5'端被荧光团(Cy3或Cy5)修饰，在3'端被淬灭剂(BHQ2或BHQ3)修饰，信号探针1和2分别可以与报告探针1和2杂交，以启动双链特异性核酸酶(DSN)定向的Cy3和Cy5荧光团的循环释放。
进一步地，所述双功能哑铃探针由茎结构域和两个环结构域组成，并且它既作为修复糖基化酶的催化底物，又作为基于T7的转录扩增的转录模板；茎包含两个互补链，分别为上链和下链。
进一步地，在上链中，受损的脱氧肌苷(即I)碱基被设计为距环1结构靠近5'端的3个碱基，在紧靠脱氧肌苷碱基的5'端的20-nt序列是一个T7启动子区域。
进一步地，在下链中，受损的8-oxoG(即O)碱基位于距环2结构接近3'末端的3个碱基处，并且在紧邻8-oxoG碱基的5'端的20-nt序列是T7启动子区域。
受损的8-oxoG和脱氧肌苷碱基可以分别由hOGG1和hAAG切除，以同时激活修复激活的T7转录依赖性扩增级联反应。两个环1和2都是9-nt序列，它们可以充当转录模板，在解折叠时产生不同的报告探针1和2。
在本公开的一种实施方式中，提供一种同时检测hOGG1和hAAG的试剂盒，所述试剂盒包括双功能哑铃探针、信号探针1、信号探针2、hOGG1、hAAG、APE1、T7 RNA聚合酶、DSN。
进一步地，所述试剂盒还包括杂交缓冲液(1.5mM MgCl2，10mM Tris-HCl，pH8.0)、10×NEBuffer 2(500mM sodium chloride(NaCl),100mM trizma hydrochloride(Tris-HCl),100mM magnesium chloride(MgCl2),10mM DL-Dithiothreitol(DTT),pH7.9)、10×ThermoPol反应缓冲液(200mM Tris-HCl,100mM ammonium sulfate((NH4)2SO4),100mMpotassium chloride(KCl),20mM magnesium sulfate(MgSO4),1％Triton X-100,pH8.8)、10×NEBuffer 4(500mM potassium acetate(KAc),200mM tris-acetate(Tris-Ac),100mM magnesium acetate(Mg(Ac)2),10mM DTT,pH 7.9)、NTP(ATP,UTP,GTP and CTP)were purchased from New England Biolabs(Ipswich,MA,USA))、RNase抑制剂和10×RNAPol反应缓冲液(400mM Tris-HCl,60mM MgCl2,20mM spermidine,100mM DTT,pH 7.9)。
在本公开的一种实施方式中，一种同时检测hOGG1和hAAG的检测方法，所述检测方法包括：修复糖基化酶催化的受损碱基切除使双功能哑铃探针中两个环的展开；随后的修复激活的T7转录依赖性扩增级联反应诱导Cy3和Cy5荧光团的释放；通过基于TIRF的单分子检测对释放的Cy3和Cy5荧光团进行计数。
在本公开的一种实施方式中，一种同时检测hOGG1和hAAG的检测方法，具体包括：
步骤(1)：将双功能哑铃探针添加到包含hOGG1和hAAG的切除反应系统中，进行第一次温育，得到切除产物；
步骤(2)：将切除产物添加到扩增反应系统中，进行第二次温育进行转录扩增；
步骤(3)：扩增反应后，继续向扩增反应系统中继续添加包括DSN、信号探针1、信号探针2的缓冲液进行孵育，以进行DSN定向的信号探针回收裂解。
其中，步骤(1)中：所述切除反应系统中还包括APE1、10×NEBuffer 2、10×ThermoPol反应缓冲液和10×NEBuffer 4。
步骤(1)中，第一次温育的温度为20-50℃，优选的，为37℃；或，第一次温育的时间为25-50min，优选的，为30min。
步骤(2)中，所述扩增反应系统包括NTP，T7 RNA聚合酶，RNase抑制剂和10×RNAPol反应缓冲液。
步骤(2)中，所述第二次温育的温度为20-50℃，优选的，为37℃；或，第二次温育的时间为25-50min，优选的，为40min。
步骤(3)中，孵育的温度为40-70℃，优选的，为55℃；或，孵育的时间为25-50min，优选的，为40min。
在存在hOGG1和hAAG的情况下，哑铃探针中的受损碱基8-oxoG和脱氧肌苷被特异性识别并通过裂解连接受损碱基的C1-N糖苷键有效地从O：C和I：T对中切除，留下两个脱嘌呤嘧啶(AP)位点。这两个AP位点随后可以通过5'-磷酸二酯的水解被人类AP核酸内切酶(APE1)裂解，留下5'-脱氧核糖磷酸(5'-dRP)和3'-OH末端，同时导致哑铃探针断裂，环1和环2展开以及两个T7启动子区域暴露。以环1和2的未折叠序列为模板，相反互补链中的相应T7启动子在存在T7 RNA聚合酶的情况下激活转录扩增反应，诱导模板的有效转录，产生大量的单链RNA转录本(即报告探针1和2)。生成的报告探针1和2分别与信号探针1和2杂交，形成两个RNA/DNA异源双链体1和2，它们充当双链特异性核酸酶(DSN)的常用底物，双链特异性核酸酶(DSN)特异性降解RNA/DNA杂合双链体中的DNA，但对RNA链几乎没有活性。RNA/DNA异源双链体1和2被DSN逐步消化，从而导致Cy3和Cy5荧光团以及报告探针的释放。值得注意的是，释放的报告探针1和2可以分别与游离信号探针1和2进一步杂交，以启动消化-释放-杂交的多个循环，最终释放出大量的Cy3和Cy5荧光团。通过基于TIRF的单分子成像简单地监测Cy3和Cy5信号，可以定量检测hOGG1和hAAG活性。相反，在没有hOGG1和hAAG的情况下，不能去除8-oxoG碱基和脱氧肌苷碱基，也不能裂解哑铃探针，因此无法启动T7转录依赖性循环扩增级联反应，没有信号探针可以被消化，并且Cy3和Cy5荧光信号都不能被观察到。利用天然BER机制的高精度，T7转录依赖的循环扩增级联的高特异性和高效率以及单分子检测的高信噪比，该策略提供了一种简便而强大的平台同时检测hOGG1和hAAG活性并且具有良好的特异性和高灵敏度。
在本公开的一种实施方式中，一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器或同时检测hOGG1和hAAG的试剂盒或同时检测hOGG1和hAAG的检测方法在检测人血清中的修复糖基化酶活性中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
一种同时检测hOGG1和hAAG的检测方法：
修复激活的T7转录依赖性循环扩增级联反应：将所有合成的寡核苷酸溶解在1xTris-EDTA缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)中，以制备储备溶液。用杂交缓冲液(1.5mM MgCl2，10mM Tris-HCl，pH 8.0)将哑铃探针稀释至10μM，在95℃下孵育5分钟，然后在30分钟内缓慢冷却至室温，使其折叠至理想状态的发夹结构。然后将1μL哑铃探针添加到包含不同浓度的hOGG1和hAAG，10U APE1、2μL 10×NEBuffer 2、2μL10×ThermoPol反应缓冲液和2μL 10×NEBuffer 4的20μL切除反应系统中，在37℃下温育30分钟以进行碱基切除修复。
随后，将10μL切除产物添加到10μL扩增反应系统中，该反应系统包含40μM NTP，30U T7 RNA聚合酶，20U RNase抑制剂和2μL 10×RNAPol反应缓冲液，在37℃下温育40分钟进行转录扩增。转录反应后，将0.7U DSN，500nM信号探针1、500nM信号探针2和2μL10×DSN主缓冲液添加到上述扩增反应系统中，在55℃孵育40分钟以进行DSN定向的信号探针回收裂解。
电泳分析和荧光测量：为了分析切除和转录扩增反应的产物，在110V的1×TBE缓冲液(9mM Tris-HCl，9mM硼酸，0.2mM EDTA，pH 7.9)中进行12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)在室温下恒压40分钟。凝胶电泳后，将SYBR gold用作荧光指示剂以染色凝胶。然后通过ChemiDoc MP Imaging系统(Hercules，California，USA)使染色的凝胶可视化。为了进行荧光测量，用超纯水将20μL扩增产物稀释至最终体积60μL。Epi-green的照明光源(520-545nm激发)和577-613nm滤光片以及Epi-red的照明光源(625-650nm激发)和675-725nm率光片分别用于Cy3和Cy5荧光团的荧光分析。Cy3和Cy5荧光分子的荧光光谱由Hitachi F-7000荧光分光光度计(日本东京)测量，激发波长分别为520和632nm。分别在发射波长564和663nm处记录Cy3和Cy5的荧光强度，以进行数据分析。
单分子检测和数据分析：对于TIRF成像，应使用成像缓冲液(67mM甘氨酸-KOH(pH9.4)，1mg/mL Trolox，50μg/mL BSA和2.5mM MgCl2)和新鲜制备的除氧缓冲液(1mg/mL葡萄糖氧化酶，0.04％mg/mL过氧化氢酶和0.4％(w/v)D-葡萄糖)。然后将反应产物用上述缓冲液稀释400倍。将10μL样品直接吸到盖玻片上进行荧光成像。用561nm和640nm激光通过全内反射同时激发Cy3和Cy5荧光团，并通过油浸物镜(CFI Apochromat TIRF 100x)收集光子。Cy3和Cy5的荧光通过二向色镜分离，并成像到EMCCD相机上(Photometrics，Evolve 512)。为了进行数据分析，使用Image J软件为Cy3和Cy5荧光分子计数选择了图像的感兴趣区域(600×600像素)。
抑制分析：为了进行抑制测定，将不同浓度的CdCl2与0.1U/μL hOGG1和0.1U/μLhAAG在37℃孵育20分钟，然后使用相同的步骤添加用于hOGG1和hAAG测定的切除和扩增反应系统，如上所述。根据以下公式确定hOGG1和hAAG的相对活性RA(％)＝(Ni-N0)/(Nt-N0),其中N0是在不存在hOGG1/hAAG的情况下Cy3/Cy5计数，Nt是在hOGG1(0.1U/μL)/hAAG(0.1U/μL)存在下的Cy3/Cy5计数，Ni是在hOGG1/hAAG和CdCl2存在下的Cy3/Cy5计数。将RA对CdCl2的浓度作图，并根据拟合曲线计算CdCl2的IC50值。
结果分析与讨论
1、同时检测hOGG1和hAAG可行性实验
为了验证该方法的可行性，分别进行了凝胶电泳(图2A)，荧光检测(图2B，2C)，单分子检测(图3)。要研究hOGG1和hAAG是否能分别切除8-oxoG和脱氧肌苷以分别诱导哑铃探针中环1和2的解折叠，利用12％变性PAGE分析了以SYBR Gold为荧光指示剂的切除产物。如图2A所示，在存在hOGG1+APE1+哑铃型探针(图2A，泳道1)的情况下，观察到两个特征带，分别为80nt和37nt，这正是较长切除产物(80nt)与较短的切除产物(37nt)的大小，表明hOGG1可以在APE1的帮助下准确而有效地切除8-oxoG修复，从而在哑铃探针中产生核苷酸缺口，将哑铃探针切割成两个片段(即更长的80nt核苷酸和更短的37nt切除产物)。同样，在存在hAAG+APE1+哑铃型探针的情况下(图2A，泳道2)，观察到两个特征带，分别为96nt和21nt。较长的切除产物(96nt)和较短的切除产物(21nt)，表明hAAG可以在APE1的帮助下特异性切除脱氧肌苷修复物，从而产生一个核苷酸缺口，用于将哑铃形探针切割成两个片段(即更长的96nt和较短的21nt切除产物)。在存在hOGG1+hAAG+APE1+哑铃型探针的情况下，观察到了具有不同长度(37nt，21nt和58nt)的切除产物(图2A，泳道3)，证明hOGG1和hAAG的存在分别使受损的8-oxoG和脱氧肌苷切除修复成为可能，从而导致哑铃形探针的裂解，产生不同的DNA片段。值得注意的是，58nt的条带是由hOGG1和hAAG同时切割相同的哑铃探针得到的切除产物的大小。进一步分析了转录扩增的反应产物，在反应系统中加入了T7 RNA聚合酶(存在hOGG1+hAAG+APE1+哑铃型探针)。观察到一个独特的19nt条带(图2A，第4道)，与两个RNA转录本(即，报告探针1和2)的大小相同，表明hOGG1和hAAG的存在将分别导致8-oxoG和脱氧肌苷的去除，从而导致哑铃探针断裂，两个环展开以及同时暴露两个T7启动子和随后暴露的T7启动子通过未折叠的环1和2作为模板通过T7RNA聚合酶催化激活转录扩增，以产生大量的19-nt报告探针1和2。合成哑铃探针的尺寸(118nt，图2A，第5道)。为进一步验证所提出策略的可行性，将信号探针1和2添加到反应系统中(存在hOGG1+hAAG+APE1+哑铃探针+T7 RNA聚合酶)，并在不同条件下测量了荧光发射光谱(图2B和C)。在存在hOGG1的情况下检测到具有562nm特征发射峰的重要Cy3荧光信号(图2B，上方线)，在存在hAAG的情况下检测到具有665nm特征峰的重要Cy5荧光信号(图2C中的上方线)，表明hOGG1和hAAG可以分别催化8-oxoG和脱氧肌苷的切除修复，激活T7转录依赖性扩增反应以产生丰富的报告探针1和2，得到的报告探针1和2可以与信号探针1和2杂交，分别诱导DSN定向的Cy3和Cy5荧光分子的循环释放。相反，在没有hOGG1或hAAG的情况下，没有检测到明显的Cy3(图2B，下方线)和Cy5荧光信号(图2C，下方线)。值得注意的是，在存在hOGG1+hAAG+T7 RNA聚合酶的情况下(图2A，泳道4)，在没有hOGG1或hAAG的情况下，没有检测到非特异性条带，这归因于以下因素：(1)修复糖基化酶引发的天然BER机制对受损碱基表现出较高的准确性，抑制了非选择性切除；(2)基于T7的转录使得RNA转录物能够非常特异地扩增，防止了非特异扩增；(3)DSN对RNA/DNA异源双链体中的DNA具有很高的选择性，诱导了信号探针的特异性消化。这些结果(图2)清楚地表明，该方法可用于同时检测hOGG1和hAAG。采用基于全内反射荧光(TIRF)的荧光成像来检测单分子水平的修复糖基化酶活性。TIRF显微镜基于光从高折射介质(例如玻璃)进入低折射介质(例如水)时发生的全内反射现象。由内部全反射光产生的消逝波仅激发靠近反射界面的薄层(<100nm)中的荧光分子，从而有效地减小了内部深度的背景。如图3所示，在存在hOGG1并激发的情况下在561nm处检测到了独特的Cy3荧光信号(图3B)，在hAAG存在下在640nm激发下观察到明显的Cy5荧光信号(图3G)，表明hOGG1和hAAG可以分别催化受损的8-oxoG和脱氧肌苷碱基修复，并启动随后的T7转录依赖性扩增级联反应分别释放Cy3和Cy5荧光分子。相反，在没有hOGG1(图3A)或hAAG(图3E)的情况下，未观察到Cy3和Cy5荧光信号，表明未发生修复激活的T7转录依赖性级联扩增，因此没有释放Cy3和Cy5荧光分子。hOGG1和hAAG的存在可以同时产生带有561nm和640nm双激发通道的Cy3(图3D)和Cy5(图3H)荧光信号。这些结果清楚地表明，Cy3/Cy5荧光对适用于单分子水平的同时修复糖基化酶测定，并且所提出的方法能够以高特异性检测多种修复糖基化酶活性。
2、灵敏度检测
通过测量不同浓度的hOGG1和hAAG的Cy3和Cy5荧光分子的数量来评估该方法的灵敏度(图4)。如图4A所示，Cy3计数随着hOGG1浓度从5×10-7增加到0.4U/μL而增加，并且Cy3计数与hOGG1浓度在5×10-7到0.4U/μL的5个数量级的大动态范围内(图4A的插图)具有良好的线性相关性。回归方程为N＝436.81+55.54log10 C，相关系数为0.9959，其中N为测得的Cy3计数，C为hOGG1浓度(U/μL)。通过评估三倍标准偏差加上阴性对照的平均响应，计算出检出限为3.52×10-8U/μL。如图4B所示，Cy5计数随着hAAG浓度从5×10-7增加到0.4U/μL而增加，并且Cy5计数与hAAG浓度之间具有良好的线性相关性。在从5×10-7到0.1U/μL的5个数量级的大动态范围内(图4B的插图)。回归方程为N＝318.79+46.54log10 C，相关系数为0.9927，其中N为测得的Cy5计数，C为hAAG的浓度(U/μL)。通过评估三倍标准偏差加上阴性对照的平均响应，计算出检出限为3.55×10-7U/μL。
3、特异性检测
为了评估所提出方法的选择性，使用牛血清白蛋白(BSA)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)作为阴性对照。BSA是不相关的蛋白质，它不能识别和催化哑铃探针中受损的碱基修复。UDG是修复糖基化酶家族的成员，但它只能从U：A错配中定位和切除尿嘧啶。BSA和UDG都无法催化受损的碱基(即8-oxoG或脱氧肌苷)修复，从而启动T7转录依赖性扩增级联反应，以释放Cy3和Cy5荧光团。如图5所示，在没有任何酶的情况下，分别在BSA和UDG存在下均未检测到Cy3和Cy5荧光信号。相反，在存在hOGG1的情况下观察到明显的Cy3荧光信号，在存在hAAG的情况下观察到明显的Cy5荧光信号，并且在存在hOGG1和hAAG的情况下同时检测到不同的Cy3和Cy5荧光信号，这表明只有hOGG1和hAAG可以分别特异性识别和催化受损的8-oxoG和脱氧肌苷碱基修复，从而启动随后的T7转录依赖性循环扩增级联反应，以释放Cy3和Cy5荧光团。这些结果清楚地表明，所提出的方法可以高选择性地区分hOGG1和hAAG与其他干扰酶。
4、动力学分析
进一步使用所提出的方法来分别测量hOGG1和hAAG的酶动力学参数。在存在0.1U/μLhOGG1、0.5U/μLAPE1和不同浓度的DNA底物(即哑铃探针)的情况下，在2分钟hOGG1催化的8-oxoG切除修复后，对hOGG1的初始速度(V)进行定量。在37℃下反应(图6A)。在存在0.1U/μLhAAG，0.5U/μLAPE1和不同浓度的哑铃探针的情况下，在37℃下经过5分钟hAAG催化的脱氧肌苷切除修复反应后，检测到了hAAG的初始速度(V)(图6B)。如图6A所示，hOGG1的初始速度随着哑铃探针(即DNA底物)浓度的增加而相应增加。根据Michaelis-Menten方程V＝Vmax[S]/(Km+[S])(Vmax是最大初始速度，[S]是哑铃形探针的浓度，Km是Michaelis-Menten常数)，分别确定hOGG1的Vm值为230.25min-1，Km值为10.21nM。所得的Km值与通过基于凝胶的放射性分析(8.9nM)，基于单个量子点的纳米传感器(10.7nM)，和基于Fok I辅助信号放大的荧光分析(12.1nM)所获得的Km值一致。同样，hAAG的初始速度随哑铃探针浓度的增加而相应增加(图6B)。根据Michaelis-Menten方程，对于hAAG，Vmax计算100.73min-1，Km计算为24.19nM。所获得的Km值与通过放射性分析(13-25nM)，和基于自动催化裂解介导的基于荧光恢复的分析(22.1nM)所获得的Km值相符。这些结果表明，该方法可被应用以高精度评估hOGG1和hAAG的动力学参数。
5、抑制剂分析
为了证明所提出的抑制试验方法的可行性，使用氯化铬(II)(CdCl2，一种修复糖基化酶的经典抑制剂)作为模型抑制剂。CdCl2可以通过两种不同的途径抑制DNA糖基化酶的活性：(1)Cd2+离子可以竞争性地占据与DNA底物结合的hOGG1的同一位点，防止DNA底物的裂解；(2)Cd2+离子可以直接结合hAAG的活性位点(即Zn2+结合位点)，从而使hAAG的活性失活，如图7所示，随着CdCl2浓度从0增加到250μM，hOGG1和hAAG的相对活性随着浓度增加而降低。使用半抑制剂浓度(IC50，即将酶活性降低一半所需的抑制浓度)来评估Cd2+对修复糖基化酶的抑制作用。根据拟合的校准曲线(图7A)，hOGG1的IC50值经计算为19.02μM，这与单量子点型纳米传感器获得的值(10.93μM)和通过Fok I辅助的基于信号放大的荧光测定获得的值(8.86μM)一致。同样，根据拟合的校准曲线(图7B)，hAAG的IC50值经计算为44.79μM，与通过放射性测定获得的值(～100μM)和通过放射性测定获得的值(66.57μM)一致。这些结果表明，该方法可用于同时筛选多种修复糖基化酶抑制剂，在药物开发研究中具有广阔的前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内
Figure BDA0002907716040000201
Figure BDA0002907716040000211

Claims (9)

1.一种同时检测人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶hOGG1和人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hAAG的荧光传感器，其特征是，包括双功能哑铃探针、信号探针1和信号探针2；所述双功能哑铃探针包括T7启动子区域，并修饰有一个8-oxoG和一个脱氧肌苷；所述信号探针1和2的5'端分别被不同的荧光团修饰，在3'端分别被不同的淬灭剂修饰；
所述双功能哑铃探针由茎结构域和两个环结构域组成；茎包含两个互补链，分别为上链和下链；
在上链中，受损的脱氧肌苷碱基被设计为距环1结构靠近5'端的3个碱基，在紧靠脱氧肌苷碱基的5'端的20-nt序列是一个T7启动子区域；和，在下链中，受损的8-oxoG碱基位于距环2结构接近3'末端的3个碱基处，并且在紧邻8-oxoG碱基的5'端的20-nt序列是T7启动子区域；
双功能哑铃探针的序列为：5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG ITA ATA CTA TCT CTTATC CCT ATA GTG AGT CGT ATT ACC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGO GTG TAT CTC TTTCAC CCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA G-3'，其中I和O分别代表8-oxoG和脱氧肌苷；
信号探针1的序列为：5'-Cy3-TAT CTC TTT C-BHQ2-3'；
信号探针2的序列为：5'-Cy5-TAC TAT CTC T-BHQ3-3'。
2.一种同时检测人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶hOGG1和人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hAAG的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括双功能哑铃探针、信号探针1、信号探针2、hOGG1、hAAG、APE1、T7 RNA聚合酶、DSN；进一步地，所述试剂盒还包括杂交缓冲液、10×NEBuffer2、10×ThermoPol反应缓冲液、10×NEBuffer 4、NTP、RNase抑制剂和10×RNAPol反应缓冲液；
双功能哑铃探针的序列为：5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG ITA ATA CTA TCT CTTATC CCT ATA GTG AGT CGT ATT ACC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGO GTG TAT CTC TTTCAC CCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA G-3'，其中I和O分别代表8-oxoG和脱氧肌苷；
信号探针1的序列为：5'-Cy3-TAT CTC TTT C-BHQ2-3'；
信号探针2的序列为：5'-Cy5-TAC TAT CTC T-BHQ3-3'。
3.一种同时检测人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶hOGG1和人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hAAG的检测方法，其特征是，所述检测方法包括：修复糖基化酶催化的受损碱基切除使双功能哑铃探针中两个环的展开；随后的修复激活的T7转录依赖性扩增级联反应诱导Cy3和Cy5荧光团的释放；通过基于TIRF的单分子检测对释放的Cy3和Cy5荧光团进行计数；
所述检测方法具体包括：
步骤（1）：将双功能哑铃探针添加到包含hOGG1和hAAG的切除反应系统中，进行第一次温育，得到切除产物；
步骤（2）：将切除产物添加到扩增反应系统中，进行第二次温育进行转录扩增；
步骤（3）：扩增反应后，继续向扩增反应系统中继续添加包括DSN、信号探针1、信号探针2的缓冲液进行孵育，以进行DSN定向的信号探针回收裂解；
双功能哑铃探针的序列为：5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG ITA ATA CTA TCT CTTATC CCT ATA GTG AGT CGT ATT ACC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGO GTG TAT CTC TTTCAC CCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA G-3'，其中I和O分别代表8-oxoG和脱氧肌苷；
信号探针1的序列为：5'-Cy3-TAT CTC TTT C-BHQ2-3'；
信号探针2的序列为：5'-Cy5-TAC TAT CTC T-BHQ3-3'；
所述方法不以疾病诊断和治疗为目的。
4.如权利要求3所述的一种同时检测hOGG1和hAAG的检测方法，其特征是，步骤（1）中：所述切除反应系统中还包括APE1、10×NEBuffer 2、10×ThermoPol反应缓冲液和10×NEBuffer 4。
5.如权利要求3所述的一种同时检测hOGG1和hAAG的检测方法，其特征是，
步骤（1）中，第一次温育的温度为20-50 ℃；第一次温育的时间为25-50 min。
6.如权利要求5所述的一种同时检测hOGG1和hAAG的检测方法，其特征是，步骤（1）中，第一次温育的温度为37 ℃；第一次温育的时间为30 min。
7.如权利要求3所述的一种同时检测hOGG1和hAAG的检测方法，其特征是，步骤（2）中，所述扩增反应系统包括NTP，T7 RNA聚合酶，RNase抑制剂和10×RNAPol反应缓冲液；
步骤（2）中，所述第二次温育的温度为20-50 ℃；第二次温育的时间为25-50 min；
步骤（3）中，孵育的温度为40-70 ℃；孵育的时间为25-50 min。
8.如权利要求3所述的一种同时检测hOGG1和hAAG的检测方法，其特征是，步骤（2）中，所述第二次温育的温度为37 ℃，第二次温育的时间为40 min；步骤（3）中，孵育的温度为55℃，孵育的时间为40 min。
9.权利要求1所述的同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器或权利要求2所述的同时检测hOGG1和hAAG的试剂盒或权利要求3-7任一项所述的同时检测hOGG1和hAAG的检测方法在检测DNA甲基化领域中的应用；
所述应用不以疾病诊断和治疗为目的。
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