CN108018336A - 一种dna甲基化检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种dna甲基化检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种DNA甲基化检测试剂盒及其使用方法。所述试剂盒包括亚硫酸氢钠、对苯二酚、脱盐柱、0.3摩尔每升的氢氧化钠、醋酸铵、乙醇、三氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、聚乙二醇辛基苯基醚、探针X、探针Y、探针X′、探针Y′、核酸外切酶I、核酸外切酶III、10×NEBufferI、硫酸铵、Cy5标记的报告探针、生物素标记的捕获探针、热稳定连接酶和605量子点。本发明试剂盒高灵敏度高、高特异性强、操作简单本，在胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)和非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点都可以进行DNA甲基化检测。

Description

一种DNA甲基化检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种DNA甲基化检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
DNA甲基化是人类基因组中高度表征的表观遗传修饰，经常发生在胞嘧啶/ 鸟嘌呤二核苷酸(CpG)岛的碳五位胞嘧啶残基，是通过DNA甲基转移酶催化一个甲基到胞嘧啶的碳5位置来实现的。每个胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG) 岛可能由几十到几百个胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)构成主要的基因启动子区域。启动子区域里胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)岛的甲基化可能导致对人体细胞多种功能调节的失控，包括DNA复制、DNA修复、基因转录、X染色体失活、基因组印记和细胞分化。而异常的DNA甲基化模式与各种遗传疾病和癌症密切相关，如前列腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、视网膜母细胞瘤和血液肿瘤。最近的研究表明，非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点的DNA甲基化(即胞嘧啶/腺嘌呤二核苷酸(CpA)、胞嘧啶/胸腺嘌呤二核苷酸(CpT)和胞嘧啶/胞嘧啶二核苷酸(CpC))在基因表达调控中也起着重要的作用。高水平的非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)甲基化基因在人类成熟卵母细胞的基因组中与相应基因的表达水平相关。此外，通过识别甲基化胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)结合蛋白2(MeCP2)，5-甲基化胞嘧啶后面除鸟嘌呤核苷酸之外的碱基的甲基化(mCH，其中H＝A或T或C)可以在神经障碍综合征中调节神经元的基因表达。因此，DNA甲基化可以作为一个大规模发生事件的标志和各种疾病的潜在生物标志物，在胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸 (CpG)和非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点对DNA甲基化进行准确定量不仅对早期诊断、预后和癌症治疗有重要意义，在生化研究、新型药物的研发方面也具有重大意义。
迄今为止，已发展出多种方法来检测DNA甲基化。传统方法主要是基于聚合酶链式反应(PCR)，如化学DNA测序与连接介导的聚合酶链式反应(LM-PCR) 相结合、对甲基化敏的任意引物聚合酶链式反应(MS-AP-PCR)、甲基化特异性聚合酶链式反应(MS-PCR)、基于荧光的实时定量聚合酶链式反应(Fb-RT-PCR)、甲基化特异性的基于量子点的荧光共振能量转移反应(MS-qFRET)。然而，这些基于聚合酶链式反应(PCR)的方法操作程序严格复杂(例如需要特定的反应温度和循环次数)，并且有一些其他的限制。化学DNA测序与连接介导的聚合酶链式反应(LM-PCR)要求对非甲基化胞嘧啶进行预处理，并且需要凝胶测序，操作十分复杂。对甲基化敏感的任意引物聚合酶链式反应(MS-AP-PCR)使用限制酶利用限制位点以及放射性标记进行甲基化分析。甲基化特异性聚合酶链式反应(MS-PCR)可以准确定量在甲基化胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)岛的甲基化水平，但它只提供定性数据而不是定量数据。基于荧光的实时定量聚合酶链式反应(Fb-RT-PCR)可实现定量和实时检测，但双标记的TaqMan探针价格昂贵并且容易受到污染。甲基化特异性的基于量子点的荧光共振能量转移(MS-qFRET)可以用简单实现DNA甲基化检测，但末端需要标记MSP引物，价格非常昂贵。几个无需聚合酶链式反应(PCR)的方法已经用来进行DNA甲基化检测实验。石英晶体微量天平法(QCM)消耗DNA样品非常少，可以用来测量DNA甲基化，但需要通过聚合酶链式反应(PCR)来增加甲基化DNA的量并且需要把巯基修饰的DNA探针固定到石英晶体微量天平(QCM)芯片的金表面。甲基化DNA沉淀与荧光素酶融合锌指法(MELZA)相结合能在雄激素受体(AR)的启动子区域进行化学发光检测DNA甲基化，但是谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记的甲基化胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)结合域(MBD)蛋白和谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记的zif268-荧光素酶的构造需要专业操作技能。基于石墨烯氧化物(GO)的电化学方法可以定点检测DNA甲基化，但是石墨烯氧化物(GO)片的合成、在石墨烯氧化物(GO)表面修饰硫堇、金纳米粒子(AuNPs)沉积在玻碳(GC)电极表面、在覆盖金纳米粒子的电极进行DNA 探针修饰和结合硫堇/石墨烯氧化物(GO)涉及的实验程序非常复杂。超支化滚环扩增(HRCA)和基于切口酶信号扩增(NESA)的荧光法能够灵敏的检测DNA 甲基化，但是由于染料SYBR Green I和特定的DNA片段(富含GC的序列)结合产生了非特异性扩增，在没有DNA模板的情况下切割酶和DNA聚合酶相结合也会产生非特异性扩增。值得注意的是，由于要么需要识别特定序列的限制性内切酶和化学切割，要么需要为引物设计拥有充足的5-甲基化胞嘧啶位点的特定序列，导致上面的方法仅适用于在胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点检测DNA 甲基化，在非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点无法检测。最近，有一个方法检测单个5-甲基化胞嘧啶位点。基于连接的聚合酶链式反应(PCR)能同时检测包括非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点的多位点5-甲基化胞嘧啶，但使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析反应产物，灵敏度低且非常耗时。因此，开发一种简单、高灵敏和高特异的方法在胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)和非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点上检测DNA甲基化是非常必要的。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种DNA甲基化检测试剂盒及其使用方法。本发明试剂盒利用三步循环连接酶链式反应(LCR)介导的基于量子点的荧光共振能量转移(FRET)的可以同时在胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)和非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点对DNA甲基化进行检测。热稳定DNA连接酶使得连接反应特异性高，三步循环连接酶链式反应使得反应扩增效率高，基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测使得反应灵敏度高，因此，本发明试剂盒可以实现在单个5-甲基化位点分辨率水平上对DNA甲基化进行检测，检测限可以达到1.0阿摩尔每升，动态范围可以达到7个数量级。本发明试剂盒可以从甲基化和非甲基化DNA的混合物中检测到低至0.01％甲基化水平的样品，甚至可以在单个癌细胞中定量DNA甲基化水平。
为实现上述目的，本发明技术方案如下：
本发明目的之一，提供一种DNA甲基化检测试剂盒。所述试剂盒包括亚硫酸氢钠、对苯二酚、脱盐柱、0.3摩尔每升的氢氧化钠、醋酸铵、乙醇、三氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、聚乙二醇辛基苯基醚、探针X、探针Y、探针X′、探针Y′、核酸外切酶I、核酸外切酶III、10×NEBufferI、硫酸铵、Cy5标记的报告探针、生物素标记的捕获探针、热稳定连接酶和605量子点。
本发明目的之二，提供所述DNA甲基化检测试剂盒的使用方法，分为以下步骤：
(1)DNA亚硫酸氢盐处理，将待测DNA在42℃、0.35摩尔每升的氢氧化钠条件下变性30分钟后，进行亚硫酸氢钠反应，反应后利用脱盐柱进行DNA 回收，用0.3摩尔每升的氢氧化钠在37摄氏度反应15分钟完成修饰，然后用醋酸铵中和、乙醇沉淀和干燥，将DNA溶液超纯水中20℃保存、备用；
(2)三步循环连接酶链式反应；
(3)核酸外切酶I和核酸外切酶III处理：在三步循环连接酶链式反应(LCR) 结束后，在37℃条件下，50单位核酸外切酶I，50单位核酸外切酶III， 10×NEBufferI加入到反应混合物来消化探针X、X′、Y′和X′Y′30分钟，消化反应在90℃孵育10分钟以终止反应，将XY产品存储在4摄氏度；
(4)杂交反应：Cy5标记的报告探针、生物素标记的捕获探针和XY产品在缓冲溶液体系中室温下孵育20分钟获得三明治杂交产物；杂交反应后三明治产物通过生物素-链酶亲和素相互作用组装到605量子点表面来形成605量子点- 寡核苷酸-Cy5纳米结构。
本发明目的之三，提供所述DNA甲基化检测试剂盒的应用，所述试剂盒可用于在胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸和非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸位点进行DNA甲基化的检测。
本发明试剂盒工作原理如图1所示：我们设计了带有距5’末端22个碱基的单5甲基化胞嘧啶、长度为46个碱基的目标DNA。与在胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)岛同时存在多个5甲基化胞嘧啶不同，在非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸 (CpG)区的甲基化DNA通常以单一的5甲基化胞嘧啶位点形式存在，因此，如果设计的包含单个5-甲基化胞嘧啶的目标DNA是可行的，该方法将有能力检测胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)岛的5甲基化胞嘧啶位点和非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)区域的单5甲基化胞嘧啶位点。然后两组DNA探针(X和Y， X′和Y′)被设计为都可以识别目标DNA的序列。探针X、Y和目标DNA序列互补。探针Y在5′末端修饰磷酸基团，3′末端进行修饰磷硫酰化来避免外切酶I和 III消化。探针X′和Y′是X和Y探针的互补序列。探针Y′在5’末端被磷酸基团修饰，与X’连接后产生连接模板X′Y′。3′末端生物素修饰的捕获探针和5′末端 Cy5标记的报告探针是分别与X和Y完全和部分互补的探针，可以和XY产物杂交获得三明治产物。DNA甲基化进行检测之前需要先进行重亚硫酸盐处理，使胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶保持不变。
本发明涉及到三个循环(即循环a、b、c)。在循环a中，探针X和Y在5- 甲基化胞嘧啶旁边的位置进行杂交，然后再由热稳定连接酶连接可以获得产品 XY。热变性条件下，X和Y将反复和目标DNA杂交，在连接之后产生大量XY (方案1A)。在循环b中，从循环a中得到的产物XY可以作为探针X′和Y′的连接模板。同样，X′和Y′探针将与相邻的XY产品杂交，并在热变性条件下反复被热稳定连接酶连接来获得X′Y′产品(方案1A)。在循环c中、从循环b中获得的X′Y′产物可能作为新的模板在热稳定连接酶的作用下来连接探针X和Y。热变性后，将进一步产生大量的XY产物(方案1A)。重要的是，从循环c获得的 XY产物可以作为X′和Y′的连接模板在热变性条件下来诱导循环b和c，引发变性-杂交-连接的循环，最终导致三重连接酶链式反应(LCR)扩增(循环a、b、 c)，对XY产品生成指数扩增并且产生大量XY产物。随后，外切酶I和III被加入反应体系来消化过剩的探针X、X′、Y′和X′Y′探针，但探针Y由于在3′末端进行硫代修饰，能有效防止外切酶的消化，导致XY产品不被消化。
合成的XY产品可以和捕获探针和报告探针杂交获得生物素和Cy5标记的三明治杂交产物，杂交产物在特定的生物素-链霉亲和素相互作用下可以组装到 605量子点表面形成605量子点-寡核苷酸-cy5的纳米结构(方案1A)。由于在 605量子点-寡核苷酸-cy5的纳米结构中，605量子点和Cy5距离很近，从605 量子点供体到Cy5受体将发生高效的荧光共振能量转移(FRET)，导致Cy5荧光发射。通过基于全内反射荧光(TIRF)的单分子成像研究对Cy5分子进行简单的计数，可以准确地将DNA甲基化水平量化。相反，在没有DNA甲基化的情况下，在连接位点处鸟嘌呤-尿嘧啶发生错配导致没有连接反应的发生。因此， XY产物或者605量子点-寡核苷酸-cy5的纳米结构都不可以形成，没有荧光共振能量转移(FRET)，导致没有Cy5荧光发射(方案1B)。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)高灵敏度：本发明基于三步循环连接酶链式反应(LCR)扩增的高效率、基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测的高灵敏度，使得本发明试剂盒可以在单个5-甲基化胞嘧啶分辨率下进行DNA甲基化检测，检测限低至1阿摩尔每升，动态范围达到7个数量级，检测灵敏度和基于切割酶信号扩增的荧光实验相比提高了5个数量级，和基于超支化滚环扩增的荧光实验相比提高了2个数量级，和最近报道的基于连接的聚合酶链式反应(PCR)相比提高了20倍；
(2)高特异性：本发明试剂盒利用高保真热稳定连接酶介导的连接反应的高特异性，本实验可以区分混合物中甲基化水平为0.01％的样品；
(3)操作简单：本发明试剂盒在均相反应体系中进行反应，只是需要热稳定连接酶介导的单调连接反应，没有其他任何操作麻烦，简单、快速、方便；
(4)本发明试剂盒在胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)和非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点都可以进行DNA甲基化检测；不同于以往的DNA甲基化检测方法，不需要在特定区域设计多个5-甲基化胞嘧啶引物，也不需要为5-甲基化胞嘧啶位点设计特殊的限制性内切酶，因此在胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG) 和非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点都可以进行DNA甲基化检测。
(5)本发明试剂盒可以在单个癌细胞中定量，可以进一步扩展为在单个癌细胞中准确地确定DNA甲基化水平的诊断工具。
附图说明
图1：三步循环连接酶链式反应(LCR)介导的基于量子点的荧光共振能量转移(FRET)的DNA甲基化检测方案原理图。这种方法包括三个步骤：(1) 用亚硫酸氢钠将胞嘧啶DNA转换成尿嘧啶DNA，(2)DNA甲基化启动三步循环连接酶链式反应(LCR)扩增，包括循环a、b和c，(3)基于全内反射荧光(TIRF)的单分子成像进行基于量子点的荧光共振能量转移(FRET) 测量。
图2：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析反应产物。条带1是合成的甲基化DNA。条带2是DNA探针X和Y，X′和Y′。条带3是甲基化DNA存在时的反应产物。条带4是没有甲基化DNA存在时的反应产物。
图3：在没有甲基化DNA(对照，黑色曲线)和存在甲基化DNA(红色曲线)时 605量子点和Cy5荧光强度的变化。插图显示在没有甲基化DNA(对照)和存在甲基化DNA时Cy5荧光强度的变化。
图4：不同浓度的甲基化DNA荧光光谱的变化。插图显示随着DNA甲基化浓度的增加Cy5荧光强度的变化。
图5：Cy5荧光强度和甲基化DNA浓度的对数之间的线性关系。
图6：全内反射荧光(TIRF)的单分子成像分析。
图7：不同浓度的甲基化DNA产生Cy5点数的变化。Cy5点数和甲基化DNA浓度的对数从1×10-18到1×10-11摩尔每升呈线性相关。
图8：在甲基化和非甲基化DNA的混合物中，测量出的与实际输入的甲基化水平的相关性。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。
为了克服背景技术中介绍的现有技术在检测DNA甲基化中存在的诸多缺陷，本发明目的之一，提供一种DNA甲基化检测试剂盒。所述试剂盒包括亚硫酸氢钠、对苯二酚、脱盐柱、0.3摩尔每升的氢氧化钠、醋酸铵、乙醇、三氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、聚乙二醇辛基苯基醚、探针 X、探针Y、探针X′、探针Y′、核酸外切酶I、核酸外切酶III、10×NEBufferI、硫酸铵、Cy5标记的报告探针、生物素标记的捕获探针、热稳定连接酶和605量子点。
进一步，所述探针X、探针Y、探针X′和探针Y′的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。
进一步，探针Y在5′末端修饰磷酸基团，3′末端进行修饰磷硫酰化，探针Y′在5’末端进行磷酸基团修饰。
进一步，所述Cy5标记的报告探针为：5′-TGA CTC TGT GGA GTC CTG CC-3′，如SEQID NO.5所示，其中3’端第四个碱基T碱基上修饰Cy5荧光分子；生物素标记的捕获探针为：5′-CGA GAC TAG TCA GTA-3′，如SEQ ID NO.6所示，3′末端修饰生物素分子。
本发明目的之二，提供所述DNA甲基化检测试剂盒的使用方法，分为以下步骤：
(1)DNA亚硫酸氢盐处理，将待测DNA在42℃、0.35摩尔每升的氢氧化钠条件下变性30分钟后，进行亚硫酸氢钠反应，反应后利用脱盐柱进行DNA 回收，用0.3摩尔每升的氢氧化钠在37摄氏度反应15分钟完成修饰，然后用醋酸铵中和、乙醇沉淀和干燥，将DNA溶液超纯水中20℃保存、备用；
(2)三步循环连接酶链式反应；
(3)核酸外切酶I和核酸外切酶III处理：在三步循环连接酶链式反应(LCR) 结束后，在37℃条件下，50单位核酸外切酶I，50单位核酸外切酶III， 10×NEBufferI加入到反应混合物来消化探针X、X′、Y′和X′Y′30分钟，消化反应在90℃孵育10分钟以终止反应，将XY产品存储在4摄氏度；
(4)杂交反应：Cy5标记的报告探针、生物素标记的捕获探针和XY产品在缓冲溶液体系中室温下孵育20分钟获得三明治杂交产物；杂交反应后三明治产物通过生物素-链酶亲和素相互作用组装到605量子点表面来形成605量子点- 寡核苷酸-Cy5纳米结构。
进一步，步骤(1)亚硫酸氢钠反应方法为：将变性后的待测DNA加入到新鲜制备的3.2摩尔每升的亚硫酸氢钠和0.5毫摩尔每升对苯二酚混合液中50℃反应16～18小时。
进一步，步骤(2)三步循环连接酶链式反应，反应体系为：20毫摩尔每升 pH值为8.3的三氨基甲烷盐酸盐、25毫摩尔每升的氯化钾、10毫摩尔每升的氯化镁、0.5毫摩尔每升的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.01％聚乙二醇辛基苯基醚、 1微摩尔每升的探针X、1微摩尔每升的探针Y、1微摩尔每升的探针X′、1微摩尔每升的Y′探针和待测DNA，反应体系总体积为20微升；反应条件为：将上述反应体系95℃加热变性3分钟，然后在75℃加入2单位热稳定连接酶，紧接着在95℃反应1分钟后，然后在46摄氏度连接反应，在1分钟内热循环30次。
进一步，步骤(4)缓冲溶液体系包含100毫摩尔每升三氨基甲烷盐酸盐、 10毫摩尔每升硫酸铵和3毫摩尔每升氯化镁，缓冲液pH值为8.0。
本发明目的之三，提供所述DNA甲基化检测试剂盒的应用，所述试剂盒可用于在胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸和非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸位点进行DNA甲基化的检测。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
本发明所有寡核苷酸都是由生工生物工程有限公司(上海，中国)进行合成和高效液相色谱法纯化。热稳定连接酶是从中心技术(麦迪逊，WI，美国)购买，核酸外切酶I(ExoI)和核酸外切酶III(Exo III)是从新英格兰生物(伊普斯威奇、马萨诸塞州、美国)购买，氯化镁(MgCl2)、硫酸铵((NH4)2SO4)、牛血清白蛋白(BSA)、羧酸、葡萄糖氧化酶、D-葡萄糖和过氧化氢酶是从西格玛奥德里奇公司(圣路易斯,密苏里州,美国)获得。链霉亲和素包裹、最大发射波长为605纳米的量子点(Qdot 605ITK)从赛默飞世尔公司(尤金、俄勒冈、美国)购买。所有其它试剂均为分析级，不经进一步纯化即可使用。超纯水用微孔滤膜过滤系统(微孔，米尔福德，美国)制备。
实施例1一种DNA甲基化检测试剂盒
所述试剂盒包括：亚硫酸氢钠、对苯二酚、脱盐柱、0.3摩尔每升的氢氧化钠、醋酸铵、乙醇、三氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、聚乙二醇辛基苯基醚、探针X、探针Y、探针X′、探针Y′、核酸外切酶I、核酸外切酶III、10×NEBufferI、硫酸铵、Cy5标记的报告探针、生物素标记的捕获探针、热稳定连接酶和605量子点。
所述述探针X、探针Y、探针X′和探针Y′的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4 所示；探针Y在5′末端修饰磷酸基团，3′末端进行修饰磷硫酰化，探针Y′在5’末端进行磷酸基团修饰。
所述Cy5标记的报告探针为：5′-TGA CTC TGT GGA GTC CTG CC-3′，如 SEQ IDNO.5所示，其中3’端第四个碱基T碱基上修饰Cy5荧光分子；生物素标记的捕获探针为：5′-CGA GAC TAG TCA GTA-3′，如SEQ ID NO.6所示，3′末端修饰生物素分子。
实施例2所述DNA甲基化检测试剂盒的使用方法
所述DNA甲基化检测试剂盒的使用方法，分为以下步骤：
(1)DNA亚硫酸氢盐处理，将待测DNA在42℃、0.35摩尔每升的氢氧化钠条件下变性30分钟后，进行亚硫酸氢钠反应：将变性后的待测DNA加入到新鲜制备的3.2摩尔每升的亚硫酸氢钠和0.5毫摩尔每升对苯二酚混合液中50℃反应16～18小时；反应后利用脱盐柱进行DNA回收，用0.3摩尔每升的氢氧化钠在37摄氏度反应15分钟完成修饰，然后用醋酸铵中和、乙醇沉淀和干燥，将 DNA溶液超纯水中20℃保存、备用；
(2)三步循环连接酶链式反应，反应体系为：20毫摩尔每升pH值为8.3 的三氨基甲烷盐酸盐、25毫摩尔每升的氯化钾、10毫摩尔每升的氯化镁、0.5 毫摩尔每升的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.01％聚乙二醇辛基苯基醚、1微摩尔每升的探针X、1微摩尔每升的探针Y、1微摩尔每升的探针X′、1微摩尔每升的 Y′探针和待测DNA，反应体系总体积为20微升；反应条件为：将上述反应体系 95℃加热变性3分钟，然后在75℃加入2单位热稳定连接酶，紧接着在95℃反应1分钟后，然后在46摄氏度连接反应，在1分钟内热循环30次；
(3)核酸外切酶I和核酸外切酶III处理：在三步循环连接酶链式反应(LCR) 结束后，在37℃条件下，50单位核酸外切酶I，50单位核酸外切酶III， 10×NEBufferI加入到反应混合物来消化探针X、X′、Y′和X′Y′30分钟，消化反应在90℃孵育10分钟以终止反应，将XY产品存储在4摄氏度；
(4)杂交反应：Cy5标记的报告探针、生物素标记的捕获探针和XY产品在缓冲溶液体系中室温下孵育20分钟获得三明治杂交产物；杂交反应后三明治产物通过生物素-链酶亲和素相互作用组装到605量子点表面来形成605量子点- 寡核苷酸-Cy5纳米结构；所述缓冲溶液体系包含100毫摩尔每升三氨基甲烷盐酸盐、10毫摩尔每升硫酸铵和3毫摩尔每升氯化镁，缓冲液pH值为8.0。
试验例
1、原理的实验验证
该方法依赖于在甲基化DNA存在时DNA探针(X和Y，X′和Y′)连接成功来触发三步循环连接酶链式反应(LCR)扩增。为了探讨在循环热变性的条件下，是否单个5-甲基化胞嘧啶位点能诱导连接反应，我们用变性凝胶电泳分析连接产品。如图2所示，在10纳摩尔每升的含有一个5-甲基化胞嘧啶存在的目标 DNA中存在3个条带：46nt、32nt和15-17nt。46nt条带是甲基化的目标DNA (泳道1)，15-17nt条带代表没有连接的探针X和Y′(15nt)、X’和Y(17nt)(泳道2)，而32nt条带是连接的XY和X’Y’产物的特征带(泳道3)。而没有甲基化的目标DNA的情况下，只有46nt、15-17nt两条条带(泳道4)，但没有XY和X′Y′产物的特征带(32nt)，表明鸟嘌呤-尿嘧啶的单碱基错配不能诱导反应。结果表明：(1)甲基化DNA可成功诱导DNA探针连接；(2)单个5-甲基化胞嘧啶驱动的连接酶链式反应(LCR)可以展现完美的特异性(泳道4没有额外的条带)，这可能是热稳定连接酶对未甲基化的胞嘧啶产生的鸟嘌呤-尿嘧啶单碱基错配的连接存在高度敏感。为了进一步论证这一方法的可行性，我们增加了捕获探针、报告探头和链霉亲和素包裹的605量子点加入反应系统来监测605量子点和Cy5 荧光信号的变化(图3)。在对照实验中不加甲基化DNA(a曲线)，只有605量子点荧光信号被检测，但没有明显的Cy5荧光信号。而在甲基化DNA存在时(b 曲线)，可以同时检测到605量子点荧光强度降低和Cy5荧光强度增加。结果表明，单个5-甲基化胞嘧啶驱动的三步循环连接酶链式反应(LCR)最终产生大量 XY产物，从而形成605量子点-寡核苷酸-Cy5纳米结构，从605量子点供体到 Cy5受体生成高效荧光共振能量转移(FRET)。因此，凝胶电泳(图2)和荧光实验(图3)证明单个5-甲基化胞嘧啶能成功启动三步循环连接酶链式反应(LCR)扩增并诱导基于量子点的荧光共振能量转移(FRET)，表明该方法对单个5-甲基化胞嘧啶位点检测是可行的。
2、灵敏度实验
(1)为了监测605量子点供体和Cy5受体之间的荧光共振能量转移(FRET) 效率，我们在优化好的实验条件下检测不同浓度下的甲基化DNA产生的605量子点和Cy5的荧光强度。如图4所示，随着甲基化DNA浓度的增加，605量子点的荧光强度一直减小，而Cy5荧光强度相应增大。这表明随着甲基化DNA的增加，更多的探针X和Y将被连接，将产生更多的XY产物和三明治杂交产物，并被组装到605量子点表面形成量子点-寡核苷酸-Cy5的纳米结构。因此，更多的荧光能量将从605量子点供体转移到Cy5受体，证明由单个5-甲基化胞嘧啶驱动的三步循环连接酶链式反应(LCR)扩增形成的量子点-寡核苷酸-Cy5纳米结构导致高效的共振转移发生。此外，Cy5荧光强度和甲基化DNA浓度的对数在1×10-17到1×10-11摩尔每升范围内存在良好的线性相关性(图5)。相应的方程如下：F＝70.0+2.0log10C(R2＝0.9842)，其中F代表Cy5荧光强度，C 表示甲基化DNA的浓度。检测限为1×10-17摩尔每升。上述荧光实验表明单个 5-甲基化胞嘧啶的存在可以使605量子点-寡核苷酸-Cy5纳米结构产生强烈的荧光共振能量转移(FRET)，并且Cy5荧光信号可用于该方法的DNA甲基化检测。
(2)通过基于全内反射荧光(TIRF)的单分子成像来研究本实验检测的灵敏度，如图6所示，在对照组中可以检测到605量子点供体的绿色荧光信号，但从Cy5受体处没有观察到红色荧光信号，并且没有共存的605量子点和Cy5黄色荧光信号，这表明直接激发Cy5受体或者由605量子点供体发射泄漏到Cy5 受体很难。相反，甲基化DNA存在时，605量子点和Cy5同时检测得到了荧光信号(图6D和E)。此外，图6F显示出强烈的黄色，说明了605量子点和Cy5 的完美共存。以上结果表明，(1)605量子点和Cy5之间可以发生强烈的荧光共振能量转移(FRET)；(2)获得近零背景Cy5荧光信号(对照组，图6B)。我们在不同浓度的甲基化DNA下测量Cy5计数的变化(图7)。当甲基化DNA浓度增加时，更多的X和Y DNA探针将被连接来诱导后续的三步循环连接酶链式反应(LCR)扩增，最终产生大量XY产物。然后更多的捕获探针和报告探针与 XY杂交产生更多三明治杂交产物，从而更多的Cy5标记的报告探针将被组装到605量子点表面，导致Cy5数量相应地从1×10-18到1×10-11摩尔每升增加。值得注意的是，Cy5数量的对数显示甲基化DNA浓度从1×10-18到1×10-11摩尔每升 7个数量级的范围内线性关系良好，比荧光测量宽一个数量级(图5)。回归方程为N＝369.4+20.3log10C，相关系数为0.9931，N代表点Cy5数量，C代表甲基化DNA浓度(摩尔每升)。本方法的检测限进一步确定为1×10-18摩尔每升，这比荧光测量灵敏度高10倍(图5)，表明基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测比在相同实验条件下的荧光检测更敏感。更重要的是，本方法的检测灵敏度和基于切口酶信号放大(NESA)的荧光方法相比提升了5个数量级，和超支化滚环扩增(HRCA)相比提高了2个数量级。此外，它还与最近报道的依赖连接的聚合酶链式反应(PCR)方法相比灵敏度提高了20倍。这样的极高灵敏度可以归因于以下三个因素：高保真连接酶介导的连接反应的高度特异性、三重连接酶链式反应(LCR)高扩增效率、基于全内反射荧光(TIRF)单分子检测的高灵敏度。
3、特异性实验
甲基化和非甲基化的DNA混合成不同比例来准备一系列人造混合物对 DNA甲基化水平进行分析。如图8所示，随着甲基化DNA在混合物中逐渐增多，更多的探针X和Y被连接来启动三步循环连接酶链式反应(LCR)扩增，导致大量的XY产物产生。因此，更多的605量子点-寡核苷酸-Cy5纳米结构形成，从而产生从605量子点供体到Cy5受体的高效荧光共振能量转移(FRET)。因此，该605量子点荧光信号相应减少。并且随着甲基化DNA在混合物中比例的增加，Cy5的数量呈现增加趋势，说明无论多少未甲基化的DNA加入到混合物，混合物中的DNA甲基化水平都是可以准确量化的，表明该方法具有良好的特异性。此外，测定的甲基化水平与实际输入的甲基化水平之间还具有线性关系，回归方程为Y＝1.047X–0.001，相关系数为0.9966，其中Y和X是测得的甲基化水平(％)和输入的甲基化水平(％)。值得注意的是，这种方法甚至可以区分 0.01％甲基化水平的样品，这优于以前报道的DNA甲基化的检测方法，包括甲基化特异性的基于量子点的荧光共振能量转移(MS-qFRET)(1％)、甲基化特异性聚合酶链式反应(MS-PCR)(0.1％)和基于切口酶信号扩增(NESA)(0.1％) 的方法。原因可以归因于：一个可以区分单个碱基的高保真连接酶、三步循环连接酶链式反应(LCR)的高特异性、外切酶I和III催化的高消化效率、基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测的高信噪比。因此，该方法可应用于DNA甲基化检测，具有良好的特异性。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种DNA甲基化检测试剂盒及其使用方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tactgactag tctcg 15
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgcaggactc cacagag 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctctgtggag tcctgca 17
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgagactagt cagta 15
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgactctgtg gagtcctgcc 20
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgagactagt cagta 15

Claims (9)

1.一种DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括亚硫酸氢钠、对苯二酚、脱盐柱、0.3摩尔每升的氢氧化钠、醋酸铵、乙醇、三氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、聚乙二醇辛基苯基醚、探针X、探针Y、探针X′、探针Y′、核酸外切酶I、核酸外切酶III、10×NEBufferI、硫酸铵、Cy5标记的报告探针、生物素标记的捕获探针、热稳定连接酶和605量子点。
2.根据权利要求1所述DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述探针X、探针Y、探针X′和探针Y′的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。
3.根据权利要求2所述DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，探针Y在5′末端修饰磷酸基团，3′末端进行修饰磷硫酰化，探针Y′在5’末端进行磷酸基团修饰。
4.根据权利要求1所述DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述Cy5标记的报告探针为：5′-TGA CTC TGT GGA GTC CTG CC-3′，如SEQ ID NO.5所示，其中3’端第四个碱基T碱基上修饰Cy5荧光分子；生物素标记的捕获探针为：
5′-CGA GAC TAG TCA GTA-3′，如SEQ ID NO.6所示，3′末端修饰生物素分子。
5.根据权利要求1-4任一所述DNA甲基化检测试剂盒的使用方法，其特征在于，分为以下步骤：
(1)DNA亚硫酸氢盐处理，将待测DNA在42℃、0.35摩尔每升的氢氧化钠条件下变性30分钟后，进行亚硫酸氢钠反应，反应后利用脱盐柱进行DNA回收，用0.3摩尔每升的氢氧化钠在37摄氏度反应15分钟完成修饰，然后用醋酸铵中和、乙醇沉淀和干燥，将DNA溶液超纯水中20℃保存、备用；
(2)三步循环连接酶链式反应；
(3)核酸外切酶I和核酸外切酶III处理：在三步循环连接酶链式反应(LCR)结束后，在37℃条件下，50单位核酸外切酶I，50单位核酸外切酶III，
10×NEBufferI加入到反应混合物来消化探针X、X′、Y′和X′Y′30分钟，消化反应在90℃孵育10分钟以终止反应，将XY产品存储在4摄氏度；
(4)杂交反应：Cy5标记的报告探针、生物素标记的捕获探针和XY产品在缓冲溶液体系中室温下孵育20分钟获得三明治杂交产物；杂交反应后三明治产物通过生物素-链酶亲和素相互作用组装到605量子点表面来形成605量子点-寡核苷酸-Cy5纳米结构。
6.根据权利要求5所述DNA甲基化检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(1)亚硫酸氢钠反应方法为：将变性后的待测DNA加入到新鲜制备的3.2摩尔每升的亚硫酸氢钠和0.5毫摩尔每升对苯二酚混合液中50℃反应16～18小时。
7.根据权利要求5所述DNA甲基化检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(2)三步循环连接酶链式反应，反应体系为：20毫摩尔每升pH值为8.3的三氨基甲烷盐酸盐、25毫摩尔每升的氯化钾、10毫摩尔每升的氯化镁、0.5毫摩尔每升的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.01％聚乙二醇辛基苯基醚、1微摩尔每升的探针X、1微摩尔每升的探针Y、1微摩尔每升的探针X′、1微摩尔每升的Y′探针和待测DNA，反应体系总体积为20微升；反应条件为：将上述反应体系95℃加热变性3分钟，然后在75℃加入2单位热稳定连接酶，紧接着在95℃反应1分钟后，然后在46摄氏度连接反应，在1分钟内热循环30次。
8.根据权利要求5所述DNA甲基化检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(4)缓冲溶液体系包含100毫摩尔每升三氨基甲烷盐酸盐、10毫摩尔每升硫酸铵和3毫摩尔每升氯化镁，缓冲液pH值为8.0。
9.根据权利要求1-4任一所述DNA甲基化检测试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒可用于在胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸和非胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸位点进行DNA甲基化的检测。
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