CN106995840A - 一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的方法 - Google Patents

一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶dna糖基化酶活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法，通过由胸腺嘧啶DNA糖基化酶引发、酶修复辅助的循环滚环指数扩增和核酸内切酶Ⅳ催化介导的循环切割实现实时检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的荧光方法；由于尿嘧啶切除辅助的循环滚环扩增和基于核酸内切酶Ⅳ的循环切割效率都很高，且尿嘧啶介导的指数扩增能极大地抑制非特异性扩增，因此该方法的检测灵敏度很高，经检测，所述方法对胸腺嘧啶DNA糖基化酶的检测下限可达5.6×10‑7U/μL；同时，本发明利用胸腺嘧啶DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的自身修复特性，使整个修复反应严格按照自然修复机制进行，因此本方案的特异性很高。

Description

一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶 DNA糖基化酶活性的方法
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法。
背景技术
胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)是体内碱基切除修复(BER)路径中非常重要的起始酶。在受损的基因组DNA中，其能特异性识别鸟嘌呤/胸腺嘧啶(G/T)和鸟嘌呤/尿嘧啶(G/U)的错配碱基对，并切除错配碱基胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。在DNA脱甲基化反应过程中，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)同样扮演着重要的角色。通过脱氨基-碱基切除修复反应，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)能高效地切除由十-十一转位(ten–eleven translocation，TETs)酶氧化5-甲基胞嘧啶(5mC)所产生的5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。另外，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)还可以以配体依赖性方式与核受体(视黄酸受体(RAR)和类视黄醇x受体(RXR))相互作用，调节基因的表达。根据现有文献报道，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)的异常表达会直接扰乱基因组DNA的修复、稳定的表观遗传以及正常的转录调节，从而引发包括癌症在内的多种疾病。因此，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性的超灵敏检测不仅对基础生物化学的深入研究有很大帮助，而且对发展人类疾病新的治疗策略有重大意义。
迄今为止，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性的检测方法仍然很少，其中凝胶电泳法是最普遍的方法，但是该方法存在检测灵敏度低、放射性污染、耗时较长等缺点。近年来，发展出了一些新的检测方法如荧光分析法和电化学分析法。通常在荧光分析法中，设计一对相距很近的荧光和淬灭分子，当胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)存在时，淬灭分子被释放，导致荧光分子发出荧光，最终通过检测荧光信号对酶活性进行定量分析；在电化学分析法中，有报道指出由DNA-量子点(QDs)聚合物超晶格结构的协助可以实现对目标检测物的三步信号放大，然而上述方法均存在灵敏度提高有限的问题。因此，发展一种新的方法用于快速、灵敏、特异性检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性是目前亟待解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提出一种检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性的方法，该方法采用循环酶修复介导的双信号放大策略，具有灵敏度高、特异性好等优点。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
首先，本发明提供一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)待测胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)诱导的胸腺嘧啶切除修复：双链DNA底物中加入待测胸腺嘧啶DNA糖基化酶、核酸内切酶IV(Endo IV)、尿嘧啶DNA糖基化酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿苷三磷酸和DNA聚合酶；所述双链DNA其中一条为环形模板DNA，另一条为线性探针，所述环形模板DNA与线性探针的部分序列杂交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶的双链DNA底物；杂交区域内线性探针上设计有且仅有一个错配的胸腺嘧啶；通过胸腺嘧啶DNA糖基化酶特异性地切割脱氧核糖和胸腺嘧啶之间的N-糖苷键，从而剪切掉线性DNA探针上错配的胸腺嘧啶，产生一个脱碱基(AP)位点；然后核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)将对脱碱基(AP)位点进行剪切，从而导致线性探针3’端部分序列的断裂；
(2)尿嘧啶切除辅助的循环滚环扩增：在四种核苷酸(脱氧腺苷三磷酸，脱氧鸟苷三磷酸，脱氧胞苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸)和聚合酶存在条件下，被切断的线性探针作为引物引发滚环扩增反应，产生包含尿嘧啶(U)核苷酸的长片段重复序列；而后在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)协助下，尿嘧啶被特异性切除，同时产生一个带羟基的3’末端以确保新的聚合延伸的循环；持续的聚合和尿嘧啶切除过程导致大量报告序列的生成；产生的报告序列随后与剩余的环形模板DNA结合以引发新一轮的聚合和尿嘧啶切除反应循环，最终生成大量的报告序列；
(3)核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)介导的信号探针循环切割以及荧光分子的释放：加入信号探针，所述信号探针为荧光标记探针，所述信号探针上设计有且仅有一个四氢呋喃的无嘧啶(TAP)位点，所述信号探针与报告序列结合，引发核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)介导的信号探针上的四氢呋喃的无嘧啶(TAP)位点的循环切割，最终产生放大的荧光信号，对荧光信号进行检测，定量分析胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性。
本发明所述检测方法的原理为：本方法是基于循环酶修复介导的双信号放大实时监测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的荧光方法，首先线性探针与环形模板杂交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)的底物，当胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)存在时，其将特异性地切割脱氧核糖和胸腺嘧啶之间的N-糖苷键，从而剪切掉线性探针上错配的胸腺嘧啶，产生一个脱碱基(AP)位点。然后核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)将对脱碱基(AP)位点进行剪切，从而导致线性探针3’端部分序列的断裂。在四种核苷酸(脱氧腺苷三磷酸，脱氧鸟苷三磷酸，脱氧胞苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸)和聚合酶存在下，切断的线性探针作为引物引发滚环扩增反应，生成包含尿嘧啶(U)核苷酸的长片段重复序列。在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)合作下，长片段重复序列上的尿嘧啶被切除，并生成带羟基的3’末端，以进行新的聚合延伸反应。持续的聚合和尿嘧啶的修复导致产物报告序列的线性扩增。新生成的报告序列随后又可以与剩余的环形模板结合引发新的聚合和尿嘧啶切除反应的循环，最终生成大量的报告序列。加入信号探针，其与报告序列结合，在核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)作用下，对信号探针上的四氢呋喃的无嘧啶(TAP)位点进行循环切割，最终产生扩大的荧光信号，从而实现对胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的定量分析。
其中，本发明所述线性探针的长度为32nt，所述线性探针的碱基序列为5’-GAAGGC GGG CGA CAG TGC AAC GAA GAA AAA AX-3’，其中T为所述线性探针中的错配碱基胸腺嘧啶；X为2'，3'-二脱氧胞苷，用于抑制非特异性扩增；
所述环形模板DNA由线性锁式探针和连接探针经过连接酶连接，外切酶消化，纯化后所得；
具体的，所述线性锁式探针的长度为57nt，所述线性锁式探针的碱基序列为5’-P-CTG TCG CGT TGC TTC GAT TGC TGC GTC CCT TCC CGC CCT GCC CTT CTC TTC CGC CCG-3’；其中5’端的P为修饰的磷酸基团；
所述连接探针的长度为17nt，所述连接探针的碱基序列为5’-GAA GGC GGG CGACAG CG-3’；
所述信号探针的长度为26nt，所述信号探针的碱基序为5’-TGC TGC GTC CCT-FAM-TCC CXC CCT-BHQ1-GCC CT-3’，其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；X代表四氢呋喃无碱基位点；
优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶具有较强的热稳定性和链置换活性，是进行滚环扩增的良好酶源选择；
优选的，采用荧光分光光度计对荧光信号进行检测分析。
本发明所述检测方法，对胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)的检测下限可达5.6×10-7U/μL，所述灵敏度是通过该方法各个步骤和过程逐渐累积和配合达到的。
其次，本发明还提供一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括：双链DNA底物，核酸内切酶IV(Endo IV)、尿嘧啶DNA糖基化酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿苷三磷酸、DNA聚合酶、信号探针，其中所述双链DNA其中一条为环形模板DNA，另一条为线性探针，所述环形模板DNA与线性探针的部分序列杂交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶的双链DNA底物；杂交区域内线性探针上设计有且仅有一个错配的胸腺嘧啶；
其中，本发明所述线性探针的长度为32nt，所述线性探针的碱基序列为5’-GAAGGC GGG CGA CAG TGC AAC GAA GAA AAA AX-3’，其中T为所述线性探针中的错配碱基胸腺嘧啶；X为2'，3'-二脱氧胞苷，用于抑制非特异性扩增；
所述环形模板DNA由线性锁式探针和连接探针经过连接酶连接，外切酶消化，纯化后所得；
具体的，所述线性锁式探针的长度为57nt，所述线性锁式探针的碱基序列为5’-P-CTG TCG CGT TGC TTC GAT TGC TGC GTC CCT TCC CGC CCT GCC CTT CTC TTC CGC CCG-3’；其中5’端的P为修饰的磷酸基团；
所述连接探针的长度为17nt，所述连接探针的碱基序列为5’-GAA GGC GGG CGACAG CG-3’；
所述信号探针的长度为26nt，所述信号探针的碱基序为5’-TGC TGC GTC CCT-FAM-TCC CXC CCT-BHQ1-GCC CT-3’，其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；X代表四氢呋喃无碱基位点；
优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；
优选的，所述试剂盒还包括细胞裂解缓冲液，所述细胞裂解缓冲液包括10毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 8.0)，150毫摩尔每升的氯化钠，1％(质量/体积)的乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，0.25毫摩尔每升的脱氧胆酸钠，1％(质量/体积)的甘油，0.1毫摩尔每升的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐；
优选的，所述试剂盒还包括所述胸腺嘧啶DNA糖基化酶、尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、核酸内切酶IV和DNA聚合酶的缓冲体系；
此外，所述试剂盒在检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶中的用途也是本发明的目的之一。
本发明的有益效果：
本发明设计了一种新的设计思路用于检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法，通过由胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)引发、酶修复辅助的循环滚环指数扩增和核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)催化介导的循环切割实现实时检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性的荧光方法；由于尿嘧啶切除辅助的循环滚环扩增和基于核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)的循环切割效率都很高，且尿嘧啶介导的指数扩增能极大地抑制非特异性扩增，因此该方法的检测灵敏度很高，经检测，所述方法对胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)的检测下限可达5.6×10-7U/μL；同时，本发明利用胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的自身修复特性，使整个修复反应严格按照自然修复机制进行，因此本方案的特异性很高。另外，我们对本方案中的各反应条件也都进行了细致优化，因此在修复反应过程中，大大降低了非特异性反应。因此，本发明技术方案极具推广应用之价值。
附图说明
图1：本发明基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法原理。
图2：体外胸腺嘧啶DNA糖基化酶介导的碱基切除修复过程的验证；其中，图2(A)为反应产物的琼脂糖凝胶电泳检测分析，其中泳道M是DNA Marker标记；泳道1和2分别代表存在和不存在胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)时的扩增产物；图2(B)为实时荧光监测酶修复介导的循环双信号放大反应，在存在和不存在胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)时分别得到的曲线图；其中胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)浓度是0.01单位每微升。
图3：(A)针对不同胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)浓度的实时荧光强度检测；(B)不同胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)浓度下荧光强度的变化；插图表示荧光强度和胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)浓度对数值之间的线性关系。误差线代表三次重复实验的标准偏差。
图4：针对对照组(反应溶液)，0.01克每升牛血清白蛋白(BSA)、0.01单位每微升人类8-羟基脱氧鸟嘌呤-DNA糖基化酶(hOGG1)和0.01单位每微升胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)条件下荧光强度的变化图；误差线表示三组独立实验的标准偏差。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中对检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性的方法普遍存在检测灵敏度低、放射性污染、耗时较长等缺点。
有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)待测胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)诱导的胸腺嘧啶切除修复：双链DNA底物中加入待测胸腺嘧啶DNA糖基化酶、核酸内切酶IV(Endo IV)、尿嘧啶DNA糖基化酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿苷三磷酸和DNA聚合酶；所述双链DNA其中一条为环形模板DNA，另一条为线性探针，所述环形模板DNA与线性探针的部分序列杂交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶的双链DNA底物；杂交区域内线性探针上设计有且仅有一个错配的胸腺嘧啶；通过胸腺嘧啶DNA糖基化酶特异性地切割脱氧核糖和胸腺嘧啶之间的N-糖苷键，从而剪切掉线性DNA探针上错配的胸腺嘧啶，产生一个脱碱基(AP)位点；然后核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)将对脱碱基(AP)位点进行剪切，从而导致线性探针3’端部分序列的断裂；
(2)尿嘧啶切除辅助的循环滚环扩增：在四种核苷酸(脱氧腺苷三磷酸，脱氧鸟苷三磷酸，脱氧胞苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸)和聚合酶存在条件下，被切断的线性探针作为引物引发滚环扩增反应，产生包含尿嘧啶(U)核苷酸的长片段重复序列；而后在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)协助下，尿嘧啶被特异性切除，同时产生一个带羟基的3’末端以确保新的聚合延伸的循环；持续的聚合和尿嘧啶切除过程导致大量报告序列的生成；产生的报告序列随后与剩余的环形模板结合以引发新一轮的聚合和尿嘧啶切除反应循环，最终生成大量的报告序列；
(3)核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)介导的信号探针循环切割以及荧光分子的释放：加入信号探针，所述信号探针为荧光标记探针，所述信号探针上设计有且仅有一个四氢呋喃的无嘧啶(TAP)位点，所述信号探针与报告序列结合，引发核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)介导的信号探针上的四氢呋喃的无嘧啶(TAP)位点的循环切割，最终产生放大的荧光信号，对荧光信号进行检测，定量分析胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性。
其中，本发明所述线性探针的长度为32nt，所述线性探针的碱基序列为5’-GAAGGC GGG CGA CAG TGC AAC GAA GAA AAA AX-3’，其中T为所述线性探针中的错配碱基胸腺嘧啶；X为2'，3'-二脱氧胞苷，用于抑制非特异性扩增；
所述环形模板DNA由线性锁式探针和连接探针经过连接酶连接，外切酶消化，纯化后所得；
具体的，所述线性锁式探针的长度为57nt，所述线性锁式探针的碱基序列为5’-P-CTG TCG CGT TGC TTC GAT TGC TGC GTC CCT TCC CGC CCT GCC CTT CTC TTC CGC CCG-3’；其中5’端的P为修饰的磷酸基团；其中斜体标记的序列即为与连接探针的互补结合序列；
所述连接探针的长度为17nt，所述连接探针的碱基序列为5’-GAA GGC GGG CGACAG CG-3’；
所述信号探针的长度为26nt，所述信号探针的碱基序为5’-TGC TGC GTC CCT-FAM-TCC CXC CCT-BHQ1-GCC CT-3’，其中FAM为荧光报告基团，修饰于距离5’端第13个碱基(T碱基)上，BHQ1为荧光淬灭基团，修饰于距离3’端第6个碱基(T碱基)上；X代表四氢呋喃无碱基位点；
本发明的又一典型实施方式中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶具有较强的热稳定性和链置换活性，是进行滚环扩增的良好酶源选择；
本发明的又一典型实施方式中，采用荧光分光光度计对荧光信号进行检测分析
本发明所述检测方法，对胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)的检测下限可达5.6×10-7U/μL，所述灵敏度是通过该方法各个步骤和过程逐渐累积和配合达到的。
本发明的又一典型实施方式中，提供一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括：双链DNA底物，核酸内切酶IV(Endo IV)、尿嘧啶DNA糖基化酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿苷三磷酸、DNA聚合酶、信号探针，其中所述双链DNA其中一条为环形模板DNA，另一条为线性探针，所述环形模板DNA与线性探针的部分序列杂交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶的双链DNA底物；杂交区域内线性探针上设计有且仅有一个错配的胸腺嘧啶；
其中，本发明所述线性探针的长度为32nt，所述线性探针的碱基序列为5’-GAAGGC GGG CGA CAG TGC AAC GAA GAA AAA AX-3’，其中T为所述线性探针中的错配碱基胸腺嘧啶；X为2'，3'-二脱氧胞苷，用于抑制非特异性扩增；
所述环形模板DNA由线性锁式探针和连接探针经过连接酶连接，外切酶消化，纯化后所得；
具体的，所述线性锁式探针的长度为57nt，所述线性锁式探针的碱基序列为5’-P-CTG TCG CGT TGC TTC GAT TGC TGC GTC CCT TCC CGC CCT GCC CTT CTC TTC CGC CCG-3’；其中5’端的P为修饰的磷酸基团；其中斜体标记的序列即为与连接探针的互补结合序列；
所述连接探针的长度为17nt，所述连接探针的碱基序列为5’-GAA GGC GGG CGACAG CG-3’；
所述信号探针的长度为26nt，所述信号探针的碱基序为5’-TGC TGC GTC CCT-FAM-TCC CXC CCT-BHQ1-GCC CT-3’，其中FAM为荧光报告基团，修饰于距离5’端第13个碱基(T碱基)上，BHQ1为荧光淬灭基团，修饰于距离3’端第6个碱基(T碱基)上；X代表四氢呋喃无碱基位点；
所述试剂盒还包括细胞裂解缓冲液，所述细胞裂解缓冲液包括10毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 8.0)，150毫摩尔每升的氯化钠，1％(质量/体积)的乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，0.25毫摩尔每升的脱氧胆酸钠，1％(质量/体积)的甘油，0.1毫摩尔每升的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐；
所述试剂盒还包括所述胸腺嘧啶DNA糖基化酶、尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、核酸内切酶IV和DNA聚合酶的缓冲体系；
本发明的又一典型实施方式中，提供所述试剂盒在检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶中的应用。
下面结合实施例做进一步具体说明。
实施例1
环形模板DNA的制备：将连接探针和线性锁式探针用1×三(羟甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)缓冲液稀释至10微摩尔每升，并在95摄氏度变性5分钟。然后分别将2微升的连接探针和线性锁式探针加入到20微升的连接缓冲液中，包括1×T4连接酶缓冲液(6.6毫摩尔每升的氯化镁，10毫摩尔每升的二硫苏糖醇，0.1毫摩尔每升的三磷酸腺苷，66毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 7.6))，50个单位的T4DNA连接酶，在16摄氏度温育过夜。连接反应后，将10微升的连接产物转移到10微升的消化缓冲液中，包括1毫摩尔每升的二硫苏糖醇，6.7毫摩尔每升的氯化镁，67毫摩尔每升的甘氨酸-氢氧化钾(pH 9.5)，10个单位的核酸外切酶I和20个单位的核酸外切酶III，在37摄氏度温育2小时，然后在95摄氏度灭活10分钟，所得的消化产物通过来自大连宝生物公司(TakaraBiotechnology Co.，Ltd.(Dalian，China))的试剂盒(Dr.GenTLE PrecipitationCarrier9094)进行进一步的纯化即得。
实施例2
细胞裂解缓冲液准备：10毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.0)，150毫摩尔每升的氯化钠，1％(质量/体积)的乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，0.25毫摩尔每升的脱氧胆酸钠，1％(质量/体积)的甘油，0.1毫摩尔每升的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐。
细胞提取物准备：人类子宫颈癌细胞(HeLa)和人类乳腺癌细胞(MCF-7)培养基为含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，放在含有5％二氧化碳，37摄氏度的培养箱中进行培养。待细胞长到对数生长期时，用胰酶将其消化下来，并用冰磷酸盐缓冲液(137毫摩尔氯化钠溶液，2.7毫摩尔氯化钾溶液，10毫摩尔磷酸盐缓冲液，pH 7.4)洗涤两遍，然后4摄氏度、800转每分钟离心。使细胞悬浮在100微升的裂解缓冲液中、于冰上裂解30分钟并且每隔5分钟涡旋30秒，裂解后细胞碎片在4摄氏度以12000转每分钟离心20分钟。最后将上清液转移至干净的离心管中，并立即进行胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)活性的测定。
酶修复介导的循环双信号放大反应：胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)实验涉及两个连续的步骤。第一步先将线性探针稀释到100纳摩尔，随后将2微升线性探针加到20微升切除缓冲液中，包含1×NEB缓冲液4(NEBuffer 4)，50纳摩尔的环形模板DNA和2个单位胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)，将混合溶液在60摄氏度孵育50分钟。第二步，将2微升切除产物加到50微升扩增反应混合物中，包含500微摩尔的脱氧核糖核苷酸(脱氧腺苷三磷酸,脱氧尿苷三磷酸,脱氧鸟苷三磷酸,脱氧胞苷三磷酸)，5个单位的Bst DNA聚合酶，10个单位尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)，20个单位内切酶Ⅳ(大肠杆菌核酸内切酶IV)，5微升10×ThermoPol缓冲液，5微升10×尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)缓冲液，5微升10×NEB缓冲液3(NEBuffer 3)，900纳摩尔信号探针，将混合物在37摄氏度孵育50分钟。
荧光光谱测量：将25微升的反应产物用灭菌水稀释至60微升，用荧光分光光度计在室温下进行荧光光谱的测定。
实验原理(如图1)：
本方案方案主要涉及三个步骤：(1)胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)诱导的胸腺嘧啶切除修复反应，(2)尿嘧啶切除辅助的循环滚环扩增过程，(3)核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)介导的信号探针的循环切割及荧光分子的释放。首先，线性探针的部分序列与环形模板杂交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)的DNA底物。当胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)存在时，切割脱氧核糖和胸腺嘧啶之间的N-糖苷键以特异性切除线性探针上错配的胸腺嘧啶，并同时产生一个脱碱基(AP)位点。核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)对该脱碱基(AP)位点进行催化剪切，最终导致线性探针3’端序列的断裂。在四种核苷酸(脱氧腺苷三磷酸，脱氧鸟苷三磷酸，脱氧胞苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸)和聚合酶存在条件下，被切断的线性探针将作为引物引发滚环扩增反应，产生包含尿嘧啶(U)核苷酸的长片段重复序列。在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)协助下，尿嘧啶被特异性切除，同时产生一个带羟基的3’末端以确保新的聚合延伸的循环。持续的聚合和尿嘧啶切除反应将导致大量报告序列的生成。该报告序列与剩余的环形模板结合引发新的聚合和尿嘧啶切除反应的循环，最终生成大量的报告序列。加入信号探针，其与报告序列杂交，引发核酸内切酶Ⅳ(Endo IV)介导的信号探针上的四氢呋喃的无嘧啶(TAP)位点的循环切割，最终产生放大的荧光信号。
实施例3
3.1原理的实验验证
为了验证本方案的可行性，我们对反应产物进行了检测分析，用以SYBR Gold作为指示剂的1％琼脂糖凝胶电泳进行验证分析。从图2(A)可看出，有胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)时，可以看到反应产物的特征条带，不加胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)时，没有特征条带出现。这是因为胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)能够将错配的胸腺嘧啶切除，并且启动随后的尿嘧啶切除介导的循环滚环指数扩增。为了证明酶修复介导的双信号放大反应，我们加入信号探针后实时荧光检测反应过程。如图2(B)所示，在胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)存在时，反应前10分钟荧光强度快速增加，超过10分钟后到达了平台期，展示出典型的双曲线(黑色曲线)。结果表明胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)能够特异性地从鸟嘌呤/胸腺嘧啶错配碱基对上切下胸腺嘧啶从而引起修复酶辅助的双重扩增反应。相反，在胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)不存在时，几乎没有荧光信号出现(灰色曲线)；这是因为：(1)尿嘧啶能够被尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)引发的碱基切除修复精确地切除；(2)尿嘧啶核苷酸能够取代传统的限制性内切酶识别序列而避免无模板时双链DNA的错配延伸，并且能避免由错配形成的非特异性扩增。因此，以上的结果明确证实了本方案的可行性。
3.2灵敏度实验
本实验通过监测不同浓度下胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)荧光强度的变化来检测灵敏度，图3(A)展示的是不同浓度胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)的实时荧光曲线。在胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)浓度增加时，荧光强度随着逐渐上升并在20分钟内达到平台期。这结果表明本实验扩增效率很高，并且可以在短时间内获得大大增强的荧光信号。正如图3(B)所示，胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)浓度从1×10-6单位每微升到1×10-3单位每微升，荧光强度持续增加并且和胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)浓度的对数值线性相关。根据标准偏差超过对照信号3倍的准则，计算出检测限是5.6×10-7单位每微升。检测限如此之低，说明本方法具有很高的检测灵敏度。
3.3特异性实验
如图4所示，牛血清白蛋白(BSA)和人类8-羟基脱氧鸟嘌呤-DNA糖基化酶(hOGG1)被用作本实验的干扰物质。牛血清白蛋白(BSA)是一个与本实验不相关的蛋白，人类8-羟基脱氧鸟嘌呤-DNA糖基化酶(hOGG1)是对8-羟基脱氧鸟嘌呤存在特异性的糖基化酶，可以通过碱基切除修复过程来修复氧化的鸟嘌呤。在同一条件下，在牛血清白蛋白(BSA)和人类8-羟基脱氧鸟嘌呤-DNA糖基化酶(hOGG1)存在时只有很低的背景，这和只有反应溶液的对照组很相似。相反，在胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)存在时，荧光信号值非常高，结果表明牛血清白蛋白(BSA)和人类8-羟基脱氧鸟嘌呤-DNA糖基化酶(hOGG1)都不能切割错配的胸腺嘧啶并引发酶修复介导的双信号放大，不会产生荧光信号。因此，本实验方法有很高的特异性，为在复杂样品中进行检测提供了可能。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)待测胸腺嘧啶DNA糖基化酶诱导的胸腺嘧啶切除修复：双链DNA底物中加入待测胸腺嘧啶DNA糖基化酶、核酸内切酶IV、尿嘧啶DNA糖基化酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿苷三磷酸和DNA聚合酶；所述双链DNA其中一条为环形模板DNA，另一条为线性探针，所述环形模板DNA与线性探针的部分序列杂交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶的双链DNA底物；杂交区域内线性探针上设计有且仅有一个错配的胸腺嘧啶；通过胸腺嘧啶DNA糖基化酶特异性地切割脱氧核糖和胸腺嘧啶之间的N-糖苷键，从而剪切掉线性DNA探针上错配的胸腺嘧啶，产生一个脱碱基位点；然后核酸内切酶Ⅳ将对脱碱基位点进行剪切，从而导致线性探针3’端部分序列的断裂；
(2)尿嘧啶切除辅助的循环滚环扩增：在脱氧腺苷三磷酸，脱氧鸟苷三磷酸，脱氧胞苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸和聚合酶存在条件下，被切断的线性探针作为引物引发滚环扩增反应，产生包含尿嘧啶核苷酸的长片段重复序列；而后在尿嘧啶DNA糖基化酶和核酸内切酶Ⅳ协助下，尿嘧啶被特异性切除，同时产生一个带羟基的3’末端以确保新的聚合延伸的循环；持续的聚合和尿嘧啶切除过程导致大量报告序列的生成；产生的报告序列随后与剩余的环形模板DNA结合以引发新一轮的聚合和尿嘧啶切除反应循环，最终生成大量报告序列；
(3)核酸内切酶Ⅳ介导的信号探针循环切割以及荧光分子的释放：加入信号探针，所述信号探针为荧光标记探针，所述信号探针上设计有且仅有一个四氢呋喃的无嘧啶位点，所述信号探针与报告序列结合，引发核酸内切酶Ⅳ介导的信号探针上的四氢呋喃的无嘧啶位点的循环切割，最终产生放大的荧光信号，对荧光信号进行检测，定量分析胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述线性探针的长度为32nt，所述线性探针的碱基序列为5’-GAA GGC GGG CGA CAG TGC AAC GAA GAA AAA AX-3’，其中T为所述线性探针中的错配碱基胸腺嘧啶，X为2'，3'-二脱氧胞苷。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述环形模板DNA由线性锁式探针和连接探针经过连接酶连接，外切酶消化，纯化后所得；
其中，所述线性锁式探针的长度为57nt，所述线性锁式探针的碱基序列为5’-P-CTGTCG CGT TGC TTC GAT TGC TGC GTC CCT TCC CGC CCT GCC CTT CTC TTC CGC CCG-3’；所述碱基序列中5’端的P为修饰的磷酸基团；
所述连接探针的长度为17nt，所述连接探针的碱基序列为5’-GAA GGC GGG CGA CAGCG-3’；
所述信号探针的长度为26nt，所述信号探针的碱基序为5’-TGC TGC GTC CCT-FAM-TCCCXC CCT-BHQ1-GCC CT-3’，其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；X代表四氢呋喃无碱基位点。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用荧光分光光度计对荧光信号进行检测分析。
6.一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：双链DNA底物，核酸内切酶IV(Endo IV)、尿嘧啶DNA糖基化酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿苷三磷酸、DNA聚合酶、信号探针，其中所述双链DNA其中一条为环形模板DNA，另一条为线性探针，所述环形模板DNA与线性探针的部分序列杂交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶的双链DNA底物；杂交区域内线性探针上设计有且仅有一个错配的胸腺嘧啶。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述线性探针的长度为32nt，所述线性探针的碱基序列为5’-GAA GGC GGG CGA CAG TGC AAC GAA GAA AAA AX-3’，其中T为所述线性探针中的错配碱基胸腺嘧啶；X为2'，3'-二脱氧胞苷；
所述环形模板DNA由线性锁式探针和连接探针经过连接酶连接，外切酶消化，纯化后所得；
所述线性锁式探针的长度为57nt，所述线性锁式探针的碱基序列为5’-P-CTG TCG CGTTGC TTC GAT TGC TGC GTC CCT TCC CGC CCT GCC CTT CTC TTC CGC CCG-3’；所述碱基序列中5’端的P为修饰的磷酸基团；
所述连接探针的长度为17nt，所述连接探针的碱基序列为5’-GAA GGC GGG CGA CAGCG-3’；
所述信号探针的长度为26nt，所述信号探针的碱基序为5’-TGC TGC GTC CCT-FAM-TCCCXC CCT-BHQ1-GCC CT-3’，其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；X代表四氢呋喃无碱基位点；
所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括细胞裂解缓冲液，所述细胞裂解缓冲液包括pH为8.0的10毫摩尔Tris-HCl，150毫摩尔每升的氯化钠，1％的质量体积比的乙基苯基聚乙二醇，0.25毫摩尔每升的脱氧胆酸钠，1％的质量体积比的甘油，0.1毫摩尔每升的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐。
9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括所述胸腺嘧啶DNA糖基化酶、尿嘧啶DNA糖基化酶、核酸内切酶IV和DNA聚合酶的缓冲体系。
10.权利要求6-9任一项所述试剂盒在检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶中的用途。
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