CN109628556A - 基于自催化复制介导的循环信号放大检测人8-羟基鸟嘌呤dna糖基化酶活性的方法 - Google Patents

基于自催化复制介导的循环信号放大检测人8-羟基鸟嘌呤dna糖基化酶活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于自催化复制介导的循环信号放大检测人8‑羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的方法，采用的生物传感器包括发夹底物、MB1、MB2、Fok I和APE1，发夹底物的有义链或反义链中设计受损的鸟嘌呤和回文序列，受损的鸟嘌呤位于回文序列与环之间，另一条链设计与受损的鸟嘌呤匹配的胞嘧啶；MB1为5'端凸出的茎环结构，MB1的环设计回文序列，MB1凸出的5'‑末端DNA序列上设计与发夹底物的环互补的序列，MB1、MB2均修饰荧光分子和淬灭分子。本发明能够简便、高灵敏、高特异的检测hOGG1。

Description

基于自催化复制介导的循环信号放大检测人8-羟基鸟嘌呤 DNA糖基化酶活性的方法
技术领域
本发明涉及生物分析技术，具体涉及基于自催化复制介导的循环信号放大检测人8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的方法。
背景技术
这里的陈述仅提供与本发明有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
基因组DNA由Watson-Crick配对的杂环碱基组成(即A与T和G与C)，是遗传信息的主要载体，负责将遗传密码翻译成多功能蛋白质。基因组DNA准确性和完整性的维持是所有生物体生存的基本先决条件。然而，在现实生活中，基因组DNA经常受到来自于各种外源和内源因素的破坏，导致每天每个细胞存在至少104种损伤(如碱基氧化、DNA烷基化、DNA脱氨、DNA加合物和DNA链断裂)，从而造成基因组的不稳定，进而引发癌变。8-氧代-7，8-二氢鸟嘌呤(8-oxoG，受损的鸟嘌呤)是最常见的DNA损伤形式之一，其是由2’-脱氧鸟苷(dG)氧化产生的。8-OxoG可模拟2’-脱氧胸苷(dT)，与2’-脱氧腺苷(dA)发生错配，从而在DNA复制时诱导G：C向T:A的转化，引发永久性DNA突变。为修复8-oxoG，人类细胞进化出一种非常重要的细胞保护机制，即碱基切除修复(BER)，来应对DNA的氧化损伤。人类8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)是一种高度保守和广泛分布的DNA糖基化酶，它负责启动BER途径的最关键的第一步。hOGG1可以特异性地从8-oxoG：C配对中去除8-oxoG，然后与其他修复酶配合恢复原始G：C碱基对。hOGG1活性的失调会导致BER功能障碍，最终引发各种疾病，包括帕金森病(PD)、自身免疫性炎症、肺癌、乳腺癌、胆囊癌、胃癌、膀胱癌、口咽癌等。因此，作为一种重要的生物标志物和潜在的治疗靶标，准确、敏感地检测hOGG1对DNA氧化损伤修复研究和临床诊断都具有重要的意义。
到目前为止，已经开发了多种用于监测hOGG1活性的方法。原则上，hOGG1活性的定量用两种模式：一种是通过测量释放的受损碱基(即8-oxoG)的量，另一种是通过测定含有AP位点链的量来实现。在前一种模式中，用于hOGG1测定的常规方法包括高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。然而，HPLC和MS通常会受到样品收集和制备过程中产生的人为8-oxoG的困扰，其会反过来导致背景信号的增强。而ELISA会因为多步的洗涤步骤而低估实际的8-oxoG含量。此外，HPLC，MS和ELISA都不可避免地需要耗时耗力的操作，以及复杂的仪器，昂贵的抗体或严苛的反应条件。为了克服以上困难，另一种模式被开发了出来。凝胶电泳结合底物的P-放射性标记是公认的标准方法，但它存在放射性污染、灵敏度差和耗时长等缺点。比色法利用DNA-金纳米粒子(AuNP)探针末端共价捕获目标酶来阻止核酸外切酶的降解，从而实现对hOGG1活性的可视化检测，但是AuNPs的合成和DNA-AuNP探针的制备往往费时费力。基于切除修复诱导的量子点(QD)自组装荧光检测法，通过荧光共振能量转移(FRET)技术实现了对hOGG1活性的检测；通过两个响应切除修复的分子信标，基于全内反射荧光(TIRF)成像，可实现对hOGG1和人烷基腺嘌呤DNA糖化酶(hAAG)活性的同时定量。但是以上方法涉及到昂贵的荧光纳米材料(QD)、精密的仪器(即全内反射荧光显微镜(TIRFM))和复杂的操作(即基于TIRF的单分子成像)，大大限制了它们的广泛应用。此外，外切酶Ⅲ诱导的循环信号扩增和lambda外切酶辅助的再循环信号放大技术被用来对hOGG1和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)的活性进行荧光的测定，虽然检测灵敏度得到提高，但是它们都遭受到由外切核酸酶的非特异性切割引发的高背景信号。因此，开发能够简便、高灵敏、高特异的检测hOGG1的荧光方法仍然是非常必要的。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的一方面是提供一种检测8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶生物传感器，该传感器能够简便、高灵敏、高特异的检测hOGG1。
本发明的技术方案为：
一种检测人8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶生物传感器，包括发夹底物、第一信号探针(MB1)、第二信号探针(MB2)、Fok I和人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)，
所述发夹底物为茎环结构，发夹底物的茎含有互补的有义链和反义链，有义链或反义链中设计受损的鸟嘌呤和能够被Fok I识别的回文序列，受损的鸟嘌呤位于回文序列与环之间，另一条链设计与受损的鸟嘌呤匹配的胞嘧啶；
所述第一信号探针为5'端凸出的茎环结构，第一信号探针的环设计能够被Fok I识别的回文序列，第一信号探针凸出的5'-末端DNA序列上设计与发夹底物的环互补的序列，第一信号探针3'端修饰荧光分子，第一信号探针凸出的5'-末端DNA序列的一个碱基修饰淬灭分子；
所述第二信号探针为5'端凸出的茎环结构，第二信号探针的凸出5'-末端DNA序列上设计能够被Fok I识别的回文序列，第二信号探针3'端修饰荧光分子，第二信号探针凸出的5'-末端DNA序列的一个碱基修饰淬灭分子，第二信号探针的淬灭分子位于第二信号探针的回文序列与第二信号探针的环之间。
对于任意输入的DNA片段，Fok I可以催化预先设计的DNA发夹探针的自主切割，从而导致核酸模板的复制。在自主生物催化过程中，输入的DNA片段与预先定制的DNA发夹探针相邻杂交以产生长dsDNA结构，同时形成生物催化DNA模板(即含有Fok I的识别和切割结构域的dsDNA序列)。DNA模板的形成激活Fok I催化的dsDNA结构的自主切割，释放输入的DNA片段。释放的DNA片段可以引发新的杂交，切割和释放，导致DNA发夹探针的反复降解并因此导致核酸模板的持续自我复制。本发明利用Fok I独特的催化特性，以DNA为自复制生物材料，构建了一个酶催化的核酸复制系统，基于自催化复制介导的循环信号放大，首次实现了自复制系统对蛋白质酶即人8-氧脱氧DNA糖基化酶1(hOGG1)的检测分析应用。
本发明的另一方面提供了基于自催化复制介导的循环信号放大检测人8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的方法，提供上述生物传感器，由两个连续的反应组成：
(1)hOGG1引发的发夹底物的切割：hOGG1通过切割发夹底物中，脱氧戊糖和受损碱基之间的N-糖苷键，特异性识别并切除受损的鸟嘌呤，产生脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点，然后通过APE1的辅助有效切除AP位点，产生单核苷酸间隙，从而导致发夹底物的环部展开；
(2)自催化复制介导的分子信标(即MB1和MB2)级联切割引发的循环信号放大：发夹底物的环序列将与MB1凸出的5'端DNA序列杂交，产生第一双链DNA(dsDNA)结构，Fok I识别第一双链DNA结构中的回文序列，并使第一双链DNA结构中的MB1分别在其5'和3'端被切割从而释放展开的发夹底物、第一切割产物及荧光分子，释放的展开发夹底物与多余的MB1进行杂交使得MB1循环切割，第一切割产物与MB2凸出的5'端DNA序列杂交，产生第二dsDNA结构，Fok I识别第二双链DNA结构中的回文序列，并使第二双链DNA结构中的MB2分别在其5'和3'端被切割从而释放展开的第一切割产物、第二切割产物及荧光分子，释放的第一切割产物与多余的MB2进行杂交使得MB2循环切割，使得最终产生明显放大的荧光信号。
本发明的第三方面提供了一种检测人8-氧脱氧DNA糖基化酶1的试剂盒，包括上述生物传感器、Tris-EDTA缓冲液、寡核苷酸、发夹底物缓冲液、信号探针缓冲液。
本发明的有益效果为：
(1)灵敏度高：本发明基于hOGG1催化碱基切除修复反应的高精度，Fok I的分子信标自主切割的高特异性，以及自催化复制介导的循环信号放大的高效率，可以实现高灵敏地检测hOGG1活性，检测限低至4.3×10-7U/μL。
(2)特异性高：本发明hOGG1可以准确切除发夹底物中错配的8-oxoG，加之切割产物与信号探针的精密配对，Fok I的特异性不对称切割，使得本方案具有很好的特异性，可显著区分hOGG1与无关蛋白质和其他DNA糖基化酶成员。
(3)操作简单：本发明在恒定温度(37℃)下进行，避免了严格的温度控制；在整个扩增反应中只需要一种酶(即Fok I)，没有多种酶和试剂参与，大大简化了操作；实验过程中不涉及精密的仪器和复杂的操作，省时省力。
(4)背景信号低：级联再循环扩增的高效率切割可有效阻止循环反应过程中的非特异性扩增，大大降低实验背景，提高信噪比。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为本发明的原理示意图，A为在基因组DNA中的氧化胁迫下dG转化为8-oxoG的机制，B为基于自催化复制介导的循环信号放大检测hOGG1活性的方案示意图；
图2为本发明方法的原理表征图，A为分别在存在和不存在hOGG1的情况下对反应产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，泳道M是DNA标记(DNA marker)，泳道1为在hOGG1、APE 1和发夹底物存在下的反应产物，泳道2为在APE 1和发夹底物存在下的反应产物；B为放大反应产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，泳道M是DNA标记(DNA marker)，泳道1为合成的MB1，泳道2为在MB1、Fok I和切割产物存在下的反应产物，泳道3为合成的MB2，泳道4为在MB1、MB2、Fok I和切割产物存在下的反应产物，SYBR Gold用作荧光指示剂；C为荧光图谱，插图分别显示响应于对照、hOGG1和MB1、hOGG1、MB1和MB2的荧光强度的变化柱状图；
图3为本发明灵敏度的表征图：A为对应于不同浓度hOGG1的荧光光谱的变化，B为荧光强度随hOGG1浓度从1×10-6到0.1U/μL的变化(由下至上依次为对照、1×10-6U/μL、5×10-6U/μL、1×10-5U/μL、5×10-5U/μL、1×10-4U/μL、5×10-4U/μL、1×10-3U/μL、5×10-3U/μL、1×10-2U/μL、5×10-2U/μL、0.1U/μL)，插图显示荧光强度与hOGG1浓度的对数之间的线性关系，范围为1×10-6至0.05U/μL，误差棒表示三个实验的标准偏差；
图4为本发明特异性的表征图，0.1g/L IgG，0.1g/L BSA，0.1U/μL UDG，0.1U/μLhOGG1。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，需要开发一种简便、高灵敏、高特异的检测hOGG1的荧光方法，为了解决如上的技术问题，本公开提出了基于自催化复制介导的循环信号放大检测8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的方法。
本公开的一种典型实施方式，提供了一种检测人8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶生物传感器，包括发夹底物、第一信号探针(MB1)、第二信号探针(MB2)、Fok I和人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)，
所述发夹底物为茎环结构，发夹底物的茎含有互补的有义链和反义链，有义链或反义链中设计受损的鸟嘌呤和能够被Fok I识别的回文序列，受损的鸟嘌呤位于回文序列与环之间，另一条链设计与受损的鸟嘌呤匹配的胞嘧啶；
所述第一信号探针为5'端凸出的茎环结构，第一信号探针的环设计能够被Fok I识别的回文序列，第一信号探针凸出的5'-末端DNA序列上设计与发夹底物的环互补的序列，第一信号探针3'端修饰荧光分子，第一信号探针凸出的5'-末端DNA序列的一个碱基修饰淬灭分子；
所述第二信号探针为5'端凸出的茎环结构，第二信号探针的凸出的5'-末端DNA序列上设计能够被Fok I识别的回文序列，第二信号探针3'端修饰荧光分子，第二信号探针凸出的5'-末端DNA序列的一个碱基修饰淬灭分子，第二信号探针的淬灭分子位于第二信号探针的回文序列与第二信号探针的环之间。
对于任意输入的DNA片段，Fok I可以催化预先设计的DNA发夹探针的自主切割，从而导致核酸模板的复制。在自主生物催化过程中，输入的DNA片段与预先定制的DNA发夹探针相邻杂交以产生长dsDNA结构，同时形成生物催化DNA模板(即含有Fok I的识别和切割结构域的dsDNA序列)。DNA模板的形成激活Fok I催化的dsDNA结构的自主切割，释放输入的DNA片段。释放的DNA片段可以引发新的杂交，切割和释放，导致DNA发夹探针的反复降解并因此导致核酸模板的持续自我复制。本公开利用Fok I独特的催化特性，以DNA为自复制生物材料，构建了一个酶催化的核酸复制系统，基于自催化复制介导的循环信号放大，首次实现了自复制系统对蛋白质酶即人8-氧脱氧DNA糖基化酶1(hOGG1)的检测分析应用。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述回文序列为：GGATG。
该实施方式的一种或多种实施例中，发夹底物中，受损的鸟嘌呤位于距环2个碱基的位点。
该实施方式的一种或多种实施例中，发夹底物中，回文序列位于距环4个碱基的位点。
该实施方式的一种或多种实施例中，发夹底物的环部为4个碱基的DNA序列。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述荧光分子(荧光素)为FAM，所述淬灭分子为BHQ1。
该实施方式的一种或多种实施例中，第一信号探针中，距离5'-末端第7个碱基上修饰淬灭分子。
该实施方式的一种或多种实施例中，第一信号探针中，5'-末端凸出的DNA序列的碱基数为9nt。
该实施方式的一种或多种实施例中，第二信号探针中，距离5'-末端第14个碱基上修饰淬灭分子。
该实施方式的一种或多种实施例中，第二信号探针中，5'-末端凸出的DNA序列的碱基数为18nt。
该实施方式的一种或多种实施例中，发夹底物的序列为：5'-CTA GGA TGC OGTATT TAC CGC ATC CTA G-3'，(其中加粗的序列为Fok I的识别位点；符号“O”为损伤碱基8-oxoG)；
第一信号探针(MB1)的序列为：5'-GGT AAA T(BHQ1)AC GGG ACT TTG TGC ATCCAC AAA GTC CC(FAM)-3'，(其中加粗的序列为Fok I的识别位点；下划线并且加粗的碱基“T”修饰淬灭分子BHQ1；下划线碱基“C”修饰荧光分子FAM)；
第二信号探针(MB2)的序列为：5'-TGG ATG CAC AAA GT(BHQ1)C CCG ATT GTTCGA TCT CTC GAA CA AT(FAM)-3'，(其中加粗的序列为Fok I的识别位点；下划线并且加粗的碱基“T”修饰淬灭分子BHQ1；下划线碱基“C”修饰荧光分子FAM)。
本公开的另一种实施方式，提供了基于自催化复制介导的循环信号放大检测8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的方法，提供上述生物传感器，由两个连续的反应组成：
(1)hOGG1引发的发夹底物的切割：hOGG1通过切割发夹底物中，脱氧戊糖和受损碱基之间的N-糖苷键，特异性识别并切除受损的鸟嘌呤，产生脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点，然后通过APE1的辅助有效切除AP位点，产生单核苷酸间隙，从而导致发夹底物的环部展开；
(2)自催化复制介导的分子信标(即MB1和MB2)级联切割引发的循环信号放大：发夹底物的环序列与MB1凸出的5'端DNA序列杂交，产生第一双链DNA(dsDNA)结构，Fok I识别第一双链DNA结构中的回文序列，并使第一双链DNA结构中的MB1分别在其5'和3'端被切割从而释放展开的发夹底物、第一切割产物及荧光分子，释放的展开发夹底物与多余的MB1进行杂交使得MB1循环切割，第一切割产物与MB2凸出的5'端DNA序列杂交，产生第二dsDNA结构，Fok I识别第二双链DNA结构中的回文序列，并使第二双链DNA结构中的MB2分别在其5'和3'端被切割从而释放展开的第一切割产物、第二切割产物及荧光分子，释放的第一切割产物与多余的MB2进行杂交使得MB2循环切割，使得最终产生明显放大的荧光信号。
该实施方式的一种或多种实施例中，Fok I在MB1的正义链的第9个碱基处、反义链的第13个碱基处进行不对称切割。
该实施方式的一种或多种实施例中，第一切割产物的碱基数为25nt。
该实施方式的一种或多种实施例中，第二切割产物的碱基数为24nt。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤为：
(1)将发夹底物、MB1和MB2分别用缓冲液进行稀释，进行孵育后使得发夹底物、MB1和MB2均折叠成发夹结构，分别获得发夹底物溶液、MB1溶液和MB2溶液；
(2)向发夹底物溶液加入含有人8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶的溶液、人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶、10×NEBuffer 2、10×NEBuffer 4进行孵育，使得hOGG1催化的8-oxoG切除修复反应进行；
(3)加入Fok I、MB1溶液和MB2溶液，进行孵育后，再进行荧光测量。
该系列实施例中，步骤(1)的孵育条件为：温度93～97℃，时间5～10min。
该系列实施例中，步骤(2)的孵育条件为：温度36.5～37.5℃，时间40～45min。
该系列实施例中，步骤(3)的孵育条件为：温度36.5～37.5℃，无光，时间60～65min。
本公开的第三个实施方式，提供了一种检测人8-氧脱氧DNA糖基化酶1的试剂盒，包括上述生物传感器、Tris-EDTA缓冲液、寡核苷酸、发夹底物缓冲液、信号探针缓冲液。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
实施例
基于自催化复制介导的循环信号放大超灵敏检测人8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的方法。该方法由两个连续的反应组成：(1)hOGG1引发的发夹底物的切割，(2)自催化复制介导的分子信标(即MB1和MB2)级联切割引发的循环信号放大。
在第一步中，当hOGG1存在时，它将通过切割脱氧戊糖和受损碱基之间的N-糖苷键，特异性识别并切除8-oxoG，产生脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点。然后通过人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)的辅助有效切除AP位点，产生单核苷酸间隙，从而导致发夹底物的环部展开，形成凸出的9个碱基的DNA序列。
在第二步中，展开的环序列(即9-nt DNA序列)将与MB1凸出的5'端DNA序列杂交，产生一个长的双链DNA(dsDNA)结构，一个生物催化DNA模板(即包含Fok I识别和切割域的dsDNA序列)。加入Fok I，其将结合识别域，在正义链上9个碱基处，在反义链上13个碱基处进行不对称切割，使dsDNA结构中的MB1分别在其5’和3’端被切割，从而释放展开的发夹底物，25-nt的MB1切割产物和FAM荧光分子。值得注意的是，释放的展开发夹底物可以与多余的MB1连续杂交，启动Fok I催化的核酸模板自复制的新循环，从而导致MB1的循环切割，释放出大量的25-nt MB1切割产物和FAM荧光分子。重要的是，25-nt MB1切割产物可进一步与MB2凸出的5'端DNA序列杂交，产生新的长dsDNA结构，同时形成新的生物催化DNA模板。就像切割MB1一样，Fok I会不对称地将dsDNA结构中的MB2从其5’和3’端分别切割，从而启动FokI催化的核酸模板自复制的又一个新循环，导致MB2的循环切割，释放出大量的24-nt MB2切割产物和FAM荧光分子。因此，两步自催化循环反应(即第一步再循环切割MB1和Fok I第二步再循环切割MB2)引起生物催化DNA模板自复制，导致大量分子信标(即MB1和MB2)被切割，最终产生明显放大的荧光信号。
Fok I是一种独特的II型限制性内切核酸酶，其由两个独立的结构域组成：N-末端DNA识别结构域和C-末端DNA切割结构域。FokI可以识别和结合双链DNA(dsDNA)中5'-GGATG-3'的特异回文序列，并通过催化磷酸二酯键的水解，不对称地将dsDNA从一条链上距离9个碱基，在互补链上距离13个碱基处进行切割。
采用的发夹底物的序列为：5'-CTA GGA TGC OGT ATT TAC CGC ATC CTA G-3'，(其中加粗的序列为Fok I的识别位点；符号“O”为损伤碱基8-oxoG)；如SEQ ID NO.1所示。
第一信号探针(MB1)的序列为：5'-GGT AAA T(BHQ1)AC GGG ACT TTG TGC ATCCAC AAA GTC CC(FAM)-3'，(其中加粗的序列为Fok I的识别位点；下划线并且加粗的碱基“T”修饰淬灭分子BHQ1；下划线碱基“C”修饰荧光分子FAM)；如SEQ ID NO.2所示。
第二信号探针(MB2)的序列为：5'-TGG ATG CAC AAA GT(BHQ1)C CCG ATT GTTCGA TCT CTC GAA CA AT(FAM)-3'，(其中加粗的序列为Fok I的识别位点；下划线并且加粗的碱基“T”修饰淬灭分子BHQ1；下划线碱基“C”修饰荧光分子FAM)；如SEQ ID NO.3所示。
步骤
自催化复制介导的循环信号放大：首先用1×Tris-EDTA缓冲液(10毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，1毫摩尔每升的乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8.0)稀释所有寡核苷酸，用于制备储备溶液。将发夹底物、MB1和MB2分别用缓冲液(1.5毫摩尔每升的氯化镁，10毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH 8.0)稀释至10微摩尔每升，在95℃温育5分钟，然后缓慢冷却超过30分钟使之折叠成发夹结构。其次，将1微升新鲜制备的发夹底物加入20微升包含不同量的人8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)，10个单位的人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)，0.2微升10毫克每毫升的牛血清白蛋白(BSA)，2微升10×NEBuffer 2和2微升的10×NEBuffer 4，然后在37℃下孵育40分钟，用于hOGG1催化的8-oxoG切除修复反应。第三，将5微升切除反应产物加入到30微升包含有9个单位的FokI，700纳摩尔每升MB1，650纳摩尔每升MB2和3微升10×CutSmart缓冲液的扩增反应系统中，然后在37℃黑暗中孵育60分钟进行自催化复制介导的循环信号放大。
凝胶电泳分析和稳态荧光测量：在1×TBE缓冲液(9毫摩尔每升Tris-HCl，9毫摩尔每升硼酸，0.2毫摩尔每升EDTA，pH 7.9)中，用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，在室温110V恒定电压下电泳40分钟，分析8-oxoG切除反应和Fok I介导的循环切割介导的信号放大产物。凝胶电泳后，使用银染试剂盒和SYBR Gold进行染色，然后用ChemiDoc MP成像系统(Hercules，California，U.S.A)对凝胶可视化。为了进行稳态荧光测量，首先用超纯水将30微升扩增产物稀释至最终体积60微升，然后在Hitachi F-7000荧光分光光度计(Tokyo，Japan)上以2nm每秒的扫描速率在492nm的激发波长下测量荧光光谱。记录在504-600nm范围内的发射光谱和在520nm处的荧光强度以进行数据分析。
原理如图1B所示，发夹底物设计有茎和环，茎含有两条互补链(即有义链和反义链)。在有义链中，受损的鸟嘌呤(即8-oxoG，图1B中O)被设计为距环部分2个碱基的位点并与存在于反义链中胞嘧啶(图1B中C)匹配。此外，在茎中，5'-GGATG-3'的回文序列被设计为距离环部分4个碱基的位点，其作为Fok I的识别结构域。环是4个碱基的DNA序列，用于防止分子信标1(MB1)的杂交。此外，进一步设计两个分子信标(即MB1和MB2)以引发自催化复制介导的循环信号放大。在MB1中，在3'-末端上修饰荧光素(FAM)(图1B中F)，并在距离5'-末端第7个胸腺嘧啶碱基上修饰淬灭分子(BHQ1)(图1B中Q)。在其环部分，不仅设计有5'-CATCC-3'序列，还有凸出的5'-末端DNA序列(9nt)，用于诱导形成生物催化DNA模板。类似地，在MB2中，荧光素(FAM)和淬灭分子(BHQ1)分别修饰在3'末端和距离5'末端的第14个胸腺嘧啶碱基上。另外还设计了凸出的5'-末端DNA序列(18nt)，其含有5'-GGATG-3'序列，以诱导形成生物催化DNA模板。Fok I可以与识别结构域结合并在切割结构域不对称地切割两个信号探针(MB1和MB2)，导致大量荧光素(FAM)(图1B中F)被释放，最终产生增强的荧光信号。
(1)原理的实验验证：
为了证明hOGG1能否通过切割连接戊糖和受损碱基间的N-糖苷键成功切除8-oxoG，本实施例使用非变性凝胶电泳并以银染试剂盒作为指示剂分析切割产物。如图2A所示，当存在hOGG1时，观察到27nt的特征带(图2A,泳道1)，其恰好比合成的发夹底物少一个碱基(28nt，图2A,泳道2)，表明hOGG1可以特异性地切除受损的8-oxoG并随后在APE1存在下切割发夹底物以产生27-nt切割产物(图2A,泳道1)。当不存在hOGG1时，仅观察到一条发夹底物(28nt,图2A,泳道2)，表明在仅APE1存在下没有发生切割反应。为了进一步验证整个自催化复制介导的循环信号放大反应，本实施例将15μL上述切割产物(图2A,泳道1)加入到含有MB1和Fok I或MB1，MB2和Fok I的30μL反应体系中，并以SYBR Gold为荧光指示剂，采用非变性凝胶电泳对扩增产物进行了分析。在MB1和Fok I存在下，观察到一个25nt的特征条带(图2B，泳道2)，其正好是分子信标MB1的25-nt切割产物的大小。36nt和27nt的另外两个不同条带分别与发夹底物(图2A，泳道1)的36-nt、MB1(图2B，泳道1)的27-nt切割产物一致。这些结果表明，27-nt切割产物(即hOGG1催化的发夹底物切割的产物)可以与凸出的MB1的5'-末端序列相邻杂交，形成生物催化DNA模板，用于启动MB1的再循环切割以产生25nt的切割产物(图2B，泳道2)。随着MB2进一步添加到上述反应系统中，检测到40,36,27和24nt的特征条带(图2B，泳道4)，对应于40nt MB2的大小(图2B，泳道3)，36nt MB1(图2B，泳道1)，发夹底物的27nt切割产物(图2A，泳道1)和MB2的24nt切割产物，分别表明MB1的25nt切割产物可以与凸出的MB1的5'-末端序列杂交以引发MB2的自催化复制介导的循环切割，以产生MB2的24nt裂解产物(图2B，泳道4)。此外，本实施例进一步监测不同反应条件下荧光信号的变化。如图2C所示，在无hOGG1的对照中，没有检测到明显的荧光信号(黑色曲线，图2C)，这意味着当hOGG1不存在时，不能激活自催化复制介导的信循环号放大，相反地，在hOGG1和MB1存在时，可以观察到明显增强的荧光信号(蓝色曲线，图2C)，表明hOGG1可以启动8-oxoG切除和发夹底物的展开，激活自催化复制介导的MB1循环切割以产生增强的荧光信号。随后，将MB2进一步加入上述反应体系中以研究荧光信号的变化。在hOGG1、MB1和MB2都存在情况下，检测到显著增强的荧光信号(红色曲线，图2C)，其比仅存在hOGG1和MB1(图2C的插图)的荧光信号高1.70倍，证明了MB2在这种酶促自我复制系统中的掺入不仅会影响MB1的第一步循环切割，还能成功激活MB2的第二步循环切割，大大扩增了荧光信号。凝胶电泳(图2A和2B)和荧光实验(图2C)都清楚地证明hOGG1可以催化8-oxoG切除和发夹底物的展开以产生27nt切割产物，其随后可以作为引物启动自催化复制介导的循环信号放大，并且可以将与MB1或MB2类似的其他分子信标进一步整合到酶自我复制系统中，以成功激活多步循环切割反应，以产生显著增强的荧光信号。
(2)灵敏度实验：
为了研究本公开的灵敏度，在最佳的实验条件下，本实施例测量了不同浓度hOGG1的荧光强度。如图3A所示，荧光强度随着hOGG1浓度的增加而不断增强，并在0.05U/μL时达到平台期。值得注意的是，荧光强度与hOGG1浓度的对数值在1×10-6至0.05U/μL的5个数量级的大动态范围内呈现良好的线性相关性(图3的插图)，相关方程为F＝460.9log10C+3152.2，相关系数为0.9936，其中F代表荧光强度，C代表hOGG1浓度(U/μL)。检测限最终结果为4.3×10-7U/μL。
(3)特异性实验：
为了研究本公开的特异性，本实施例使用免疫球蛋白G(IgG)和牛血清白蛋白(BSA)和非特异性DNA糖基化酶尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)作为对照样品。IgG和BSA不属于DNA糖基化酶，它们不能切除受损的8-oxoG。UDG是一种DNA糖基化酶，但它只能从U/A错配中特异性识别和切除尿嘧啶。如图4所示，在相同条件下，当IgG，BSA和UDG存在时，没有检测到显著荧光信号，这和只含有反应溶液的对照组保持一致。相反地，在hOGG1存在时，观察到极高的荧光信号。以上结果表明只有hOGG1能够从8-oxoG：C碱基对进行8-oxoG切除，并且打开发夹底物，激活分子信标的自催化复制定介导的级联循环切割，产生高度增强的荧光信号。因此，本公开可以高度特异性地区分hOGG1与无关蛋白质和其他DNA糖基化酶成员。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 基于自催化复制介导的循环信号放大检测人8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶活性
的方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctaggatgcg gtatttaccg catcctag 28
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtaaatacg ggactttgtg catccacaaa gtccc 35
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggtaaatacg ggactttgtg catccacaaa gtccc 35

Claims (10)

1.一种检测人8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶生物传感器，其特征是，包括发夹底物、第一信号探针、第二信号探针、Fok I和人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶，
所述发夹底物为茎环结构，发夹底物的茎含有互补的有义链和反义链，有义链或反义链中设计受损的鸟嘌呤和能够被Fok I识别的回文序列，受损的鸟嘌呤位于回文序列与环之间，另一条链设计与受损的鸟嘌呤匹配的胞嘧啶；
所述第一信号探针为5'端凸出的茎环结构，第一信号探针的环设计能够被Fok I识别的回文序列，第一信号探针凸出的5'-末端DNA序列上设计与发夹底物的环互补的序列，第一信号探针3'端修饰荧光分子，第一信号探针凸出的5'-末端DNA序列的一个碱基修饰淬灭分子；
所述第二信号探针为5'端凸出的茎环结构，第二信号探针的凸出的5'-末端DNA序列上设计能够被Fok I识别的回文序列，第二信号探针3'端修饰荧光分子，第二信号探针凸出的5'-末端DNA序列的一个碱基修饰淬灭分子，第二信号探针的淬灭分子位于第二信号探针的回文序列与第二信号探针的环之间。
2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是，所述回文序列为：GGATG。
3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是，发夹底物中，受损的鸟嘌呤位于距环2个碱基的位点；
或，发夹底物中，回文序列位于距环4个碱基的位点；
或，发夹底物的环部为4个碱基的DNA序列。
4.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是，第一信号探针中，距离5'-末端第7个碱基上修饰淬灭分子；
或，第一信号探针中，5'-末端DNA序列的碱基数为9nt。
5.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是，第二信号探针中，距离5'-末端第14个碱基上修饰淬灭分子；
或，第二信号探针中，5'-末端DNA序列的碱基数为18nt。
6.如权利要求1所述的生物传感器，其特征是，发夹底物的序列为：5'-CTA GGA TGCOGT ATT TAC CGC ATC CTA G-3'；
第一信号探针的序列为：5'-GGT AAA TAC GGG ACT TTG TGC ATC CAC AAA GTC CC-3'；
第二信号探针的序列为：5'-TGG ATG CAC AAA GTC CCG ATT GTT CGA TCT CTC GAACA A T-3'。
7.基于自催化复制介导的循环信号放大检测8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的方法，其特征是，提供权利要求1～6任一所述的生物传感器，由两个连续的反应组成：
(1)hOGG1引发的发夹底物的切割：hOGG1通过切割发夹底物中，脱氧戊糖和受损碱基之间的N-糖苷键，特异性识别并切除受损的鸟嘌呤，产生脱嘌呤/脱嘧啶位点，然后通过APE1的辅助有效切除AP位点，产生单核苷酸间隙，从而导致发夹底物的环部分展开；
(2)自催化复制介导的分子信标级联切割引发的循环信号放大：发夹底物的环序列与MB1凸出的5'端DNA序列杂交，产生第一双链DNA结构，Fok I识别第一双链DNA结构中的回文序列，并使第一双链DNA结构中的MB1分别在其5'和3'端被切割从而释放展开的发夹底物、第一切割产物及荧光分子，释放的展开发夹底物与多余的MB1进行杂交使得MB1循环切割，第一切割产物与MB2凸出的5'端DNA序列杂交，产生第二双链DNA结构，Fok I识别第二双链DNA结构中的回文序列，并使第而双链DNA结构中的MB2分别在其5'和3'端被切割从而释放展开的第一切割产物、第二切割产物及荧光分子，释放的第一切割产物与多余的MB2进行杂交使得MB2循环切割，使得最终产生明显放大的荧光信号。
8.如权利要求7所述的方法，其特征是，Fok I在MB1的正义链的第9个碱基处、反义链的第13个碱基处进行不对称切割；
或，第一切割产物的碱基数为25nt；
或，第二切割产物的碱基数为24nt。
9.如权利要求7所述的方法，其特征是，步骤为：
(1)将发夹底物、MB1和MB2分别用缓冲液进行稀释，进行孵育后使得发夹底物、MB1和MB2均折叠成发夹结构，分别获得发夹底物溶液、MB1溶液和MB2溶液；
(2)向发夹底物溶液加入含有人8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶的溶液、人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶牛血清白蛋白、10×NEBuffer 2、10×NEBuffer 4进行孵育，使得hOGG1催化的8-oxoG切除修复反应进行；
(3)加入Fok I、MB1溶液和MB2溶液，进行孵育后，再进行荧光测量；
优选的，步骤(1)的孵育条件为：温度93～97℃，时间5～10min；
优选的，步骤(2)的孵育条件为：温度36.5～37.5℃，时间40～45min；
优选的，步骤(3)的孵育条件为：温度36.5～37.5℃，无光，时间60～65min。
10.一种检测人8-氧脱氧DNA糖基化酶1的试剂盒，其特征是，包括权利要求1～6任一所述的生物传感器、Tris-EDTA缓冲液、寡核苷酸、发夹底物缓冲液、信号探针缓冲液。
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