CN109251960B - 基于碱基切除修复诱导的检测Dam甲基转移酶活性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于碱基切除修复诱导的链置换和等温指数扩增荧光检测Dam甲基转移酶活性的方法。该方法操作步骤简单，具有良好的选择性和较高的灵敏度。经实验结果表明，其测定Dam甲基转移酶的线性范围为0.02‑10U/mL，检测限为0.014U/mL。该方法还可以用于大肠杆菌细胞中内源性Dam甲基转移酶的检测，在大肠杆菌中Dam甲基转移酶的检测限为0.61×10‑ 6mg/mL。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于碱基切除修复诱导的链置换和等温指数扩增荧光检测Dam甲基转移酶活性的方法。
背景技术
DNA甲基化是一种重要的表观遗传现象，在细胞的增殖、衰老和基因表达的过程中起着重要的作用，它通过改变基因的表达来调节细胞的功能。异常的DNA甲基化可导致许多癌症，如乳房癌、卵巢癌和肺癌等。甲基转移酶的活性决定了DNA甲基化水平，甲基转移酶活性的异常比其他癌症的标志表现得要早一些，因此甲基转移酶的活性可作为癌症早期诊断的一个生物标志物。甲基转移酶可以识别特定的DNA序列，将S-腺苷-L-甲硫氨酸上活跃的甲基转移到胞嘧啶C-5/N-4或者腺嘌呤N-6的位置。Dam甲基转移酶能将双链DNA中核酸序列5’-G-A-T-C-3’上的腺嘌呤甲基化形成5’-G-mA-T-C-3’，该甲基化过程在大肠杆菌细胞的增殖，DNA复制以及基因表达等生物过程中起着重要的作用，Dam甲基转移酶活性的异常可导致大肠杆菌发生病毒性的改变。因此，高灵敏地检测Dam甲基转移酶的活性对于疾病的诊断和治疗是非常重要的。
传统检测Dam甲基转移酶活性的方法有放射性标记法、色谱法和凝胶电泳，但这些方法存在的缺陷限制其实际应用，如分析步骤繁琐、仪器设备要求高、需要放射性标记等。后来人们采用新的方法用来检测甲基转移酶的活性，如比色法、荧光法、电化学和生物发光法。但这些方法的灵敏度不高，不能用于检测低浓度的甲基转移酶。为了提高分析方法的检测灵敏度，核酸扩增的方法开始被广泛应用，如链置换反应(SDA)、滚环扩增(RCA)和等温指数扩增(EXPAR)等。尽管基于SDA的比色法已成功用于甲基转移酶活性的检测，但灵敏度比较低。与SDA方法相比，RCA方法的灵敏度比较高，但是操作步骤繁琐，分析时间长。基于限制性内切酶的等温指数扩增方法虽然扩增效率高，但非特异性扩增不可避免，导致背景升高，降低了分析方法的灵敏度。
发明内容
针对上述问题和现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于碱基切除修复诱导的链置换和等温指数扩增荧光检测Dam甲基转移酶活性的方法，用于高灵敏检测Dam甲基转移酶的活性。具体包括：
(1)发夹底物DNA、发夹模板DNA、EXPAR模板DNA和信号探针DNA的选取：发夹底物的茎部含有22对完全互补的碱基，其中包括Dam甲基转移酶的识别序列5’-G-A-T-C-3’，且发夹底物的部分序列与发夹模板的部分序列互补；发夹模板的茎部含有8对互补碱基，为了防止非特异性扩增，发夹模板的3’端含有6个突出碱基；EXPAR模板含有两个完全相同的序列，其中EXPAR模板的延伸产物中包含U碱基；信号探针的两端分别用羧基荧光素(FAM)和四甲基罗丹明(TAMRA)标记，由于发生荧光共振能量转移，信号探针以单链存在时，荧光猝灭；信号探针的中间位置具有AP位点，且信号探针可与扩增产物杂化形成部分互补的双链；
(2)发夹底物DNA和发夹模板DNA的分别退火；
(3)Dam甲基转移酶对序列5’-G-A-T-C-3’中A碱基的甲基化；
(4)对甲基化敏感的限制性内切酶(Dpn I)将甲基化的发夹底物进行切割，形成一个完全互补的双链DNA和一个发夹结构，该发夹结构不稳定，会自动打开形成单链；
(5)链置换反应(SDA)循环：Dpn I切割甲基化产物后形成的单链可打开发夹模板，并与之杂交，该单链作为引物，在Bst聚合酶存在下进行聚合延伸，延伸产物中包含U碱基，UDG酶特异性识别并切割U碱基，形成AP位点，AP位点被核酸内切酶Endo IV切割后形成单核苷酸缺口，然后再进行聚合延伸和切割的循环过程，产生扩增产物；
(6)等温指数扩增(EXPAR)循环：扩增产物作为指数扩增的引物与EXPAR模板杂化，在Bst聚合酶的作用下进行聚合延伸，延伸产物中包含U碱基，UDG酶特异性识别并切割U碱基，形成AP位点，AP位点被核酸内切酶Endo IV切割后形成单核苷酸缺口，然后再进行聚合延伸和切割的循环过程，产生大量的扩增产物；
(7)扩增产物与信号探针结合形成部分互补双链DNA，Endo IV识别并切割信号探针上的AP位点，使得FAM荧光信号恢复，且释放出扩增产物；释放出的扩增产物继续与信号探针结合形成双链，Endo IV识别并切割信号探针上的AP位点，该过程可反复循环，使得荧光信号增强。
进一步地，上述检测方法的具体步骤包括：首先通过退火分别制备发夹底物和发夹探针。将发夹底物、S-腺甲硫氨酸(SAM)、限制性内切酶(Dpn I)、dam缓冲、
缓冲以及不同浓度的Dam进行混合，在37℃反应2h，接着80℃ 20min进行失活。接着，将上述部分产物与发夹模板、EXPAR模板、信号探针、Bst DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、核酸内切酶IV(Endo IV)、ThermoPol缓冲，UDG缓冲，NEB缓冲3，dNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dUTP)进行混合，在37℃下反应110min。最后在494nm的激发波长下测定荧光强度。
进一步地，上述的dam缓冲由500mM Tris-HCl，100mM EDTA，50mMβ-ME组成，pH为7.5；
缓冲由100mM Mg(Ac)2，500mM KAc，200mM Tris-HAc，1000μg/ml BSA组成，pH为7.9；ThermoPol缓冲由200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100组成，pH为8.8；UDG缓冲由200mM Tris-HCl，10mM DTT，10mM EDTA组成，pH为8.0；NEB缓冲3由1000mM NaCl,500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM DTT组成，pH为7.9。
进一步地，发夹底物DNA在缓冲液中的终浓度为100-1000nM，发夹模板DNA和EXPAR模板DNA在缓冲液中的终浓度为20-200nM，信号探针DNA在缓冲液中的终浓度为100-1000nM。
进一步地，Dam甲基转移酶在缓冲液中的终浓度为0.02-10U/mL，限制性内切酶(Dpn I)在缓冲液中的终浓度为0-60U/mL，SAM在缓冲液中的终浓度为0-200μM。
进一步地，Bst聚合酶在缓冲液中的终浓度为0-200U/mL，UDG在缓冲液中的终浓度为0-70U/mL，Endo IV在缓冲液中的终浓度为0-400U/mL。
进一步地，Bst聚合酶具有5’→3’DNA聚合酶活性，能够以DNA单链为模板催化形成DNA双链。尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)能够催化双链DNA上的尿嘧啶然后释放尿嘧啶。核酸内切酶IV(Endo IV)是一个脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内切酶，能够切割双链DNA上完整AP位点的5’端的第一个磷酸二酯键，产生3’羟基和5’脱氧核糖磷酸末端。
本发明的有益效果在于：
(1)提供了一种基于碱基切除修复诱导的SDA和EXPAR方法，不仅能够有效抑制非特异性扩增，降低背景，而且结合了EXPAR方法高的扩增效率，可显著提高方法的检测灵敏度，该方法可实现对Dam甲基转移酶活性的高灵敏检测。
(2)检测过程操作简单，检测方法选择性好。
附图说明
图1：一种基于碱基切除修复诱导的链置换和等温指数扩增荧光检测Dam甲基转移酶活性的实验流程图；
图2：(A)聚丙烯酰胺凝胶电泳表征分析Dam甲基转移酶活性图：条带M：Marker标记；条带1：Dpn I+SAM+Hairpin substrate；条带2：Dam+Dpn I+SAM+Hairpin substrate；条带3：Hairpin template；条带4：Dam+Dpn I+SAM+Hairpin substrate+Hairpin template；条带5：EXPAR template；条带6：Dam+Dpn I+SAM+Hairpin substrate+Hairpin template+EXPAR template；
(B)不同条件下检测Dam甲基转移酶的荧光光谱图：其中(a)表示Dam+Dpn I+SAM+Hairpin substrate+Hairpin template+EXPAR template；(b)表示Dpn I+SAM+Hairpinsubstrate+Hairpin template+EXPAR template；其中所有样品都加入了dNTPs、Bst聚合酶、UDG和Endo IV；
图3：检测Dam甲基转移酶活性的荧光变化图：(A)不同浓度的Dam甲基转移酶对应的荧光光谱图；(B)荧光强度与Dam甲基转移酶浓度的标准曲线(内插图：荧光强度与Dam甲基转移酶浓度之间的线性关系)；
图4：不同的甲基转移酶以及其它蛋白对荧光强度的影响；
图5：检测大肠杆菌细胞中Dam甲基转移酶活性的荧光谱图：(A)不同大肠杆菌细胞中总蛋白对应的荧光光谱图；(B)荧光强度与总蛋白浓度的标准曲线(内插图：荧光强度与总蛋白浓度之间的线性关系)。
具体实施方式
下面将结合说明书附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本实验中用到的实验仪器和试剂：Dam甲基转移酶、Hhal甲基转移酶、M.SssI甲基转移酶、10×dam缓冲(500mM Tris-HCl,100mM EDTA，50mMβ-ME，pH 7.5)、
缓冲(100mM Mg(Ac)2，500mM KAc，200mM Tris-HAc，1000μg/ml BSA，pH 7.9)、S-腺甲硫氨酸(SAM)、限制性内切酶(Dpn I)，Bst DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、核酸内切酶IV(Endo IV)、10×ThermoPol缓冲(200mM Tris-HCl,100mM(NH4)2SO4,100mM KCl,20mMMgSO4,1％Triton X-100,pH 8.8)，10×UDG缓冲(200mM Tris-HCl,10mM DTT，10mM EDTA，pH 8.0)和10×NEB缓冲3(1000mM NaCl，500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM DTT，pH 7.9)从NEB购得,四种脱氧核苷酸dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dUTP)和所有的寡核苷酸从上海生工购得，BSA从Sigma-Aldrich获得，SYBR Gold购于赛默飞世尔科技，实验所需的超纯水都来自于纯水净化系统18202V AXL(重庆，中国)，RF-5301PC型荧光分光光度计(岛津，日本)。实施例中所涉及的寡核苷酸序列如下表1所示。
表1实施例中所使用的寡核苷酸序列
注：在发夹底物中，黑色粗体为Dam甲基转移酶的识别位点，斜体部分和发夹模板的斜体部分完全互补；在发夹模板中，黑色粗体为互补序列，下划线部分和产物互补；EXPAR模板具有两段重复的序列，且下划线部分和产物链互补；X为AP位点。
实施例1一种基于碱基切除修复诱导的链置换和等温指数扩增荧光检测Dam甲基转移酶活性的方法
Dam甲基转移酶活性分析：
所有的核酸在使用之前都用EDTA缓冲稀释到100μM，然后将EXPAR模板和信号探针分别用水稀释到1μM和10μM，发夹底物和发夹模板分别用95℃水浴退火5min，然后自然冷却至室温，使得最终浓度分别为5μM和1μM。
在200μL的反应体系中分别加入0.5μM发夹底物、1×dam缓冲、
缓冲、160μM SAM、10U Dpn I以及不同浓度的Dam，在37℃反应2h，80℃ 20min失活。然后在20μL的反应体系中，加入4μL的上述甲基化切割产物、50nM发夹模板、100nM EXPAR模板、350nM信号探针、2.8U Bst DNA聚合酶、1U UDG、5U Endo IV、2μL 10×ThermoPol缓冲，2μL 10×UDG缓冲，2μL 10×NEB缓冲3，100uM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dUTP各100uM)，在37℃下反应110min。最后在494nm的激发波长下测定荧光强度。
凝胶电泳分析：
凝胶电泳用于验证该实验方法的可性行。在凝胶电泳分析中，除了4U/mL的Dam甲基转移酶，样品中所有的成分和上述实验相同。随后，将制备好的样品和loading buffer混合，然后使用15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对上述样品进行分离。使用1×TAE(40mMHAc,40mM Tris-HCl,2mM EDTA,pH 8.5)作为电泳缓冲液，在室温条件下恒压120V进行50min，最后用SYBR Gold染色10min。
选择性和特异性分析：
为了考察该分析方法的选择性，本文选择Hhal甲基转移酶、M.SssI甲基转移酶和BSA作为干扰物质。选择性实验中除了使用4U/mL的Hhal甲基转移酶、M.SssI甲基转移酶和BSA代替Dam甲基转移酶，其余的步骤与上述操作相同。
实验原理：
本发明所提供的Dam甲基转移酶活性检测分析的原理如图1所示。检测分析过程主要包括4个部分：发夹底物的甲基化、核酸内切酶切割甲基化的底物、碱基切除修复诱导的循环信号扩增和扩增产物诱导的荧光探针被循环剪切。首先，发夹底物的茎部有5’-G-A-T-C-3’的互补序列，在Dam甲基转移酶的作用下可以将其甲基化形成5’-G-mA-T-C-3’。然后，核酸内切酶Dpn I可以识别甲基化的产物并将其切割，生成5个互补碱基的发夹结构。但是新形成的发夹结构在37℃不稳定，会变成单链DNA。为了抑制非特异性扩增，实验设计了有8对互补碱基的发夹模板。形成的单链DNA会打开发夹模板，且可作为引物，在Bst聚合酶的作用下进行聚合延伸，延伸产物中含有U碱基。UDG能够识别并且切除U碱基，产生的AP位点能被Endo IV特异性识别并切割，在3’端产生OH，然后在Bst聚合酶、UDG和Endo IV的作用下进行聚合延伸、切割的SDA反应，生成扩增产物。扩增产物可作为引物与EXPAR扩增模板结合，在Bst聚合酶、UDG和Endo IV的作用下进行EXPAR扩增反应，产生大量的扩增产物。最后扩增产物和信号探针杂交形成部分互补双链，在Endo IV的作用下特异性切割双链上的AP位点，使得荧光恢复，且释放出扩增产物，释放出的扩增产物继续与信号探针结合形成双链，EndoIV识别并切割信号探针上的AP位点，该过程可反复循环，使得荧光信号增强。
可行性分析：
为了证明该分析方法的可行性，实验采用15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了扩增反应的产物，如图2A所示。Dam甲基转移酶不存在时(条带1)，除了发夹底物没有新的条带出现，表明没有发生反应。加入Dam甲基转移酶时(条带2)，有23nt的新条带出现了，表明甲基化之后发生了切割反应。加入发夹模板之后(条带3)，新形成的单链(23nt)将发夹模板打开，并作为引物在Bst聚合酶、UDG和Endo IV的作用下进行聚合延伸和切割，生成53bp双链DNA以及21nt单链DNA作为扩增产物(条带4)。当加入EXPAR扩增模板之后(条带5)，扩增产物和EXPAR模板结合，在Bst聚合酶、UDG和Endo IV的作用下聚合切割形成43bp双链DNA以及大量的21nt单链DNA作为扩增产物，相比于条带4，扩增产物21nt单链DNA的条带变亮，表明EXPAR反应可显著提高扩增效率。也通过荧光光谱法考察了该方法的可行性，如图2B所示，当没有加入Dam甲基转移酶时(曲线b)，在494nm的激发波长下基本没有荧光信号，当加入Dam甲基转移酶之后(曲线a)，荧光信号明显增强，表明该方法是可行的。
分析性能的检测：
为了评估该方法的分析性能，实验中在最优的条件下测定了不同浓度的Dam甲基转移酶活性。图3A体现了不同浓度的Dam甲基转移酶对应的荧光光谱。在0-10U mL-1的浓度范围内，随着Dam甲基转移酶浓度的增加，荧光强度逐渐增强。图3B说明随着Dam甲基转移酶浓度的增大，荧光强度不断增强。图3B内插图表明荧光强度与Dam甲基转移酶浓度的对数呈线性关系，其检测限为0.014U mL-1。该方法的高灵敏度主要归结于：(1)碱基切除修复诱导的扩增反应的非特异性扩增被抑制，背景降低；(2)指数扩增的效率高；(2)扩增产物诱导的信号探针被循环切割，使得荧光信号增强。
选择性和特异性分析：
为了考察该方法的选择性，实验选择了3种蛋白(Hhal甲基转移酶、M.SssI甲基转移酶和牛血清蛋白(BSA))作为干扰物质。M.SssI甲基转移酶可以特异性甲基化dsDNA中5’-C-G-3’序列中的C碱基，Hhal甲基转移酶可以特异性甲基化5’-G-C-G-C-3’序列中靠近5’端的C碱基，BSA是一种不相干的蛋白。如图4所示，只有Dam甲基转移酶存在时，所对应的荧光强度明显强于Hhal甲基转移酶、M.SssI甲基转移酶和BSA存在时对应的荧光强度，表明Dam甲基转移酶可以特异性甲基化5’-G-A-T-C-3’序列，说明该方法的选择性好。
实际样品的分析：
细胞培养：首先，JM110(Dam阴性)和GW5100(Dam阳性)的大肠杆菌细胞分别接种在3mL的液体培养基(5g/L酵母提取液,10g/L蛋白胨,10g/L NaCl)，在250rpm的摇床37℃下摇动12h。然后取100μL的细胞悬浮液加入到3mL的液体培养基中反应2.5h之后，将细胞悬浮液用转速为5000rpm的离心机离心获得细胞团，用超纯水洗涤两次，用RIPA裂解缓冲裂解，裂解所得到的总蛋白浓度用Bradford法蛋白质定量检测试剂盒进行定量。最后将大肠杆菌细胞裂解产物快速冷冻在-80℃的冰箱。
为了考察该方法在实际样品分析中的性能，用该方法考察大肠杆菌细胞(GW5100(Dam阳性)和JM110(Dam阴性))中内源性的Dam甲基转移酶。据报道，大肠杆菌细胞中Dam甲基转移酶在指数增长期的浓度高于稳定期，因此实验测定了指数增长期的大肠杆菌细胞中Dam甲基转移酶。如图5A所示，GW5100(Dam阳性)有明显的荧光信号，然而JM110(Dam阴性)并没有明显的荧光信号的增强，表明荧光信号的增强是由于大肠杆菌细胞中内源性的Dam甲基转移酶引起。如图5B所示，荧光强度随着总蛋白浓度的增加而增强，且荧光强度和总蛋白浓度的对数呈线性相关。综上，本发明能够用于复杂生物样品中的Dam甲基转移酶活性的检测。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 基于碱基切除修复诱导的检测Dam甲基转移酶活性方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 202
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
amncstngrt cancacttat cagcttaagg atcttatgtg ctgctagtct aagatcctta 60
agctgataag trtcancttc cctctctcct cggtgcccag tgctgcttct tagactagca 120
gcacataaga rtcancttcc ctctctcctc ggtgcccatt ccctctctcc tcggtgcccr 180
tcancccctc tccctcggtg cc 202
Claims (7)
1.一种非诊断目的基于碱基切除修复诱导的链置换和等温指数扩增荧光检测Dam甲基转移酶活性的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
（1）发夹底物DNA、发夹模板DNA、EXPAR模板DNA和信号探针DNA的选取：发夹底物的茎部含有22对完全互补的碱基，其中包括Dam甲基转移酶的识别序列5’-G-A-T-C-3’，且发夹底物的部分序列与发夹模板的部分序列互补；发夹模板的茎部含有8对互补碱基，为了防止非特异性扩增，发夹模板的3’ 端含有6个突出碱基；EXPAR模板含有两个完全相同的序列，其中EXPAR模板的延伸产物中包含U碱基；信号探针的两端分别用羧基荧光素（FAM）和四甲基罗丹明（TAMRA）标记，由于发生荧光共振能量转移，信号探针以单链存在时，荧光猝灭；信号探针的中间位置具有AP位点，且信号探针可与扩增产物杂化形成部分互补的双链；
（2）发夹底物DNA和发夹模板DNA的分别退火；
（3）Dam甲基转移酶对序列5’-G-A-T-C-3’中A碱基的甲基化；
（4）对甲基化敏感的限制性内切酶（Dpn I）将甲基化的发夹底物进行切割；
（5）链置换反应（SDA）产生扩增产物；
（6）等温指数扩增（EXPAR）循环：以步骤（5）中SDA循环后产生的扩增产物作为指数扩增的引物与EXPAR模板杂化产生大量的扩增产物；
（7）扩增产物与信号探针结合形成部分互补双链DNA，Endo IV识别并切割信号探针上的AP位点，使得FAM荧光信号恢复，且释放出扩增产物，释放出的扩增产物继续与信号探针结合形成双链，Endo IV识别并切割信号探针上的AP位点，该过程可反复循环，使得荧光信号增强并对其进行检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法的具体步骤包括：首先退火制备发夹底物和发夹探针，然后在反应试管中加入发夹底物、S-腺甲硫氨酸（SAM）、限制性内切酶（Dpn I）、dam 缓冲、CutSmart® 缓冲以及Dam，在37 °C 反应 2 h，接着 80°C 20 min进行失活，接着，取部分的上述产物于离心管中，加入发夹模板、EXPAR模板、信号探针、Bst DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA 糖基化酶（UDG）、核酸内切酶 IV （Endo IV）、ThermoPol缓冲，UDG 缓冲, NEB 缓冲3，dNTPs (dATP，dGTP，dCTP，dUTP)，在37 °C下反应 110 min，最后在494 nm的激发下测定荧光强度。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的dam 缓冲由500 mM Tris-HCl,100 mM EDTA, 50 mM β-ME 组成，pH为7.5；CutSmart® 缓冲由100 mM Mg(Ac)2，500 mMKAc，200 mM Tris-HAc，1000 μg/ml BSA组成，pH为7.9；ThermoPol 缓冲由200 mM Tris-HCl，100 mM (NH4)2SO4， 100 mM KCl, 20 mM MgSO4， 1% Triton X-100组成，pH为 8.8；UDG 缓冲由200 mM Tris-HCl，10 mM DTT，10 mM EDTA组成， pH 为8.0； NEB 缓冲 3 由1000 mM NaCl，500 mM Tris-HCl，100 mM MgCl2，10 mM DTT组成，pH为7.9。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的发夹底物DNA在缓冲液中的终浓度为100-1000 nM，发夹模板DNA和EXPAR模板DNA在缓冲液中的终浓度为20-200 nM，信号探针DNA在缓冲液中的终浓度为100-1000 nM。
5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，其中Dam 甲基转移酶在缓冲液中的终浓度为0.02-10 U/mL，限制性内切酶（Dpn I）在缓冲液中的终浓度为0-60 U/mL。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的Bst聚合酶在缓冲液中的终浓度为0-200 U/mL，尿嘧啶-DNA 糖基化酶（UDG）在缓冲液中的终浓度为0-70 U/mL，Endo IV在缓冲液中的终浓度为0-400 U/mL，S-腺甲硫氨酸（SAM）在缓冲液中的终浓度为0-200 μM。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的Bst 聚合酶具有 5’→3’ DNA聚合酶活性，能够以DNA单链为模板催化形成DNA双链；尿嘧啶-DNA 糖基化酶（UDG）能够催化双链 DNA 上的尿嘧啶然后释放尿嘧啶；核酸内切酶 IV （Endo IV）是一个脱嘌呤/脱嘧啶（AP）核酸内切酶，能够切割双链 DNA 上完整 AP 位点的5’端的第一个磷酸二酯键，产生3’羟基和5’脱氧核糖磷酸末端。
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