CN116287260A - 一种检测dna糖苷酶的发夹探针、生物传感器及检测方法和应用 - Google Patents

一种检测dna糖苷酶的发夹探针、生物传感器及检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测DNA糖苷酶的发夹探针、生物传感器及检测方法。所述发夹探针为茎‑环结构，发夹探针的茎区为T7启动子序列，且起始位点GGG左边的第三个碱基A被脱氧肌苷碱基I取代；所述发夹探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述传感器包括上述发夹探针、人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶、脱氧核糖核苷酸预混液、核糖核苷酸预混液、KF聚合酶、T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、CRISPR‑Cas12a反应溶液。本申请所述的生物传感器在hAAG存在的情况下生成大量crRNA，使得CRISPR‑Cas12a信号产生两级信号放大反应。本申请的检测方法实现了低背景、高灵敏度的hAAG检测，操作简单，可在单细胞水平上准确测量癌细胞中的内源性hAAG活性。

Description

一种检测DNA糖苷酶的发夹探针、生物传感器及检测方法和 应用
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种检测DNA糖苷酶的生物传感器及其检测方法。
背景技术
DNA的细微损伤(如氧化损伤、小烷基化产物和不同类型的单链断裂)可通过碱基切除修复(BER)途径去除和纠正。BER途径的关键是DNA糖基化酶，因为它可以启动整个BER途径。不同种类的DNA糖苷酶专门用于不同类型的化学损伤。人烷基腺嘌呤DNA糖苷酶(hAAG)是一种单功能DNA糖苷酶，作用于烷基化碱基，具有非常广泛的底物特异性，能够切除多种烷基化嘌呤，包括3-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、1,N6-腺嘌呤、脱氧肌苷(I)以及N1甲基鸟嘌呤和1，N2-脱氧鸟嘌呤的氧化脱氨产物。通过水解靶碱基和脱氧核糖之间的N-糖苷键，hAAG释放游离碱基并在DNA中留下无嘌呤/无嘧啶(AP)位点。hAAG的平衡表达对于烷基化损伤修复很重要，hAAG的过量表达可能导致结肠癌、肺癌、和胃癌的风险升高。
目前，hAAG检测方法包括高效液相色谱法、质谱法、放射性同位素标记法、顺磁珠捕获技术和凝胶电泳技术，它们存在耗时、有害辐射和灵敏度差等缺点。近来基于电化学和荧光策略来检测hAAG活性的生物传感器需要复杂的纳米材料制备、清洗和分离步骤。此外，由于这些方法本身原因所造成的高背景，同时缺乏适当的信号放大策略，导致这些生物传感器的灵敏度相对较低。因此，开发简单灵敏的糖基化酶检测生物传感器仍然是迫切需要的。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种高效检测hAAG活性的发夹探针；本发明的第二是提供一种高效检测hAAG活性的生物传感器；本发明的第三目的是提供上述生物传感器用于检测hAAG活性的检测方法；本发明的第四目的是提供上述发夹探针、生物传感器和检测方法在筛选hAAG抑制剂/激活剂中的应用。
技术方案：本发明所述的一种发夹探针，所述发夹探针为茎-环结构，发夹探针的茎区为T7启动子序列，且起始位点GGG左边的第三个碱基A被脱氧肌苷碱基I取代；所述发夹探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述的一种检测DNA糖苷酶的生物传感器，所述传感器包括上述的发夹探针、人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶、脱氧核糖核苷酸预混液、核糖核苷酸预混液、KF聚合酶、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、CRISPR-Cas12a反应溶液；所述发夹探针的环区的DNA序列与crRNA互补，作为切割后转录扩增合成crRNA的模板；所述crRNA的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述CRISPR-Cas12a反应溶液包括双链激活DNA、报告探针和Cas12a蛋白；所述双链激活DNA由TS部分和NTS部分组成，所述TS部分与crRNA互补。
本发明设计的发夹探针由两个区域组成，包括一个茎部和一个环部。茎区由功能化T7启动子序列组成，其中起始位点(GGG)左边的第三个碱基(A)被脱氧肌苷碱基(I)取代。环区由crRNA的互补DNA序列组成，它是转录产物，也是CRISPR-Cas12a系统的组成部分。双链激活DNA(dsDNA激活剂)是CRISPR-Cas12a系统的另一个组成部分，其TS部分与crRNA互补。报告探针在5’端用FAM标记，在3’端用BHQ标记，FAM被BHQ淬灭。
在hAAG存在情况下，发夹探针茎中受损的脱氧肌苷碱被hAAG特异性识别并有效地从I:T对中切除，留下AP位点，产生单核苷酸间隙后APE1使碱基连接完全切断并同时展开发夹探针环。随后，展开发夹探针作为模板和引物，在KF聚合酶和dNTPs存在情况下引发聚合，产生两种稳定的dsDNA双链体(情况一：完全聚合形成完全互补的双链结构。情况二：T7聚合酶识别区域完全聚合但整条DNA链不完全聚合)，以启动T7 RNA聚合酶催化的转录反应，产生大量crRNA为CRISPR-Cas12a系统提供信号放大燃料。产生的crRNA被设计为包含引导序列和重复序列。重复序列是crRNA锚定Cas12a蛋白的必要部分，并且引导序列与dsDNA激活剂互补以激活CRISPR-Cas12a系统的顺式切割。当Cas12a/crRNA/dsDNA激活剂的三元复合物形成时，CRISPR-Cas12a系统的反式切割活性被激活，并表现出高的反式剪切效率，转换率为约1250/s，切割多个报告探针，从而产生强的回收荧光信号。相反，hAAG的缺失不能诱导脱氧肌苷碱的去除，转录反应的启动和crRNA的产生都不能发生。CRISPR-Cas12a系统无法激活，因此无法观察到FAM信号。
进一步地，所述报告探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述报告探针标记有荧光基团和淬灭基团。
本发明所述的一种用上述生物传感器检测DNA糖苷酶的检测方法，包括以下步骤：
(1)将发夹探针、人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶和不同浓度的DNA糖苷酶hAAG标准样品或含有hAAG的待测样品混合，进行常规温度恒温孵育得到产物；
所述发夹探针为茎-环结构，发夹探针的茎区为T7启动子序列，且起始位点GGG左边的第三个碱基A被脱氧肌苷碱基I取代；所述发夹探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述发夹探针的环区的DNA序列与crRNA互补，作为切割后转录扩增合成crRNA的模板；所述crRNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)将步骤(1)得到的产物与脱氧核糖核苷酸预混液、核糖核苷酸预混液、KF聚合酶、RNA酶抑制剂和T7 RNA聚合酶混合，常规温度恒温孵育后通过高温孵育终止反应得到产物；
(3)将步骤(2)得到的产物与CRISPR-Cas12a反应溶液混合，常规温度恒温孵育后，进行荧光检测，根据得到的不同浓度的hAAG标准样的荧光值绘制标准曲线，将含有hAAG的待测样的FAM荧光值代入标准曲线，即得DNA糖苷酶hAAG的浓度；所述CRISPR-Cas12a反应溶液包括双链激活DNA、报告探针和Cas12a蛋白；所述双链激活DNA由TS部分和NTS部分组成，所述TS部分与crRNA互补；报告探针标记有荧光基团和淬灭基团。
进一步地，步骤(1)中所述发夹探针浓度为0.5-100nM；所述DNA糖苷酶hAAG标准样品中的hAAG浓度为1.0×10-10-1.0×10-2U/μL。
进一步地，步骤(2)所述的KF聚合酶用量为0.5-20U；T7 RNA聚合酶用量为5-25U；步骤(2)还包括NEBuffer 2和RNAPol反应缓冲液。
进一步地，步骤(3)中所述的Cas12a蛋白浓度为0.08-3.2μM；报告探针的浓度为0.032-0.32μM。
本发明所述的发夹探针、生物传感器以及检测方法在筛选hAAG抑制剂/激活剂中的应用。
进一步地，步骤(3)中所述的荧光检测的检测波长为492nm。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本申请所述的生物传感器通过设计的发夹探针，在hAAG存在的情况下生成大量crRNA，使得CRISPR-Cas12a信号产生两级信号放大反应，即T7 RNA聚合酶催化的转录扩增和CRISPR-Cas12a系统催化的环切割反应。本申请的检测方法实现了低背景、高灵敏度的hAAG检测，检测限为9.25×10- 11U/μL，动态范围从1.0×10-10至0.01U/μL，操作简单，可在单细胞水平上准确测量癌细胞中的内源性hAAG活性。
附图说明
图1为本发明生物传感器的原理示意图。
图2为12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析结果图；(其中，A的检测对象为各阶段发夹探针：泳道M为DNA标准分子量对照物；泳道1为合成的发夹探针被切割后的产物；泳道2为发夹探针+hAAG+APE1+10×NEBuffer 4+10×NEBuffer 2；泳道3为发夹探针+APE1+10×NEBuffer 4+10×NEBuffer 2；B的检测对象为聚合和转录反应产物，泳道M为DNA标准分子量对照物；泳道1为合成的crRNA；泳道2为发夹探针+hAAG+APE1+KF聚合酶；泳道3为发夹探针+APE1+KF聚合酶；泳道4为发夹探针+hAAG+APE1+KF聚合酶+T7RNA聚合酶；泳道5为发夹探针+APE1+KF聚合酶+T7RNA聚合酶，且B中泳道2-5均加入+10×NEBuffer 4+10×NEBuffer 2+10×RNAPol reaction buffer+dNTPs+NTPs)。
图3为当hAAG存在和不存在时测量FAM荧光发射光谱。
图4A为本发明生物传感器对不同浓度hAAG对应的荧光信号响应(a→k：1.0×10-10、1.0×10–9、1.0×10–8、1.0×10–7、1.0×10-6、1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-3、0.01、0.1和1U/μL)；B为524nm处的荧光强度随hAAG浓度变化结果；C为荧光强度与hAAG浓度对数之间的线性关系(范围为1.0×10-10至0.01U/μL，误差棒表示三个实验的标准偏差)。
图5为使用本发明生物传感器检测hAAG、尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、Dam甲基转移酶(Dam)、多聚合核苷酸激酶、蛋白激酶A(PKA)和牛血清白蛋白(BSA)、仅含反应缓冲液的对照组的荧光强度响应(检测浓度均为0.1U/μL，误差棒表示三个实验的标准偏差)。
图6为发夹探针浓度为0-200nM时的初始速度的检测结果图(其中hAAG浓度为0.1U/μL，误差棒表示三个实验的标准偏差)。
图7为优化的发夹探针浓度(误差棒表示三个实验的标准偏差)。
图8为优化KF聚合酶和T7 RNA聚合酶活性(误差棒表示三个实验的标准偏差)。
图9为优化Cas12a蛋白和报告探针浓度(误差棒表示三个实验的标准偏差)。
图10为1-500μM Cd2+对hAAG相对活性的影响的结果图(其中，hAAG浓度为0.1U/μL，误差棒表示三个实验的标准偏差)。
图11为使用本发明生物传感器检测试剂样品的结果图，(其中A为细胞提取物的响应荧光强度，检测对象分别为：宫颈癌细胞(Hela)细胞、人类非小细胞肺癌细胞(A549)、人类正常肝细胞(HL-7702)、热灭活HeLa细胞提取物和仅含有裂解缓冲液的对照组，细胞数均为10000个；B为524nm处的荧光强度与HeLa细胞数量的对数之间的线性关系；C为524nm处的荧光强度与A549细胞数量的对数之间的线性关系，误差棒表示三个实验的标准偏差)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
本实验中用到的试剂和仪器：
人烷基腺嘌呤DNA糖苷酶标准品(hAAG)、人嘌呤/嘧啶核酸内切酶1(APE1)、Klenow片段DNA聚合酶(3'→5'exo-，KF聚合酶)、T7 RNA聚合酶、Cas12a蛋白(Cpf1)、脱氧核糖核苷酸(dNTPs)预混液(即脱氧鸟苷酸、脱氧腺苷酸、脱氧胞苷酸和脱氧胸苷酸)、核糖核苷酸(NTPs)预混液(即三磷酸腺苷、三磷酸尿苷、鸟嘌呤三核苷酸磷酸和胞嘧啶核苷三磷酸)、10×NEBuffer 4(10毫摩尔每升DTT、100毫摩尔每升乙酸镁、500毫摩尔每升乙酸钾、200毫摩尔每升Tris乙酸酯、pH 7.9)、1、0×NEBuffer 2(成分：100mM MgCl2,500mM NaCl,10mMDTT,100mM Tris-HCl,pH 7.9)10×RNAPol反应缓冲液(400毫摩尔每升Tris-HCl、60毫摩尔每升MgCl2、20毫摩尔每升精胺、100毫摩尔每升DTT、pH 7.9)、尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)、DNA腺嘌呤甲基转移酶(Dam-MT)、T4多核苷酸激酶(T4 PNK)、蛋白激酶(PKA)和牛血清白蛋白(BSA)购自New England Biolabs(Ipswich，MA，USA)。无RNase TE缓冲液和氯化铬(II)购自Sigma-Aldrich公司(美国密苏里州圣路易斯)。核酸染料SYBR Gold购自Thermo FisherScientific公司(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)。RNA酶抑制剂(Recombinant RNaseInhibitor，2313Q，500U浓度40U/μL)购自TaKaRa Bio Inc.(Dalian,China)。人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)、人肺腺癌细胞系和人肝细胞系(HL-7702细胞)购自中国科学院细胞库(中国上海)。所有其他试剂均为分析级，未经进一步纯化即按原样使用。在所有实验中使用从Millipore过滤系统(Temecula，CA，USA)获得的超纯水。
使用日立F-7000荧光分光光度计(日本东京)上的微量石英皿在492nm的激发波长下测量荧光光谱。
实施例1前期准备
发夹探针(SEQ ID NO.1：
Figure SMS_1
Figure SMS_2
加粗为被切割位点，下划线为与crRNA互补序列)、
crRNA：(SEQ ID NO.2：
Figure SMS_3
Figure SMS_4
下划线部分为与发夹探针互补序列，加粗部分为与dsDNA激活剂TS互补序列)
双链激活DNA(dsDNA激活剂，dsDNA激活剂TS SEQ ID NO.4：
Figure SMS_5
Figure SMS_6
加粗部分为与crRNA互补序列；dsDNA激活剂NTS SEQ ID NO.5：5’-GAC AGA CAT ACT TTA TGA CACATG CTG GTC CCT ATA ACT GTC TGT GGA ATG TCA-3’)；
报告探针(SEQ ID NO.3：5’-FAM-TTA TT-BHQ-3’)；
发夹探针被切割后的产物(长链SEQ ID NO.6：5’-TAG GGA CCA GCA TGT GTC AATCTA CAC TTA GTA GAA ATT ACC CTA TAG TGA GTC GTA TTA-3’，短链SEQ ID NO.7：5’-TAATAC GAC TCA CT-3’)；
以上序列由TaKaRa Bio Inc.(Dalian,China)合成。
将以上所有寡核苷酸用1×无RNase TE缓冲液(10mM HCl，1mM EDTA，pH 7.5)溶解至10μM，以制备储备溶液。
使用前，将发夹探针在1×退火缓冲液(1.5mM MgCl2和10mM Tris-HCl，pH 8.0)中在95℃下孵育5分钟，然后冷却至室温以折叠成完美的发夹结构。dsDNA激活剂TS和dsDNA激活剂NTS以1:1的量混合，在95℃的1×退火缓冲液中孵育5分钟，随后冷却至室温以形成双链激活DNA。
实施例2检测DNA糖苷酶
(1)将1纳摩尔每升发夹探针、0.5U/μL人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE 1)、1微升10×NEBuffer 2和1微升10×NEBuffer 4和浓度分别为1.0×10-10、1.0×10–9、1.0×10–8、1.0×10–7、1.0×10-6、1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-3和0.01U/μL的hAAG标准样品混合，于37℃恒温孵育20分钟；
将1纳摩尔每升发夹探针、0.5U/μL人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE 1)、1微升1×NEBuffer 2和1微升10×NEBuffer 4和含有hAAG的待测样品混合，于37℃恒温孵育20分钟；
(2)分别将步骤(1)得到的2种反应产物各6微升与、1微升1×RNAPol反应缓冲液、100纳摩尔每升脱氧核糖核苷酸预混液、250微摩尔每升核糖核苷酸预混液、0.25U/μL KF聚合酶、1微升RNA酶抑制剂、1U/μL T7 RNA聚合酶混合为20微升体系，常在37℃下反应30分钟，然后在65℃下孵育10分钟终止反应；
(3)将15微升步骤(2)的聚合转录反应产物与15微升CRISPR-Cas12a反应溶液(包含3微升10×NEBuffer 2、0.32微摩尔每升双链激活DNA(dsDNA激活剂)、0.16微摩尔每升报告探针和0.32微摩尔每升Cas12a蛋白)，并在37℃下孵育30分钟，进行荧光检测，根据得到的不同浓度的hAAG标准样的FAM荧光值绘制标准曲线(图4C)，将含有hAAG的待测样的FAM荧光值代入标准曲线，即得DNA糖苷酶hAAG的浓度。
实施例3探针和产物的12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测试
3.1将实施例1合成的发夹探针被切割后的产物(经过退火合成处理的长链+短链)加入水(对照品)作为泳道1，将发夹探针加入hAAG、APE1、10×NEBuffer 4、10×NEBuffer 2作为泳道2，将发夹探针加入APE1、10×NEBuffer 4、10×NEBuffer 2作为泳道3，分别进行12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测试，结果如图2A所示，当存在hAAG的情况下，发夹探针的运行速度与合成的发夹探针被切割后的产物一致。并且由于环区的展开，它的运行速度比没有hAAG时的完整发夹探针快。这些结果表明，在APE1的辅助下，hAAG可以准确地切除损伤的脱氧肌苷碱并破坏发夹探针。
3.2为了进一步研究转录启动的crRNA生成是否可以进行，对方法中产生的聚合和转录产物分别进行了12％非变性PAGE分析。将实施例1合成的crRNA(对照组)作为泳道1，将发夹探针、hAAG、APE1、KF聚合酶作为泳道2，将发夹探针、APE1、KF聚合酶作为泳道3，将发夹探针、hAAG、APE1、KF聚合酶、T7RNA聚合酶作为泳道4，将发夹探针、APE1、KF聚合酶、T7 RNA聚合酶作为泳道5，结果如图2B所示。在hAAG、APE 1和KF聚合酶的存在下，出现60bp的聚合dsDNA产物带，其移动速度慢于发夹探针，表明发生了KF聚合酶催化的聚合反应。最后，在T7RNA聚合酶的存在下，出现了与合成的crRNA相同的43nt条带，表明crRNA的产生。相反，当hAAG不存在时，仅检测到发夹探针带，表明没有发生聚合反应或转录反应。这些结果清楚地证明了转录启动的crRNA生成的启动。实验中还使用荧光光谱来验证整个测定的可行性(图3)。当hAAG存在时表现出更高的FAM信号，但在没有hAAG的情况下没有检测到明显的FAM。这些结果表明，hAAG的存在可以诱导转录启动的CRISPR-Cas12a信号放大。
本实施例中每个泳道都填加了loading buffer电泳上样缓冲液和核酸染料SYBRGold。
实施例4生物传感器灵敏度分析
基于实施例2的检测方法，本实施例测量了生物传感器对不同浓度hAAG的响应荧光强度。将实施例2步骤(1)中的hAAG标准样品的浓度改为1.0×10-10、1.0×10–9、1.0×10–8、1.0×10–7、1.0×10-6、1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-3、0.01、0.1和1U/μL，结果如图4所示，524nm处的荧光强度随着hAAG浓度从1.0×10-10U/μL增加到1U/μL而增强(图4A和B)。此外，在对数尺度上，荧光强度在1.0×10-10U/μL至0.01U/μL范围内与hAAG浓度线性相关(图4C)。相应的标准曲线方程式为F＝9886.56+932.61log10 C(R2＝0.9989)，其中F是524nm处的荧光强度，C是hAAG的浓度(U/μL)。根据平均对照信号加三倍标准偏差的规则，检测限估计为9.25×10-11U/μL。与基于滚环扩增的荧光测定(测定检出限：2.0×10-7U/μL)和去磷酸化介导的化学发光生物传感器(测定检出限：1.53×10-9U/μL)相比，本申请所构建的生物传感器的灵敏度分别提高了2162(9.25×10-11/2.0×10-7U/μL)倍和17(9.25×10-11/1.53×10-9U/μL)倍。
实施例5生物传感器的特异性分析
基于实施例2的检测方法，本实施例测量了生物传感器对各种生物标志物干扰的荧光强度，将实施例2步骤(1)中的不同浓度的hAAG标准样品分别替换为尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)、DNA腺嘌呤甲基转移酶(Dam MTase)、多核苷酸激酶(T4 PNK)、蛋白激酶(PKA)和牛血清白蛋白(BSA)。如图5所示，只有hAAG可以检测到较高的FAM信号。相反，在UDG、Dam MTase、T4 PNK、PKA或BSA的存在下未检测到显著的荧光信号，这与仅具有反应缓冲液的对照组相似，这表明所提出的方法在区分不相关的生物分子和其他DNA糖苷酶成员方面具有优异的特异性。
实施例6动力学分析方法的可行性
本实施例测量了发夹探针浓度变化时的初始速度(V)，将实施例2步骤(1)中的发夹探针浓度分别改为1、5、15、25、50、100、150、200nM。如图6所示，在0.1个U/μL hAAG存在下，初始速度随着发夹探针浓度从5纳摩尔每升增加到200纳摩尔每升而逐渐增加，并在37℃下孵育5分钟。Vmax确定为238.87/s，Km计算为15.35纳摩尔每升。Km值与放射性测定获得的值一致(13–42纳摩尔每升)。结果表明，所提出的方法可用于hAAG动力学分析。
结果如图7所示，最终选择了优化的浓度范围为在0.5-100纳摩尔每升。
实施例7优化KF聚合酶和T7 RNA聚合酶活性
参考实施例2的方法，将步骤2中KF聚合酶的添加量分别改为0.5、2.5、5、10和20U，hAAG仅添加浓度为0.1U/μL的hAAG标准样品，其余步骤和条件同实施例2。结果如图8A所示，F/F0的值随着KF聚合酶的量从1U增加到5U而提高，随后下降，因此在研究中选择了5U的KF聚合酶为优选。
参考实施例2的方法，将步骤2中T7 RNA聚合酶添加量分别改为5、10、15、20和25U，hAAG的浓度为0.1U/μL的hAAG标准样品，其余步骤和条件同实施例2。结果如图8B所示，随着T7 RNA聚合酶的量从5U到15U的增加，F/F0的值明显升高，，超过15U后趋于稳定。因此，在研究中确定了T7 RNA聚合酶的最优用量为15U。
实施例8优化Cas12a蛋白和报告探针用量
参考实施例2的方法，将步骤2中Cas12a蛋白的添加量分别改为0.02、0.04、0.08、0.16、0.32和3.20μM，hAAG的浓度为0.1U/μL的hAAG标准样品，其余步骤和条件同实施例2。结果如图9A所示，F/F0的值随着Cas12a蛋白浓度从0.02μM增加到0.32μM而提高，随后超过0.32μM时降低。
参考实施例2的方法，将步骤2中报告探针的添加量分别改为0.016、0.032、0.08、0.16和0.32μM，含有hAAG的待测样品改为浓度为0.1U/μL的hAAG标准样品，其余步骤和条件同实施例2。结果如图9B所示，F/F0的值随着报告探针浓度从0.016μM增加到0.16μM而增加，随后在浓度超过0.16μM时趋于稳定。
Cas12a蛋白可以与转录生成的crRNA和dsDNA激活剂组装，形成三元复合物，该复合物连续反式切割报告探针，以生成强FAM荧光信号。背景干扰信号将由过量的Cas12a蛋白和报告探针带来。因此，选择0.32μMCas12a蛋白和0.16μM的报告探针浓度作为方法的最佳浓度。
实施例9抑制剂实验
铬(II)作为DNA糖苷酶的一种常见广谱抑制剂，它可以通过与底物结合抑制DNA底物切割，并通过与其活性位点结合直接灭活DNA糖苷酶的催化活性。
参考实施例2的方法，步骤(1)中的含有hAAG的待测样品改为浓度为0.1U/μL的hAAG标准样品，并额外加入浓度分别为1、20、40、45、60、80、110、150、180、210、250、300、500μM Cd2+，其余步骤和条件同实施例2。结果如图10所示，Cd2+以浓度依赖的方式诱导hAAG相对活性降低。将hAAG活性降低50％(IC50)所需的抑制剂浓度被确定为51.93微摩尔每升，与放射性测定获得的值(约100微摩尔每升)相当。这一结果表明，我们的方法可用于hAAG抑制剂筛选，在药物发现和疾病治疗方面具有巨大潜力。
实施例10实际样品检测
为了测试所提出的生物传感器系统用于真实样本分析的可行性，本实施例检测了人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)、人肺腺癌细胞株(A549细胞)和人肝细胞系(HL-7702细胞)中的内源性hAAG浓度。
将人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)、人肺腺癌细胞株(A549细胞)和人肝细胞系(HL-7702细胞)培养在含有10％FBS(美国Life Technologies)和1％青霉素链霉素(美国Gibco)的Dulbecco改良Eagle's培养基(DMEM，美国Life Technologies)中。所有细胞均在37℃、含5％CO2的湿润气氛中培养备用。使用核提取试剂盒(ActiveMotif，Carlsbad，CA，USA)收集生长指数阶段的细胞核提取液。
参考实施例2的方法，将步骤(1)中的含有hAAG的待测样品分别改为添加1万个人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)、人肺腺癌细胞株(A549细胞)、人肝细胞系(HL-7702细胞)、失活的hAAG(inactivated，HeLa细胞在95℃水浴锅中加热10min)细胞的核提取液和裂解缓冲液(对照组)，其余步骤和条件同实施例2。
结果如图11A所示，检测到只有裂解缓冲液的对照组和热处理的HeLa细胞提取液(inactivated)的低背景信号。在HL-7702细胞的核提取液中检测到低荧光信号，仅略高于对照组中测得的信号，表明正常细胞中缺少hAAG。相反，在HeLa细胞的核提取液和A549细胞的核提取液存在时检测到高荧光信号，这与人类癌细胞中hAAG的过度表达一致。
本实施例还探究了荧光强度与Hela细胞和A549细胞数量之间的关系。将在培养皿中培养的Hela细胞和A549细胞用细胞计数仪进行计数得到培养皿中细胞总个数。用核提取试剂盒(ActiveMotif，Carlsbad，CA，USA)收集生长指数阶段的细胞核提取液，用总细胞数/所得细胞核提取液体积可以得到每微升提取液中细胞的个数，分别取1、100、1000、10000、10万个细胞范围所对应的Hela细胞提取液体积和10、100、1000、10000个细胞范围所对应的A549细胞提取液体积，将步骤(1)中的含有hAAG的待测样品改为分别加入上述提取液，其余步骤和条件同实施例2。通过检测荧光信号的强度得到细胞个数与荧光强度的线性关系。
如图11B和C所示，荧光强度在对数尺度上分别与1-10万个细胞范围内的Hela细胞数量和5-10万个细胞的A549细胞数量呈线性相关。Hela细胞的核提取液的回归方程为F＝2308.10+986.20log10 N(R2＝0.9922)，A549细胞的核提取液的回归方程式为F＝232.85+802.19log10 N，其中F为524nm处的荧光强度，N为细胞数。检测极限可达到单个细胞，证明了所提出的检测细胞提取物中内源性hAAG的方法的高准确性。

Claims (9)

1.一种检测DNA糖苷酶的发夹探针，其特征在于，所述发夹探针为茎-环结构，发夹探针的茎区为T7启动子序列，且起始位点GGG左边的第三个碱基A被脱氧肌苷碱基I取代；所述发夹探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种检测DNA糖苷酶的生物传感器，其特征在于，所述传感器包括权利要求1所述的发夹探针、人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶、脱氧核糖核苷酸预混液、核糖核苷酸预混液、KF聚合酶、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、CRISPR-Cas12a反应溶液；所述发夹探针的环区的DNA序列与crRNA互补，作为切割后转录扩增合成crRNA的模板；所述crRNA的氨基酸序列如SEQID NO.2所示；
所述CRISPR-Cas12a反应溶液包括双链激活DNA、报告探针和Cas12a蛋白；所述双链激活DNA由TS部分和NTS部分组成，所述TS部分与crRNA互补。
3.根据权利要求2所述的一种检测DNA糖苷酶的生物传感器，其特征在于，所述报告探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求2所述的一种检测DNA糖苷酶的生物传感器，其特征在于，所述报告探针标记有荧光基团和淬灭基团。
5.一种用权利要求2～4任一项所述的生物传感器检测DNA糖苷酶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将发夹探针、人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶和不同浓度的DNA糖苷酶hAAG标准样品或含有hAAG的待测样品混合，进行常规温度恒温孵育得到产物；
所述发夹探针为茎-环结构，发夹探针的茎区为T7启动子序列，且起始位点GGG左边的第三个碱基A被脱氧肌苷碱基I取代；所述发夹探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述发夹探针的环区的DNA序列与crRNA互补，作为切割后转录扩增合成crRNA的模板；所述crRNA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)将步骤(1)得到的产物与脱氧核糖核苷酸预混液、核糖核苷酸预混液、KF聚合酶、RNA酶抑制剂和T7 RNA聚合酶混合，常规温度恒温孵育后通过高温孵育终止反应得到产物；
(3)将步骤(2)得到的产物与CRISPR-Cas12a反应溶液混合，常规温度恒温孵育后，进行荧光检测，根据得到的不同浓度的hAAG标准样的荧光值绘制标准曲线，将含有hAAG的待测样的FAM荧光值代入标准曲线，即得DNA糖苷酶hAAG的浓度；所述CRISPR-Cas12a反应溶液包括双链激活DNA、报告探针和Cas12a蛋白；所述双链激活DNA由TS部分和NTS部分组成，所述TS部分与crRNA互补；报告探针标记有荧光基团和淬灭基团。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述发夹探针浓度为0.5-100nM；所述DNA糖苷酶hAAG标准样品中的hAAG浓度为1.0×10-10-1.0×10-2U/μL。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的KF聚合酶用量为0.5-20U；T7 RNA聚合酶用量为5-25U；步骤(2)还包括NEBuffer 2和RNAPol反应缓冲液。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的Cas12a蛋白浓度为0.08-3.2μM；报告探针的浓度为0.032-0.32μM。
9.一种权权利要求1所述的发夹探针、权利要求2～4任一项所述的生物传感器以及权利要求5-8任一项所述的检测方法在筛选hAAG抑制剂/激活剂中的应用。
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